雷竹(Phyllostachys praecox f. Prevernalis)是一种优质的食用笋竹种，其幼嫩茎为雷笋，又名早竹笋，含有粗蛋白、脂肪、纤维素等成分，营养丰富，有着产量高、出笋早的特点，作为竹笋的一种，雷笋也富含膳食纤维[1]。膳食纤维(dietary fiber,DF)被认为是人类的第七营养素，近几年的医学研究又证实了DF可以降低糖尿病，心血管疾病，结肠癌等的发病率[2]，这与DF良好的持水、持油、膨胀和吸附能力等有关[3]。研究发现，可溶性膳食纤维(SDF)相比不可溶膳食纤维(IDF)对胆固醇和血糖控制等功能具有更显著的效果[4]。
我国每年都有大量新鲜雷笋产出，除鲜食外，普遍以常规的罐头加工食品为主，缺乏精深加工，而且因为较低的原始SDF含量使得其功能价值尚未完全开发。为了提高SDF的比率，常使用化学、生物和物理方法对DF进行改性处理[5]。化学方法会带来潜在的食品安全问题；而物理方法(螺杆挤压、高压均质、高静水压等)则对设备和操作要求较高；生物法(酶解法和发酵法)因其操作简便快捷的特点，是该领域的未来发展方向[6]。因此，本文旨在通过纤维素酶和木聚糖酶联合处理改善雷笋DF的理化性质，并对其结构变化进行分析比较，为获得高SDF含量的雷笋膳食纤维和提高雷笋附加值提供有效途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜雷笋购自杭州市果蔬批发市场，经浙江省农科院食品科学研究所陆胜民研究员品种鉴定。耐热α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶均购自Sigma公司；纤维素酶(酶活力30 000 U/g)、木聚糖酶(酶活力30 000 U/g)，宁夏和氏璧生物技术有限公司；其他化学试剂属于分析级。
1.2 仪器与设备
FW200粉碎机，江苏省金坛市友联仪器研究所；CR10色差仪，日本柯尼卡美能达公司；SW23水浴摇床，德国优莱博公司；LXJ-IIB离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-1800紫外分光光度计，日本岛津公司；TM3000台式显微镜，日本日立公司；Nicolet iS5傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔公司；UItima IV型X射线衍射仪，日本理学公司。
1.3 实验方法
1.3.1 粗膳食纤维制备[7]
挑选无机械损伤，笋龄和外观一致的新鲜雷笋50 kg。去壳处理后，将其在60 ℃下干燥48 h并用研磨机粉碎，并过80目筛获得雷笋粉末。雷笋DF根据AOAC方法991.43制备，最后获得1.5 kg未处理的雷笋膳食纤维粉末。
1.3.2 改性膳食纤维制备
根据预实验结果，使用纤维素酶和木聚糖酶分步酶解对雷笋膳食纤维进行改性。取10 g雷笋膳食纤维粉末，加入50 mL 0.05 mol/L pH 6.8的PBS缓冲液，按添加量0.15%(质量分数)加入纤维素酶，混匀，置于50 ℃振荡水浴2 h，将pH调至4.8后加入0.15%的木聚糖酶，混匀，置于50 ℃振荡水浴3 h。酶解结束后沸水浴10 min灭活，加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜，抽滤，并烘干粉碎，得到酶改性后雷笋膳食纤维。
1.3.3 色泽测定
使用色差仪测量样品的色泽。颜色值表示为亮度/暗度(L*)，红色/绿色(a*)和黄色/蓝色(b*)。未处理雷笋膳食纤维用作计算总色差的参考。根据KIM等[8]的方法使用式(1)计算总色差：
ΔE=(ΔL2+Δa2+Δb2)1/2
(1)
1.3.4 持水力、持油力和膨胀力测定
根据文献[9-10]的方法测定持水力(g/g DF)，持油力(g/g DF)和膨胀力(mL/g DF)。
1.3.5 吸附能力测定
1.3.5.1 亚硝酸吸附能力
采用钟希琼等[11]的方法测定亚硝酸吸附能力(NIAC)，稍有改动。将1 g DF样品与25 mL NaNO2溶液(0.1 mol/L)混合，并将溶液的pH调节至2.0(模拟胃的pH环境)和7.0(模拟小肠的pH环境)。将混合物在水浴摇床中于37 ℃以120 r/min摇动30 min，然后用离心机以4 000 r/min离心20 min以沉淀DF，收集上清液用于以下分析。亚硝酸盐含量通过ZHU等[12]的方法测定。
1.3.5.2 胆固醇吸附能力
采用朱玉等[13]的方法对胆固醇吸附能力(CBC)进行了分析，并进行了一些修改。取新鲜的蛋黄，并用9倍体积的蒸馏水充分搅打成乳液。将1 g DF样品与25 g蛋黄乳液混合，并将体系的pH分别调节至2.0和7.0。将混合物在37 ℃振荡浴中以120 r/min摇动2 h，并以4 000 r/min离心20 min以沉淀DF，然
后收集上清液。使用蛋黄乳液作为空白对照，在550 nm的波长下测量吸光度。
1.3.6 扫描电镜(SEM)分析
通过SEM在15 kV下观察DF的表面和微结构。将DF样品用双面导电胶带装载在样品架上，并涂覆金层，然后进行电子显微镜观察和样品拍照。
1.3.7 傅里叶红外光谱(FT-IR)分析
用FT-IR光谱仪测量DF分子结构的变化。取干燥的样品(2mg)用KBr(100 mg，光谱级)研磨，压片制成透明薄片，并用空白KBr作为背景。扫描次数：20次，分辨率，4 cm-1，扫描范围：500～4 000 cm-1。
1.3.8 X-射线衍射(XRD)分析
利用步进扫描法。测定参数为：靶：Cu-Kα；步宽：0.02°；扫描速率：2°/min；扫描范围：2°～40°。结晶度[14]使用式(2)从曲线下的峰面积计算：
(2)
式中:Dc为结晶度; Ac为结晶区域; Aa为非晶区域。
1.3.9 数据处理
每组数据平行测定3次并表示为平均值±标准偏差。使用SPSS 19.0进行方差和显著性分析，利用Origin 2017软件绘图。
2 结果与讨论
2.1 酶改性对膳食纤维组成的影响
表1显示了酶改性前后DF的组成。与对照组的SDF含量(1.02±0.04)%相比，酶改性后显著提高了SDF含量，达到了对照组的6.67倍。TDF含量没有显著变化(P>0.05)，但是IDF含量与对照组相比显著降低，这是因为纤维素酶水解的纤维素和木聚糖酶水解的半纤维素都是IDF的重要组成部分，水解产生的寡糖和小分子糖则提高了SDF含量。WEN等[15]也有类似的结论：纤维素酶和木聚糖酶处理米糠膳食纤维后可增加SDF含量。此外，酶改性后水分含量增加但是灰分含量降低。
表1 酶改性膳食纤维的组成成分 单位：%
Table 1 The composition of dietary fiber with enzyme modification treatments
注：同列不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母则表示差异不显著(P> 0.05)。下同。
2.2 酶改性DF的色度
由表2可知，与未处理DF相比，酶改性处理后L*值，a*值和b*值均显著降低(P<0.05)，这可能是由于小分子糖促进干燥过程中的褐变反应导致的[16]。L*值降低，表示亮度降低，b*值为正且相对较高，说明在黄绿之间更倾向于黄色。在食品加工中，可根据所生产食品的色泽要求添加不同类型的DF产品，NAEEM等[17]在饼干中添加竹笋膳食纤维时，观察到了良好的感官接受度。
表2 酶改性膳食纤维的颜色和总色差
Table 2 Color parameters and total color differences of dietary fiber with enzyme modification treatments
2.3 酶改性DF的持水性、持油性和膨胀力
DF的持水量(WHC)，持油量(OHC)和膨胀能力(SC)的差异可能与粒径，孔隙率，电荷密度，比表面积和空间结构有关[18]。表3显示了酶处理后DF的WHC、OHC和SC均显著增加(P<0.05)。
表3 酶改性膳食纤维的理化性质
Table 3 physicochemical properties of dietary fiber with enzyme modification treatments
据推测，酶改性后DF的比表面积增加，DF的松散结构暴露出更多的极性和非极性基团，从而增强了WHC和OHC，YU等[19]在用酶改性胡萝卜果渣的不可溶性膳食纤维后得到了类似的结果。纤维素酶和木聚糖酶降解了一些IDF，使整个结构变得庞大并增加了SC，并且有研究表明SC与SDF的含量呈正相关[20]，因此SC增加也可能与SDF含量增加有关。
2.4 酶改性DF的吸附亚硝酸盐和胆固醇能力
一些流行病学研究表明，过量摄入亚硝酸盐被认为对人体健康有害，并可能增加患癌症的风险[21]。表4显示了酶改性前后DF的亚硝酸根离子吸收能力(NIAC)，酶改性后NIAC在模拟小肠和胃的pH下均显著增加(P< 0.05)。结果表明，酶改性后有助于防止过量亚硝酸盐引起的人体中毒。此外，发现NIAC在pH 2.0的条件下有更高的吸收能力，说明DF在胃中比在肠中能吸收更多的亚硝酸根离子。不同pH下NIAC之间的差异可能是由DF中的阿魏酸引起的[21]，酚酸基团对亚硝基有较强的吸附作用，但在小肠环境中，由于pH值的升高使得阿魏酸上的羧基发生解离，从而排斥NO2-，影响了吸附效果。
表4还显示了酶改性前后DF的胆固醇吸附容量(CAC)。酶改性后显著提高了雷笋DF的CAC(P < 0.05)，CAC分别提高了2.16倍(pH 7.0)和1.41倍(pH 2.0)。DF对胆固醇的吸附通常是化学和物理吸附的作用。最近的研究报道，SDF的CAC比IDF更高[22-23]，因此酶改性后CAC的增加可能与其SDF含量增加有关。此外，pH值是CAC的一个重要影响因素。在pH 7.0条件下，CAC的数值明显比pH 2.0下的更高，这可能是由于SDF中部分侧链基团在较高pH下发生了解离。
表4 酶处理膳食纤维亚硝酸根和胆固醇的体外吸收能力
Table 4 In vitro binding capacities to sodium nitrite and cholesterol of dietary fiber with enzyme modification treatments
2.5 扫描电镜分析
在图1中，显示了酶改性前后的膳食纤维的微观结构。观察到未处理膳食纤维的表面较为光滑，组织较致密，孔隙较少，呈束状结构。酶改性后，膳食纤维的表面更为疏松，形成了较多孔隙，呈现了更复杂的空间网络结构，这和王佳等[24]的研究一致，其使用纤维素酶和木聚糖酶的酶处理导致竹笋膳食纤维的表面变得蓬松且带有孔隙。膳食纤维的比表面积增大，会暴露出更多的亲水亲油基团，这导致了持水性、持油性和吸附能力的显著增加。
图1 雷笋DF未处理和酶改性的扫描电镜图
Fig.1 Scanning electronic micrographs(SEM) of DF treated by enzyme
2.6 红外光谱分析
酶解后DF显示出与未处理样品相似的光谱分布，但在相应波长下吸收强度略有变化。如图2所示，3 400 cm-1处的宽吸收峰是纤维素和半纤维素的O-H伸缩振动带。酶改性后3 400cm-1处呈现较弱的峰，可能是因为改性处理导致纤维素分子之间的氢键断裂[15]。2 925cm-1处的吸收峰是多糖亚甲基的C-H振动。在1 734 cm-1处观察到未处理膳食纤维的肩峰是半纤维素的特征吸收峰，酶改性后该峰消失，这说明木聚糖酶对半纤维素产生了分解作用。1 653 cm-1处的吸收峰是木质素中的芳香苯引起的，1 546 cm-1和1 247 cm-1处的吸收峰是木质素组分的特征性弯曲或拉伸[25]。在酶改性后，这些峰的强度均降低，表明一些木质素被降解。1 370 cm-1和1 060 cm-1处的谱带属于木质素和纤维素的共同带[26]。897 cm-1处的峰是糖单元中β-糖苷键的伸缩振动。
图2 雷笋DF未处理和酶改性的红外光谱图
Fig.2 FT-IR spectra of DF treated by enzyme
2.7 X射线衍射
根据文献，DF由有序结晶区(70%)和非晶(30%)组成。非晶区由无定形纤维素，半纤维素和木质素组成[27]。从图3可以看出，酶改性前后的X射线衍射图形在形状上相似，显示出典型的纤维素Ⅰ晶体构型。未处理DF在扫描角度2θ为20.10°有明显的结晶衍射峰，酶改性DF在扫描角度2θ为20.39°有明显的结晶衍射峰，同时在34.55°处有一个弱衍射峰。酶改性DF与未处理DF比较，结晶峰的2θ值相近，表明酶改性并没有使晶型发生改变。由Jade 5.0软件拟合后发现，酶改性后DF的结晶度(30.78%)低于未处理DF(33.72%)，CAO等[28]发现纤维素I的(002)晶面在酶水解过程中优先水解，并且半纤维素通常与纤维素相连，但其具有随机和无定形结构，容易被半纤维素酶水解，因此在纤维素酶初期的水解期间结晶度应该增加，然而结果与之相矛盾。这可能是因为随着酶解时间的增加，较多的内切葡聚糖酶使得结晶区表面纤维素的大分子断裂，并且在外切葡聚糖酶和纤维素二糖酶的协同作用下完全水解，导致结晶区减小；同时，结晶区某些部位分子链排列的无序性因为外切葡聚糖酶的水解作用而增加，使得无定形区增加，两方面的综合影响使得酶改性后DF的结晶度发生了降低。LE等[29]报道了纤维素酶处理木浆纤维后纤维素结晶度快速降低。结晶度的降低表明DF的结构更为松散，这和WHC、SC和吸附能力的改善结果一致。
图3 雷笋DF未处理和酶改性的X射线衍射图
Fig.3 X-ray diffraction diagrams of DF treated by enzyme
3 结论
通过纤维素酶和木聚糖酶联合改性雷笋膳食纤维，并比较了改性前后膳食纤维的理化性能和结构特性的差异。酶法改性不仅可以显著提高雷笋膳食纤维的SDF含量，而且可以改善膳食纤维的功能特性，改性后WHC、OHC、SC和吸附能力(CAC和NIAC)均得到有效增加；经电镜和波谱分析，酶法改性改变了雷笋DF的结构特征，FT-IR显示木质素和纤维素部分降解，XRD表明其结晶度降低。经比较说明了酶处理对雷笋DF性能的影响，并从其结构变化来阐述原因，为进一步研究和开发雷笋新功能食品或食品添加剂提供了有益的指导。
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