柑橘是世界第一大类水果，全世界范围内柑橘产业栽培品种结构逐渐趋于合理化，鲜果渐成消费主流，调查数据显示宽皮柑橘94.3%用于鲜食[1]。应对鲜销首要的策略就是降低损耗，延长贮藏时间，以提高利润。柑橘采摘后特别容易受到霉菌的侵染，导致柑橘的腐烂，造成巨大的经济损失，甚至影响到相关产业链的健康发展[2]。化学防治的危害[3-4]众所周知，物理防治措施往往需要一定的设备投入，生物防治效果又受环境限制[5-6]。有研究结果表明，植物源抑菌活性物质不仅能有效抑菌、增强活体防护效果，并且能够诱导果实的抗病性[7]。
肉桂醛(cinnamaldehyde)是一种从肉桂等植物当中提取的具有抑菌功能的醛类有机化合物。对草莓、番茄、油桃、香菇等多种果蔬均具有显著的防腐保鲜效果[8]。王德德等[9]证实纳米化后的肉桂醛对辣椒疫霉病原菌的抑菌能力提高了50%～100%。JO等[10]以吐温20作为乳化剂制备出粒径<200 nm肉桂醛微乳，对甜瓜汁有一定的保鲜作用。课题组前期工作证实肉桂醛能有效增强赣南脐橙和新余蜜桔对青霉病害的防护效果以及诱导果实对柑橘青霉的抗病性[11-12]。说明肉桂醛具有良好的开发植物源柑橘保鲜剂的潜力。
鉴于肉桂醛难溶于水、熔点低、沸点高、易氧化、易挥发的特性[13]，综合评估肉桂的特性及目前对果蔬保鲜剂水基化、缓释化、省力化的需求方向[14-15]，拟将植物源有效抑菌成分肉桂醛制备成水乳剂，综合评估其稳定性和抑菌活性，优选出后续肉桂醛柑橘保鲜剂的基础配方。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 指示菌
柑橘青霉病原菌：指状青霉(Penicillium digitatum)，购自中国农业微生物菌种保藏中心，保存于江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，用做抑菌试验指示菌。
1.1.2 培养基及主要试剂
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，琼脂20 g，pH自然，121 ℃灭菌20 min。作指示菌的活化、培养及抑菌试验用。
肉桂醛(≥95%GC)；乳化剂：司盘20(S20)、司盘80(S80)、吐温60(T60)、吐温80(T80)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.3 主要仪器
LDZX-40B自动立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SHP-160型生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；HH-6数显恒温循环水浴锅，国华电器有限公司；Vortex-Genie2漩涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司；HC-2518R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；BK5000数码生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司。
1.2 试验方法
1.2.1 水乳剂的制备
一种失水山梨糖醇酐酯(S20、S80)分别与一种聚氧乙烯失水山梨醇酐酯(T60、T80)配制成HLB值在9.0～14.5的复合乳化剂。采用乳化剂在水中法制备肉桂醛水乳剂，固定体系总量及油相(质量分数为10%的肉桂醛)用量，改变复合乳化剂的用量(质量分数分别为8%、6%和4%)，以旋涡混合器8档4 min 输入能量。试验重复3次。
乳化剂的HLB值参考文献[16]，S80、S20、T60、T80的HLB值分别为4.3、8.6、14.6、15.0，复合乳化剂HLB值计算公式为：
(1)
式中：w1和w2分别为2种乳化剂的质量分数，%；HLB为相应乳化剂的亲水亲油平衡值；HLB1和HLB2分别为2种乳化剂的亲水亲油平衡值。
1.2.2 肉桂醛水乳剂稳定性的测定
离心稳定性，参考邵明辉[17]法，稍作改动。制备水乳剂分装于10 mL离心管中，经10 000 r/min，4 ℃离心10 min，若水乳剂仍保持均匀乳白色则离心稳定性合格；有析油、沉淀或分层情况则不合格。
低温稳定性试验[18-19]，制备水乳剂分装于10 mL 离心管中，(4±1) ℃冰箱中保存7 d，若低温出现析油、沉淀或分层情况，置于室温，这些现象逐渐消失，或者经过适当振摇可以恢复原来乳状液的情况，则低温稳定性合格，否则为不合格。
高温稳定性试验[18-20]，制备水乳剂分装于10 mL 离心管中，(54±1) ℃恒温箱中，贮存14 d，外观保持均匀，若出现分层，室温振摇后可以恢复原状即为高温稳定性合格；否则为不合格。
稀释稳定性试验[18]，将1 mL肉桂醛水乳剂，用标准硬水稀释20倍，搅拌均匀，静置1 h，观察现象，并记录。无沉淀和浮油为合格。
1.2.3 肉桂醛水乳剂贮藏性测评
制备好的水乳剂于37 ℃恒温箱中保存14 d，观察析油情况、黄层高度及色泽，记录实验现象。参考华乃震关于水乳剂应符合的基本性质[22]描述，拟定评判肉桂醛水乳剂经时稳定性的表观评定指标，应用加权评分法对不同水乳剂评分，满分为100分，评分标准见表1。
表1 肉桂醛水乳剂的表观评分标准
Table 1 Rating criteria of emulsion in water of cinnamaldehyde
1.2.4 肉桂醛水乳剂分散性测定
于100 mL量筒中装入99.5 mL标准硬水，用注射器吸0.5 mL待测水乳剂样品，从距量筒水面5 cm处滴入水中，观察其分散状况，按其分散性能的好坏分为优、良、劣三级。
优级：在水中呈云雾状自动分散，无可见颗粒下沉。
良级：在水中能自动分散，有颗粒下沉，下沉颗粒可慢慢分散或经轻微摇动后分散。
劣级：在水中不能自动分散，有颗粒呈絮状下沉，经强烈摇动后才能分散。
1.2.5 肉桂醛水乳剂形态
将制备好的水乳剂用水溶性染料美蓝染色，光学显微镜下观察，并测定油滴的粒径大小。
1.2.6 肉桂醛水乳剂抑菌效果测定
取0.2 mL指示菌孢子悬液，均匀涂布于PDA培养基表面，杯碟法检测不同肉桂醛水乳剂的抑菌效果。(28±1) ℃，培养48 h，十字交叉法测量抑菌圈，取平均值做抑菌圈直径。试验重复3次。
1.2.7 肉桂醛水乳剂最小抑菌浓度
以复合乳化剂为稀释剂，二倍稀释法[23]将水乳剂稀释为肉桂醛浓度分别为1 000、500、250、125、62.5 μg/g。采用杯碟法检测不同浓度肉桂醛水乳剂的抑菌效果。以肉桂醛浓度从低到高首次出现抑菌圈的浓度为最小抑菌浓度。试验重复3次。
1.2.8 数据分析
所有水乳剂制备试验和抑菌试验均重复3次，试验结果以平均值±标准偏差的形式给出。采用Excel 2010对肉桂醛水乳剂贮藏性评分值做图，IBM SPSS 20对不同肉桂醛水乳剂表观评分值及抑菌圈大小进行方差分析及多重比较。
2 结果与分析
2.1 肉桂醛水乳剂稳定性试验结果
肉桂醛水乳剂稳定性试验结果见表2和表3。
表2 司盘20-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂稳定性试验结果
Table 2 The stability test results of emulsion in water from Span20-Tween60/Tween80- cinnamaldehyde
表3 司盘80-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂稳定性试验结果
Table 3 The stability test results of emulsion in water from Span80-Tween60/Tween80-cinnamaldehyde
复合乳化剂HLB值在9.0～14.5，司盘20-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂与司盘80-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂的低温和稀释稳定性均合格，能够保持均匀一致的乳白色乳状液。离心稳定性以司盘80-吐温80-肉桂醛水乳剂合格率最高为100%，其他3个组(司盘20-吐温60-肉桂醛、司盘20-吐温80-肉桂醛和司盘80-吐温60-肉桂醛)中复合乳化剂用量为8%时，经10 000 r/min，4 ℃离心10 min，会出现浮油或者白色沉淀，不能保持白色均匀水乳剂状态。
制备好的水乳剂经(54±1) ℃恒温箱中，贮存14 d后，大部分出现析油和白色沉淀情况；仅复合乳化剂用量为4%的司盘20-吐温60(HLB值为11.2和12.3)和司盘80-吐温60(HLB值为别为9.0、10.1、11.2和12.3)6个处理的肉桂醛水乳剂高温稳定性测定指标为合格；其他组中复合乳化剂用量为4%的处理，也只有少量析油。
2.2 肉桂醛水乳剂贮藏性测评结果
按照表1评分标准对37 ℃恒温箱中保存14 d的司盘20-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂表观特征进行评分，结果见图1。
图1 司盘20-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂评分值
Fig.1 The rating value of emulsion in water from Span20-Tween60/Tween80-cinnamaldehyde
除乳化剂用量为8%的司盘20-吐温60-肉桂醛组在HLB 10.1时出现了最大评分值(83.0分)外，其他处理组随HLB值增加，表观评分值均呈逐渐上升趋势；至HLB值分别为13.4和14.5时，12个处理的评分值均≥80.0分，均可保持较稳定的均匀乳白色水乳剂，或有少量黄色细小油滴，其中最高评分为乳化剂用量6%，HLB值为14.5的司盘20-吐温80-肉桂醛水乳剂，评分值为87.0分。另外，HLB值为12.3，乳化剂用量为6%的司盘20-吐温60-肉桂醛处理也能形成较稳定的乳白色水乳剂。
同样，按照表1评分标准对37 ℃恒温箱中保存14 d的司盘80-吐温60/吐温80-肉桂醛制备水乳剂表观特征进行评分，结果见图2。
图2 司盘80-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳评分值
Fig.2 The rating value of emulsion in water from Span80-Tween60/Tween80- cinnamaldehyde
乳化剂用量为4%的2个组在HLB值9.0～14.5均不能保持均匀水乳剂状态。乳化剂用量为6%和8%的司盘80-吐温60-肉桂醛组中，均在HLB值为10.1、11.2和12.3时，保持均匀乳白色水乳剂，最高表观评分值均出现在HLB值11.2，分别为93.0分和91.7分。乳化剂用量为6%和8%的司盘80-吐温80-肉桂醛组中，HLB值9.0时，均不能保持均匀水乳剂状态；乳化剂用量8%，HLB值14.5时，司盘80-吐温80-肉桂醛也不能保持均匀水乳剂状态；其余9个处理均为均匀乳白色水乳剂，有4个处理的评分在90.0分以上。乳化剂用量为6%和8%的司盘80-吐温80-肉桂醛组中，最高分均出现在HLB值12.3，都是93.0分。
表观评分值90分以上的水乳剂具备非常好的分散性。水乳剂滴入水中后呈云雾状分散，形成乳状液，分散过程中无可见颗粒，分散均匀且较为迅速，评价等级为优，见图3。用水溶性美蓝染料对水乳剂进行染色[17]，光学显微镜下可见蓝色的背景和无色的油滴，油滴粒径多数分布在2 μm左右，符合稳定水乳剂的基本特征[22]。
图3 肉桂醛水乳剂分散试验现象
Fig.3 The appearance of dispersion test of Cinnamaldehyde water emulsion
司盘20-吐温60/吐温80-肉桂醛制备水乳剂组和司盘80-吐温60/吐温80-肉桂醛制备水乳剂组中共29个处理能形成均匀乳白色水乳剂，对其表观评分进行统计分析(表4)，表观评分间存在极显著差异(P<0.01)。按形成水乳剂的较高评分值，从司盘20-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂组和司盘80-吐温60/吐温80-肉桂醛水乳剂组各优选出4个处理，共计8个处理的水乳剂用来开展后续柑橘青霉病原菌的抑菌试验。8个处理形成的水乳剂评分多重比较结果见表5。复合乳化剂为司盘80-吐温60/吐温80的4个处理形成的水乳剂表观评分值均高于乳化剂为司盘20-吐温60/吐温80的4个处理，且具有极显著差异。
表4 29个处理的评分值的方差分析结果
Table 4 Variance analysis of rating value for 29 treatments
表5 八个处理的评分值的多重比较结果
Table 5 Multiple comparisons of rating value for 8 treatments
注：采用Duncan法进行多重比较。同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著(P<0.01)，标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)。表6同。
2.3 肉桂醛水乳剂的抑菌试验结果
通过贮藏性评分筛选出8个稳定性较佳的水乳剂处理，如表6所示。
表6 八个处理的抑菌圈多重比较结果
Table 6 Multiple comparisons of inhibition zone of 8 treatments
对水乳剂做10倍梯度稀释，杯碟法抑制柑橘青霉病原菌试验表明，水乳剂稀释至肉桂醛有效含量为1 mg/g时，能够形成规则、稳定的抑菌圈。对抑菌圈大小进行方差分析，无显著差异，显著高于相同浓度肉桂醛对照组。肉桂醛水乳剂最小抑菌浓度均为250 μg/g，肉桂醛对照组的最小抑菌浓度为500 μg/g。
3 讨论
3.1 水乳剂稳定性
除司盘80-吐温80-肉桂醛组外，其他组中复合乳化剂用量为8%时，离心稳定性不合格，不能保持白色均匀水乳剂状态。可能与复合乳化剂成分、油相的密度均大于水相密度有关，在低能量输入，较多的复合乳化剂用量情况下导致体系离心后，出现析油或沉淀现象；而吐温80有更好的乳化性能，同时复合乳化剂中司盘80的HLB值(4.3)与吐温80的HLB值(15.0)差值较较大，结构相似[24-25]，因此，司盘80-吐温80-肉桂醛组形成水乳剂离心稳定性好。
高温稳定性试验，仅有6个处理(全部试验涉及72个处理)的司盘20/司盘80-吐温60-肉桂醛水乳剂高温稳定试验结果为合格，合格的处理中，复合乳化剂用量均为4%。其他组中复合乳化剂用量为4%的处理，也只有少量析油。说明高温(54 ℃)可进一步促进水乳剂的形成。关于高温对该组水乳剂的形成，有待于进一步研究。
3.2 较优肉桂醛水乳剂柑橘青霉抑菌活性
比较发现，司盘80-吐温60/吐温80-肉桂醛组中优选出的4个水乳剂贮藏性评分值显著高于司盘20-吐温60/吐温80-肉桂醛组中优选出的4个水乳剂经时评分值；而这8个处理形成水乳剂的柑橘青霉抑菌圈直径无显著差异，但都显著高于相同用量的肉桂醛。8个水乳剂的最小抑菌浓度均为250 μg/g，肉桂醛的最小抑菌浓度为500 μg/g，说明水乳剂配方中的复合乳化剂有协同增强肉桂醛对柑橘青霉的抑菌效果。
4 结论
目前，柑橘采后商品化处理主要采用化学药剂做防腐保鲜，常用保鲜剂、杀菌剂有抑霉唑、咪鲜胺、双胍盐、噻菌灵等，面临病原微生物对化学药剂产生耐药性和化学防腐保鲜效果下降的问题；且果品药剂残留，对人体健康造成很大影响。柑橘产业迫切需求绿色环保柑橘保鲜剂的开发。水乳剂是将不溶于水的有效成分以水为介质，通过输入足够的能量(如高剪切乳化和高压均化等手段)并借助适当表面活性剂的作用，以微小液滴分散在水中，得到动力学上稳定，外观呈乳白色的水包油型乳状液剂型[26]。水乳剂以其水基化，表面活性剂用量小，少用或不用有机溶剂，而成为保鲜剂重点开发剂型。
试验以植物源活性抑菌物质肉桂醛为原料，低能量输入法，综合评估水乳剂稳定性、分散性、贮藏性及其对柑橘青霉的抑菌效果，获得了2个肉桂醛水乳保鲜剂的初级配方，即油相(肉桂醛)的质量分数为10%，复合乳化剂分别为6%的司盘80-吐温60(HLB值为11.2)和6%的司盘80-吐温80(HLB值为12.3)。在此基础上可开展后续肉桂醛保鲜剂配方优化工作。
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