牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原特有的，能够充分利用高寒高山草原进行动物性生产的优势牛种[1]。在屠宰过程中，会产生大量副产物，其中脏器约占活体体重的9.1%，牛胃占活体体质量的3%，而瘤胃占活体体重2%左右[2]，产量较大。根据《中国食物》统计显示，牛胃中含有蛋白质、脂肪等营养元素[3-4]，还具有补虚、益脾胃等作用，营养价值较高[5]。同时牛胃又是我国一种风味独特、爽脆可口，有嚼劲的传统食材。因此，牦牛瘤胃作为一种营养丰富的宜消费者食用的高产原料，已经广泛应用在肉品加工业中。
在肉制品熟化过程中，热加工是一道必不可少的步骤。热加工一方面能够促进蛋白质变性，改善食品品质，提高食品的消化率[6-7]；同时还可以杀灭或抑制食品中的微生物，确保食品的食用安全，提高食品货架期[8-9]。适宜的热加工可以赋予产品良好的风味、色泽和质地，然而过度的热加工会使产品营养成分流失、外观形体变形、肉质颜色变暗或发白，降低产品品质。目前，国内外针对热加工对其肉制品的影响的研究较多，MARAPANA[10]研究发现温度对肌原纤维蛋白的变性受到样品中其他成分的影响。LAAKKONEN[11]综述认为加热使肌浆蛋白凝聚，肌浆蛋白变为不可溶性蛋白。姜启兴[12]发现了鳙鱼肉不同热加工条件下，盐溶性、水溶性蛋白含量下降趋势，不溶性蛋白呈现上升的趋势。宋萃[13]发现热加工的条件参数严格控制，能使最终产品获得最佳的食用品质、理想的销售质量和较好的贮藏性能。目前针对副产物—牛胃已展开研究，ZARKADAS等[14]通过测定氨基酸的含量，进而分析出牛胃中肌原纤维蛋白约占总蛋白35.3%， 同时牛胃黏膜肌层含有较多的胶原纤维和弹性纤维，二者分别占牛胃总蛋白的20.1%、1.0%。高菲菲[15]研究了牛胃提取平滑肌蛋白过程中温度因素对其加工特性的影响，发现了温度升高，蛋白提取率、起泡性和乳化特性都迅速增大，在60～80 ℃开始趋于平衡状态，之后有所下降，整个温度范围内泡沫稳定性持续下降，综上所述，加热条件影响主要蛋白含量及其功能特性，但针对热加工过程中引起主要蛋白含量的变化，进而影响其功能特性，从而影响其食用品质，而目前针对此研究尚未见报道。
因此，本试验以牦牛瘤胃为研究对象，其中瘤胃的内面(黏膜面)在和外表的沟相对应的位置有由肌纤维构成的柱状隆起称肉柱[16]，其肉柱行业俗称“肚领”，因其结构与其他部分差异较大。通过肉眼可将牦牛瘤胃分为肚领与非肚领，并以热加工为出发点，研究不同加热条件下(加热温度、加热时间)对主要蛋白含量(不溶性、水溶性、盐溶性蛋白含量)与蛋白质功能特性(溶解度、乳化特性、起泡特性和浊度)的影响，从而确定正确的热加工工艺，如烹饪或蒸煮条件、杀菌工艺等提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
新鲜牦牛瘤胃，采于甘肃省甘南藏族自治州合作市，选取屠宰后采集符合GB—18393中《牛羊屠宰产品品质检验规程》[17]检验合格的牦牛瘤胃，清洗干净后，淋干，于-18 ℃冻藏，备用。
三氯醋酸(分析纯)，德州市富凯化工有限公司；NaCl(分析纯)，上海国药试剂集团；KCl(分析纯)，上海国药试剂集团。
1.2 试验设备
ATN-300型凯式定氮仪，上海仪器设备有限公司；XHF-D型高速分散器，无锡沃信仪器制造有限公司；PHS-3C酸度计，上海宁隆仪器有限公司；85-2恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司。
1.3 方法
根据组织结构的差异，通过肉眼可将其分为肚领与非肚领。
参考姜启兴[12]的方法，略作修改，取切成约3 cm×2 cm×1 cm的样品，均放入恒温水浴锅中，将样品加热，使用温度计测定其样品的中心温度，直至样品的中心温度分别达到20、40、60、80、92 ℃，将样品在沸水中加热，加热时间为0、20、30、55、80、105 min，然后均将样品取出，用流动水冷却至室温，每个温度及时间测定3个平行样。
1.4 牦牛瘤胃测定指标
1.4.1 牦牛瘤胃主要蛋白质含量测定
参考VISESSANGUAN[18]和唐小艳[19]的方法。称取3.00 g样品，加入提取液A(15.6 mmol/L磷酸氢二钠，3.5 mmol/L磷酸二氢钾，pH 7.5)，均质后离心，合并上清液，然后加入50%的三氯醋酸溶液，然后再离心，沉淀为水溶性蛋白。在初次得到的沉淀中加入10倍体积提取液B(0.45 mol/L KCl，15.6 mmol/L磷酸氢二钠，3.5 mmol/L磷酸二氢钾，pH 7.5)均质分散，将均质液离心，上清液合并，即得到盐溶性蛋白，沉淀为不溶性蛋白。按照GB5009.5—2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定中自动凯氏定氮仪法测定蛋白质含量[20]。
1.4.2 牦牛瘤胃蛋白质功能特性测定
1.4.2.1 蛋白提取方法
参照YOUNG等[21]的方法，略作改动。分别取100 g样品，加入300 mL 0.6 mol/L NaCl溶剂分散，然后调节pH至11，在组织捣碎机中以8 000 r/min速度间歇匀浆2 min，然后将匀浆液在恒温环境中连续揽动2 h后，在1 000×g速度下离心15 min，过滤，得上清液，备用。蛋白质含量的测定采用双缩脲法进行测定。
1.4.2.2 功能特性测定
(1)溶解度
参考牛克兰[22]、李婉竹[23]的方法，准确称取蛋白1 g，溶解在18 mL 0.6 mol/L KCl中，混合匀浆30 s，匀浆液搅拌4 h(在室温下)，然后4 ℃，8 500×g冷冻离心15 min，取离心上清液10 mL用双缩脲法测定上清液中的蛋白质含量，蛋白质的溶解度用溶解性(PS)来表示，公式如式(1)：
(1)
(2)乳化特性
参照的PEARCE和KINSELLA[24]的方法，分别将蛋白匀浆液和大豆油按3∶1(体积比)混合，然后在高速分散器中剪切乳化1 min。分别在乳化0 min和10 min 时吸取200 μL至试管中，用0.1%SDS稀释到10 mL，将0.1%SDS作为空白组，在500 nm下测定吸光值，分别记作A0、A10。EA(乳化活性)和ES(乳化稳定性)计算方法如式(2)和式(3)：
EA=A0
(2)
(3)
式中：△t表示时间间隔，10 min。
(3)起泡特性
参照IVANDER等[25]的方法。室温(25 ℃)条件下，将一定浓度的蛋白匀浆液pH调至7.0，取100 mL置于量筒中，在高速分散器中以15 000 r/min的转速间歇搅打2 min(分3次)，记录均质后的液面高度，记为V0，静置30 min后再次记录液面髙度，记为V30。FC(起泡能力)和FS(泡沫稳定性)计算公式如式(4)和式(5)：
(4)
(5)
(4)浊度
参照BENJAKKUL等[26]的方法测定。取蛋白浓度为1 mg/mL的溶液5 mL，分别在80 ℃的水浴锅中加热30 min，冷却后在600 nm处测定吸光值。以不加蛋白的空白溶液为对照。
1.5 数据统计分析
试验数据用Excel 2007软件进行数据处理，用SPSS Statistics软件，采用Duncan式多重比较进行差异显著性检验，采用Origin 8软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 牦牛瘤胃不同加热条件下主要蛋白含量
牦牛瘤胃肚领与非肚领不同加热条件下，水溶性、盐溶性和不溶性蛋白含量变化如图1～图4所示。
图1 牦牛瘤胃肚领不同加热温度下主要蛋白含量
Fig.1 The main protein contents in different heating temperatures of calf collar
注：同行肩标小写字母不同表示不同温度下组内差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，下同。
图2 牦牛瘤胃非肚领不同加热温度下主要蛋白含量
Fig.2 The main protein content of ruminal non-bellied collar at different heating temperatures
图3 牦牛瘤胃肚领不同加热时间主要蛋白含量
Fig.3 The main protein content of different heating time in calf neck collar
图4 牦牛瘤胃非肚领不同加热时间主要蛋白含量
Fig.4 The main protein content of different heating time in non-bellied collar of calf’s rumen
随着温度的升高及加热时间的延长，牦牛瘤胃不溶性蛋白含量均呈现上升的趋势，但其水溶性蛋白和盐溶性蛋白呈现先下降后几乎保持不变的趋势。其中牦牛瘤胃肚领原料肉的不溶性蛋白含量为1.37 g/100 g左右、水溶性蛋白含量为4.9 g/100 g左右、盐溶性蛋白含量为6.24 g/100 g左右，非肚领原料肉的不溶性蛋白含量是2.73 g/100 g左右、水溶性蛋白含量为4.96 g/100 g左右、盐溶性蛋白含量为3.52 g/100 g左右，了解其原料肉的主要蛋白含量，同时可以看出其牦牛瘤胃肚领与非肚领的主要蛋白含量差异，二者的差异主要是肚领较非肚领的盐溶性蛋白含量高，其不溶性蛋白含量低。
在加热温度为0～92 ℃及加热时间为0～105 min时，牦牛瘤胃肚领不溶性蛋白含量增加了10 g/100 g左右，其中不溶性蛋白含有较多的胶原蛋白，胶原蛋白在体内起着支撑和连接的作用[27]，而加热温度的变化会影响胶原蛋白的溶解度，进而影响产品的质构和保水性能[28]。水溶性蛋白降低了3 g/100 g左右，但其盐溶性蛋白含量降低了4.2 g/100 g左右，但其非肚领不溶性蛋白含量增加了11 g/100 g左右，其水溶性蛋白含量降低了3 g/100 g左右，盐溶性蛋白降低了1.5 g/100 g左右，且牦牛瘤胃肚领的水溶性蛋白含量和盐溶性蛋白均显著高于非肚领(P<0.05)，非肚领不溶性蛋白含量高于肚领，这可能是因为水溶性蛋白主要是肌浆蛋白，而盐溶性蛋白主要是由肌原纤维蛋白组成，随着加热温度的升高和加热时间的延长，可能是蛋白变性失活，从而其含量下降。ZARKADAS等[14]研究发现牛胃中肌原纤维蛋白约占总蛋白35.3%，同时牛胃黏膜肌层含有较多的胶原纤维和弹性纤维，二者分别占牛胃总蛋白的20.1%、1.0%，这与本研究结果相一致。
2.2 牦牛瘤胃不同加热条件下蛋白质功能特性研究
2.2.1 不同加热条件下牦牛瘤胃溶解度分析
在不同加热条件下，牦牛瘤胃蛋白质的溶解度变化如图5、图6所示。
图5 牦牛瘤胃不同加热温度下蛋白质溶解度
Fig.5 The protein solubility of ruminal calf at different heating temperatures
注：同行肩标小写字母和大写字母不同表示不同温度下组内差异显著(P<0.05)，*不同表示组间差异显著(P<0.05)，下同。
图6 牦牛瘤胃不同加热时间下蛋白质溶解度
Fig.6 The protein solubility of ruminal cow under different heating time
由图5、图6可知，随着加热温度的升高和加热时间的延长，牦牛瘤胃蛋白质溶解度呈现先上升后下降的趋势。在加热温度0～80 ℃和加热时间为0～80 min，肚领的溶解度增加了0.8%左右，非肚领增加了0.45%左右。在加热温度80 ℃和加热时间80 min时溶解度达到最大，在此之后溶解度下降，其肚领蛋白质溶解度下降了0.1%左右，非肚领下降了0.3%左右，且肚领的溶解度显著大于非肚领(P<0.05)，这可能是由于蛋白质的分子构象轻微改变，有利于蛋白质和水分子的相互作用，当环境温度高于蛋白质的变性温度时，原来在分子内部的一些非极性基团暴露到分子表面，因而蛋白质的溶解度降低[29]。因此，在加热温度80 ℃和加热时间80 min时效果最佳。
2.2.2 不同加热条件下牦牛瘤胃蛋白质乳化特性分析
在不同加热条件下，牦牛瘤胃蛋白质的乳化活性和乳化稳定性的变化如图7、图8所示。
图7 牦牛瘤胃不同加热温度下蛋白质乳化特性
Fig.7 Protein emulsification characteristics in different rumen heating temperatures
图8 牦牛瘤胃不同加热时间下蛋白质乳化特性
Fig.8 Protein emulsification characteristics in different stages of heating in rumen of yak
由图7、图8可知，牦牛瘤胃蛋白质乳化能力和乳化稳定性均呈现一个先上升后下降的趋势，经过加热处理后其乳化能力和乳化稳定性均呈现上升的趋势，在加热温度为0～80 ℃及加热时间为0～80 min时达到最大，肚领的乳化活性增加了0.05左右，乳化稳定性增加了2左右，非肚领乳化活性增加了0.07左右，乳化稳定性增加了2.5左右，但在加热温度80～92 ℃ 和加热时间80～105 min时，牦牛瘤胃肚领乳化活性降低了0.02左右，乳化稳定性降低了3.2左 右，非肚领乳化活性降低了0.09左右，乳化稳定性降低了1.5左右。且牦牛瘤胃肚领乳化能力显著小于非肚领(P<0.05)，但其肚领乳化稳定性显著高于非肚领(P<0.05)。并且均在加热温度为80 ℃和加热时间为80 min时达到最大，显著高于其他加热温度和加热时间(P<0.05)。因此，在加热温度80 ℃ 和加热时间80 min时效果最佳。
高菲菲[15]研究发现温度升高，牛瘤胃乳化特性都迅速增大，在60～80 ℃开始趋于平衡状态，之后有所下降，这结果与我们相一致。根据闫海鹏[28]研究发现：在提取蛋白质的蛋白浓度相同时，蛋白质的乳化能力越大，表明乳化的油量越多。而乳化稳定性越高，产品的质量越好，货架期越长。由此可知，非肚领乳化的油量多，节约成本，但非肚领的产品质量好，货架期长。
2.2.3 不同加热条件下牦牛瘤胃起泡特性分析
在不同加热条件下，牦牛瘤胃蛋白质的起泡能力和泡沫稳定性的变化如图9、图10所示。
图9 牦牛瘤胃不同加热温度下蛋白质起泡特性
Fig.9 Protein foaming behavior of yak rumen at different heating temperatures
图10 牦牛瘤胃不同加热时间下蛋白质起泡特性
Fig.10 Protein foaming behavior of the yak rumen at different heating times
在不同加热温度和加热时间下，牦牛瘤胃肚领、非肚领的起泡能力是一个先上升后下降的趋势，但泡沫稳定性呈下降趋势。在加热温度为0～60 ℃及加热时间为0～55 min时，肚领起泡能力增加了4%左右，非肚领起泡能力增加了6%左右，在加热温度为60～80 ℃和加热时间为55～105 min时，肚领降低了30%左右，非肚领起泡能力降低了7%左右，其中牦牛瘤胃在加热温度为60 ℃和加热时间为55 min时起泡能力达到最大，其中肚领和非肚领的起泡能力均在温度为60与80 ℃差异不显著(P>0.05)，肚领与非肚领在60 ℃和80 ℃显著高于其他温度(P<0.05)。非肚领起泡能力在55～80 min差异不显著(P>0.05)， 肚领与非肚领在55 min和80 min显著高于其他时间(P<0.05)，肚领起泡能力55 min与30 min差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他时间(P<0.05)。 但牦牛瘤胃肚领与非肚领的泡沫稳定性在0 ℃ 及0 min时达到最大，显著高于其他时间(P<0.05)，这可能是由于高温使得空气膨胀、薄膜的黏度降低，从而导致气泡破裂和泡沫解体，从而泡沫稳定性下降[30]，且牦牛瘤胃肚领起泡能力显著大于非肚领(P<0.05)，但肚领的泡沫稳定性显著小于非肚领(P<0.05)。这可能与非肚领蛋白泡沫大小、不溶性颗粒、表面电荷等相关[15]。因此，在加热温度80 ℃和加热时间和80 min时效果最佳。高菲菲[15]研究发现温度升高，起泡性都迅速增大，在60～80 ℃开始趋于平衡状态，之后有所下降，整个温度范围内泡沫稳定性持续下降，这结果与我们的研究结果相一致。
2.2.3 不同加热条件下牦牛瘤胃浊度分析
在不同加热条件下，牦牛瘤胃蛋白质的浊度变化如图11、图12所示。
图11 牦牛瘤胃不同加热温度下蛋白质浊度
Fig.11 Protein turbidity at different heating temperatures in the yak rumen
图12 牦牛瘤胃不同加热时间下蛋白质浊度
Fig.12 Protein haze at different heating times in the yak rumen
随着加热温度的升高及加热时间的延长，蛋白质浊度均呈现上升的趋势。在加热温度0～92 ℃和加热时间为0～105 min时，肚领增加了0.14左右，非肚领增加了0.12左右。在加热温度为92 ℃和加热时间为105 min时达到最大，显著高于其他温度和时间(P<0.05)，超过加热温度80 ℃和加热时间80 min 时，浊度的整体变化浮动较小，且牦牛瘤胃肚领的蛋白质浊度显著高于非肚领(P<0.05)。这可能是由于此时蛋白质发生变性、已基本完全变性、絮凝，细小的絮凝蛋白颗粒是造成浊度的主要原因[12]。因此，在加热温度80 ℃和加热时间80 min时效果最佳。姜启兴[12]研究发现，随着温度的升高，肌原纤维蛋白溶液浊度呈现上升的趋势，当温度达到50 ℃以上，特别是大于60 ℃时，浊度的基本处于一个相对较稳定的数据范围，但是各温度点和时间点之间波动较大。研究趋势与我们相一致。
3 结论
随着加热温度的升高和加热时间的延长，牦牛瘤胃水溶性和盐溶性蛋白含量均呈下降的趋势，但不溶性蛋白含量呈上升的趋势，乳化能力、乳化稳定性、起泡能力、溶解度均呈现一个先上升后下降的趋势，但是其起泡稳定性呈下降趋势，浊度呈上升的趋势，牦牛瘤胃肚领的水溶性、盐溶性蛋白含量及蛋白乳化稳定性、起泡能力、浊度和溶解度均显著高于非肚领(P<0.05)，不溶性蛋白含量、乳化能力和起泡稳定性显著低于非肚领(P<0.05)。其中两者的乳化能力和溶解度在加热温度为80 ℃和加热时间为80 min时达到最大，其起泡能力在60 ℃和55 min达到最大，但肚领和非肚领的起泡能力均在温度为60～80 ℃ 差异不显著(P>0.05)，且起泡能力55 min与80 min差异不大。由此可知，牦牛瘤胃在加热温度80 ℃和加热时间80 min是最适宜的，为后期研究其烹饪工艺条件提供理论参考，为牦牛瘤胃原料肉及其制品的开发及应用提供一定理论参考。
参考文献
[1] 郭宪,阎萍,梁春年,等.中国牦牛业发展现状及对策分析[J].中国牛业科学,2009,35(2):55-57.
[2] 郭兆斌,余群力.牛副产物-脏器的开发利用现状[J].肉类研究,2011,25(3):35-37.
[3] 孔祥荣.牛肚卤制品加工及储存品质变化研究[D].福州：福建农林大学,2016.
[4] 李凛,李璟,周世一,等.毛肚加工产业研究进展[J].广东农业科学,2011,38(22):103-106.
[5] 欧阳. 牛年话牛肴[J].健康世界,2009(1):90-91.
[6] YILDIZTURP G,SENGUN I Y,KENDIRCI P,et al.Effect of ohmic treatment on quality characteristic of meat: A review[J].Meat Science,2013,93(3):441-448.
[7] TORNBERG E.Effects of heat on meat proteins-Implications on structure and quality of meat products[J].Meat Science,2005,70(3):493-508.
[8] 向聪.肉类保藏技术(二) 肉制品的加热处理[J].肉类研究,2008(10):82-85.
[9] 邓丽,李岩,董秀萍,等.热加工过程中鲍鱼腹足蛋白间作用力及其质构特性[J].农业工程学报,2014,30(18):307-316.
[10] MARAPANA R A U J MTGase对促进猪后腿肌原纤维蛋白交联和猪肉糜胶凝性质的影响[D].无锡：江南大学,2006.
[11] LAAKKONEN E.Factors affecting tenderness during heating of meat[J].Advances in Food Research,1973,20:257-323.
[12] 姜启兴.鳙鱼肉热加工特性及其机理研究[D].无锡：江南大学,2015.
[13] 宋萃.四川白兔肉及其肌原纤维蛋白热加工特性研究[D].重庆：西南大学,2017.
[14] ZARKADAS G C,AND C D K,ZARKADAS C G.Assessing the myofibrillar and connective tissue protein contents and protein quality of beef tripe[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,1996,44(9):2 563-2 572.
[15] 高菲菲.牛胃平滑肌加工特性研究[D].南京：南京农业大学,2012.
[16] 李宝仁. 牛胃的构造和反芻过程[J].生物学通报,1962(3):18-20.
[17] 国家质量监督检验检疫总局.GB-18393—2001 牛羊屠宰产品品质检验规程[S].北京:中国标准出版社,2001.
[18] VISESSANGUAN W,BENJAKUL S,RIEBROY S,et al.Changes in composition and functional properties of proteins and their contributions to nham characteristics[J].Meat Science,2004,66(3):579-588.
[19] 唐小艳.文蛤贝肉蛋白组成及其凝胶特性研究[D].湛江：广东海洋大学,2016.
[20] 国家药品食品监督管理总局.GB5009.5—2016 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].北京:中国标准出版社,2016.
[21] YOUNG R H,LAWRIE R A.Utilization of edible protein from meat industry by-products and waste[J].International Journal of Food Science & Technology,2010,9(2):171-177.
[22] 牛克兰.冷鲜牦牛肉保水性及其蛋白功能特性研究[D].兰州：甘肃农业大学,2017.
[23] 李婉竹,梁琪,张炎,等.不同冻融次数下牦牛肉蛋白质氧化与保水性的关系[J].食品科学,2018,39(2):14-19.
[24] PEARCE K N,KINSELLA J E.Emulsifying properties of proteins:Evaluation of a turbidimetric technique[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,1978,26(3):716-723.
[25] IVANDER P,AVAN L,HENDRICKX M E.Foaming properties of egg white proteins affected by heat or high pressure treatment[J].Journal of Food Engineering,2007,78(4):1 410-1 426.
[26] BENJAKUL S,VISESSANGUAN W,ISHIZAKI S,et al.Differences in gelation characteristics of natural actomyosin from two species of bigeye snapper,priacanthus tayenus and priacanthus macracanthus[J].Journal of Food Science,2010,66(9):1 311-1 318.
[27] LEPETIT J.A theoretical approach of the relationships between collagen content,collagen cross-links and meat tenderness[J].Meat Science,2007,76(1):147-159.
[28] 闫海鹏.不同种类肉肌原纤维蛋白功能特性的研究[D].南京：南京农业大学,2013.
[29] 李蕙蕙.鸡肉火腿肠加工过程中功能特性和蛋白质结构的初步研究[D].武汉：华中农业大学,2009.
[30] SMYTH A B,SMITH D M,VEGA-WARNER V,et al.Thermal denaturation and aggregation of chicken breast muscle myosin and subfragments[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,1996,44(4):1 005-1 010.