酒精含量低(1%～7%)且香气浓郁、酸度适中、口味偏甜、色泽清新的甜型白葡萄酒，不但降低了高酒精度对人体的危害，同时富含维生素、黄酮、白藜芦醇等保健功能成分，深受女性和年轻消费者的青睐[1-3]。目前，国内外主要通过减少可发酵糖分[3]、脱醇[4]以及采用添加SO2终止发酵[5]等特殊的发酵模式生产低醇葡萄酒，在降低酒精度的同时不可避免的造成了香气成分损失。

香气是决定葡萄酒，尤其是白葡萄酒品质的关键要素，也是体现不同葡萄酒产品风格及特征差异的主要呈现方式[6-7]。在葡萄酒发酵过程中，微生物对发酵香气化合物的产生具有重要影响[8]。早期普遍认为非酿酒酵母(non-Saccharomyces cerevisiae)菌株对酒精、SO2等酿酒因子的耐受性不强，不适合葡萄酒发酵[9]。但近年来许多研究表明，合理的利用非酿酒酵母发酵可有效提高葡萄酒香气品质。CONTRERAS等[10]、VARELA等[11-12]酿造葡萄酒时均发现，美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)共同发酵能明显提高酒样中花香及果香味；原苗苗等[13]研究发现戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)与S. cerevisia混合发酵增加了赤霞珠葡萄酒中香气化合物种类和含量，尤其是乙基酯类含量，提升了葡萄酒的香气和复杂性。接种扁平云假丝酵母(Candida humilis)与S. cerevisiae产生较高含量的酯类化合物，其中丁酸乙酯的含量提高了3.77倍，促进酒样花果香的形成[14]；申静云等[15]研究发现混菌发酵的威代尔冰葡萄酒显示了独特的风味成分和高浓度的发酵香气化合物，从而改善了纯种酿酒酵母菌株酒精发酵后香气单一、风味同质化的问题。但利用非酿酒酵母在发酵初期接种增殖时大量消耗糖、产乙醇能力弱、合成香气化合物丰富的特点，混菌发酵生产低醇葡萄酒的相关研究未见报道。

本实验以甘肃河西走廊产区贵人香(Italian Riesling)葡萄为原料，分别选用M. apulcherrima、T. delbrueckii与S. cerevisia进行顺序接种，筛选产香性能较优的发酵组合，并通过微酿实验验证混菌发酵对低醇葡萄酒香气品质的影响，以期为开发新型高品质、多类型的低醇葡萄酒提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

贵人香葡萄采自甘肃莫高实业发展股份有限公司黄羊镇葡萄种植基地，含糖量约为21.0 Brix%，可滴定酸(以酒石酸计)5.65 g/L，pH 3.37。

酿酒酵母Aroma White，意大利Enartis公司；Mstschnikowia pulcherrima346，法国Lallemand公司；Torulaspora delbrueckii，丹麦Christian D.A. Hansen公司。

α-萜品醇、β-香茅醇、香叶醇、里那醇、(Z)-橙花叔醇、里那醇、2-辛醇、β-大马士酮、己酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯、己酸甲酯、癸酸乙酯、戊醇、己醇、辛酸、橙花醇、苯乙醇、金合欢醇等香气标准品(色谱纯)，美国Sigma公司；果胶酶(EX-V)，法国Lallemand公司；偏重亚硫酸钠、NaCl等其他常规试剂，天津市光复精细化工研究所；

1.2 仪器与设备

TRACE1310气相色谱-质谱联用仪、ISQ型单四级杆质谱仪，美国Thermo Scientific公司；色谱柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美国Agilent Technologies公司；固相微萃取(SPME)装置、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅萃取头，美国Surpelco公司；错流过滤机(中空纤维膜柱，0.2 μm，6-10 L/h)，北京德润鑫鼎工程技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化

非酿酒酵母菌株活化：将M. pulcherrima、T. delbrueckii活性干粉分别溶于10倍体积的ddH2O中，28 ℃ 恒温水浴活化10 min；再加入等体积贵人香葡萄汁，23 ℃恒温水浴活化10 min。

酿酒酵母菌株活化：将酿酒酵母菌株干粉溶于10倍体积的ddH2O中，28 ℃恒温水浴活化10 min；再加入等体积的非酿酒酵母菌株贵人香葡萄发酵液(对照组加贵人香葡萄汁)，23 ℃恒温水浴活化10 min。

1.3.2 混菌发酵接种方式

依据参考文献[10-14]和预实验香气测定结果，选择采用先接种非酿酒酵母菌株，后接种酿酒酵母菌株的顺序接种方式进行低醇白葡萄酒酿造，具体处理见表1。

注：A组：先接种M. pulcherrima发酵至酒精度为3.5%时再接种S. cerevisia进行混合发酵；B组：先接种T. delbrueckii发酵至酒精度为3.5%时再接种S. cerevisia进行混合发酵；C组：单独接种S. cerevisia发酵，以该组为对照。

1.3.3 酿造工艺

贵人香葡萄→除梗破碎、过滤澄清(添加40 mg/L SO2、20 mg/L果胶酶)→贵人香葡萄清汁→接种酵母(处理A、B、C)→23 ℃恒温发酵至酒精度为6.5%→0 ℃恒温静置3d→取澄清液进行错流过滤→灌装

得到贵人香低醇甜型白葡萄酒分别取10 mL A、B、C处理发酵后的样品于15 mL离心管中，密封保存于-80 ℃以备测挥发性香气化合物，每组实验重复3次。

1.3.4 香气成分分析

1.3.4.1 香气成分的提取

参照本实验室优化的顶空固相微萃取方法。取8 mL待测酒样于15 mL顶空瓶中，加入2.4 g NaCl和10 μL 4-甲基2-戊醇(2 004 mg/L)，加磁力搅拌转子，密封并摇匀，置于恒温磁力搅拌器中，40 ℃下水浴平衡30 min后顶空萃取30 min。

1.3.4.2 GC-MS条件

采用本实验室建立的方法。毛细管色谱柱为DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；升温程序：50 ℃保持5 min，以3.0 ℃/min升温至200 ℃，保持15 min，进样口温度 240 ℃，高纯氦气(He)流速1 mL/min，不分流进样。质谱接口温度280 ℃，电子轰击离子源(EI)，离子源能量70eV，质谱扫描范围20～350 m/z。

1.3.4.3 定性与定量

参照原苗苗等[13]、申静云等[15]的方法，在质谱全离子扫描模式下，采用保留指数(RI)和NIST-11、Wiley及香精香料谱库检索比对进行定性分析。对萜烯类、高级醇和酯类中已有标准品的化合物，利用标准曲线(R2>0.995)定量，无标准品的化合物采用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标准物质进行半定量。

1.3.5 成品酒样理化指标测定

总酸、挥发酸、残糖、酒精度、总酚等基本理化指标参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行[1]。

1.3.6 成品酒样感官分析

感官品评实验由9名经过葡萄酒品尝培训的专业人员进行3轮盲品。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及VARELA等[11]的方法，对各酒样进行随机编号，分别从外观、香气和风味等方面具体评价(表2)。评价结果使用7分结构化数值尺度来量化，0～7分表示强烈程度逐渐增大。

1.4 数据统计分析

利用Microsoft Office Excel 2013对样本(n=3)所得数据进行基本处理，IBM SPSS Statistics 19.0分析软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 混菌发酵酒样香气成分GC-MS分析

不同酵母菌株组合(A、B、C)发酵酒样中检测出的挥发性香气化合物种类及含量见表3。

3组酒样共检出105种挥发性香气化合物，包括44种酯类(约占香气总量的67.81%～41.05%)、18种醇类(42.03%～17.42%)、14种有机酸类(24.64%～12.85%)、13种萜烯类(1.07%～0.50%)及16种其他物质(2.55%～1.11%)，但各发酵实验组中检测到香气化合物及含量差异较大。

2.1.1 酯类化合物

大多数酯类可以赋予葡萄酒浓郁的花香和果香气味，增加酒体的香气复杂性和典型性[16]。

续表3

续表3

注：“nd”表示未检出该香气化合物；“\”表示未查阅到相关资料。

如表3所示，本实验共检出44种酯类，是种类最多、含量最高的一大类香气化合物。A、B、C组酒样分别检出30、41、24种酯类化合物，总含量依次为3 883.46 8 155.50、297.28 μg/L，各组检出的酯类总量占其相应总香气化合物的48.12%、67.81%和41.05%。

A、B两组混菌发酵酒样检出的酯类物质含量及种类明显高于C组，且B组最高。B组酒样中OAV>1的香气化合物共有9种，主要为辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯、9-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯和丁酸乙酯，这些酯类物质主要赋予低醇葡萄酒浓郁的果香，是主要的发酵香气化合物[16]。而C组对照种仅检出辛酸乙酯(134.78 μg/L)和己酸乙酯(51.21 μg/L)2种OAV>1的香气化合物。两组混菌发酵后的酒样检出的特征香气化合物多于对照组，说明混发酵可以明显提高低醇葡萄酒的果香味。同时B组的酯类物质占其总香气化合物的百分比较高，其特征香气化合物种类也多于A组。所以采用B组混菌发酵的方式不仅提高了贵人香低醇甜型白葡萄酒中酯类化合物的种类及含量，也能产生较多的特征香气化合物，赋予酒样强烈的花果香。

2.1.2 醇类化合物

高级醇是酵母代谢的次级产物之一，主要是酒精发酵过程中氨基酸脱羧、脱氢或糖代谢的常见副产物[17-19]。本实验共检出18种高级醇。A、B、C三组分别检出高级醇的种类(含量)依次为：11种(1 952.62 μg/L)、 16种(2 094.44 μg/L)、12种(304.40 μg/L)，各组检出的醇类总量占其相应总香气化合物的24.19%、17.42%、42.03%，虽然A、C两组高级醇的百分比较高，但是B组中醇类物质的种类及其含量显著高于另外2组，且3组实验中仅有B组检出壬醇的OAV值大于1(1.70)，赋予酒样独特的蔷薇香。

2.1.3 酸类化合物

大部分有机酸来源于酵母菌和乳酸菌代谢的副产物，低浓度时散发奶酪和奶油的风味，而在高浓度时有醋酸味、腐败和刺激味[8,19]。如表3，本实验共检出14种有机酸，其中A组检出最多(14种，1 988.89 μg/L)，B组次之(10种，1 545.90 μg/L)，而C组最少(9种，106.74 μg/L)，分别占其相应总香气化合物的24.64%、12.85%、14.74%。从特征香气化合物的角度来看，A组中庚酸(5.05)、辛酸(2.32)的OAV值大于1，而B组仅有辛酸(1.87)。分析以上数据可得，混菌发酵可以适当增加有机酸的浓度，但是B组检出酸类的种类及含量适中，且占总香气化合物的比例较少，说明T. delbrueckii与S. cerevisia混菌发酵可使酒样具有淡淡的奶油味。

2.1.4 萜烯类化合物

萜烯类化合物属于植物的二次代谢产物，其在酒精发酵期间不受酿酒酵母代谢的影响[21]。由于萜烯类化合物具有浓郁的香味，感官阈值低，所以对葡萄酒香气化合物有很大的贡献[22]。本实验共检出13种萜烯类化合物，A、B、C组酒样分别检出8、10、11种酯类化合物，总香气化合物含量依次为40.31、64.11、7.74 μg/L，各组检出的酯类总量占其相应总香气化合物的0.50%、0.53%、1.07%。虽然对照C组种萜烯的种类及所占百分比较高，但是其含量最低。相比之下混菌发酵后的酒样萜烯类化合物的含量较高，尤其是B组。3组实验中大马士酮的OAV值都高于1，其OAV值分别为A组：63.59、B组：78.03、C组：9.80， 大马士酮是葡萄酒最典型的萜烯类化合物之一，具有强烈的花香、果香、紫丁香味[33]。此外，B组香叶醇OAV值也大于1(1.06)，使该组酒样具有独特的柠檬味、桃子味和玫瑰味。

2.1.5 其他化合物

除酯类、高级醇类、有机酸和萜烯类化合物外，酒样中还检出16种其他化合物，包括醛、酮、酚等，这些化合物对酒依然具有一定的贡献。如B、C两组种检出的癸醛带有橘皮香；A、B两组中带有烟熏味、草药味的对乙烯基愈疮木酚和具有焦香、木香的老姆醚；以及仅在B组检出的二氢茉莉酮具有茉莉香、百合香和玉兰香。

2.2 酒样香气主成分分析

由于酒样香气成分的复杂性，为了直观的分析不同发酵实验组间香气化合物种类及其含量的差异，采用主成分分析(PCA)对酒样的香气品质进行综合评价[22-23]。PCA的样品分布图及鉴定香气化合物的因子载荷图见图1、图2。

载荷系数反映了初始变量(各类香气化合物)与主成分之间的相关性，即初始变量在降维后因子中的贡献率大小，相关系数越大，说明主成分对该变量的代表性越强[23]。图1反映出混菌发酵A组、B组和C组分别位于PC1的正半轴和负半轴，且相距较远，结合因子载荷图2可得知混菌发酵与对照单独发酵的香气化合物有明显差异。其中，甲酸庚酯(A1)、己酸-2-苯乙酯(A30)、苯乙酸乙酯(A34)、4-癸烯酸乙酯(A40)在C组中含量较高。混菌发酵实验组位于两个象限，A组在PC1正半轴和PC2负半轴上，B组在PC1和PC2的正半轴，远离对照C组的同时彼此也相距甚远，说明混菌发酵改善了传统酿酒酵母单独发酵时香气的单一化，混菌发酵后酒样香气化合物与酿酒酵母单独发酵后的香气物质差异明显，与前人研究结果一致[7-15]。但采用不同非酿酒酵母混菌发酵对贵人香低醇甜型白葡萄酒的香气有显著影响。其中A组香气化合物含量较高的为乙酸乙酯(A3)、己酸甲酯、癸酸乙酯(A23)、戊醇(B1)、己醇(B2)、辛酸(C5)、橙花醇(D4)、金合欢醇(D10)等；而B组区别于其他2组香气化合物含量较高的为乙酸己酯(A4)、乙酸异戊酯(A8)、己酸乙酯(A16)、辛酸甲酯(A18)、乙酸苯乙酯(A33)、壬醇(B5)、肉豆蔻醇(B14)、苯乙醇(B15)、薄荷醇(D2)、异胡薄荷醇(D7)、香叶基丙酮(D8)、大马士酮(D9)、癸醛(F2)等。

2.3 贵人香低醇甜型白葡萄酒理化指标分析

表4为A、B、C三组采用不同接种方式发酵成品贵人香低醇甜型白葡萄酒的相关理化指标分析。结果表明，各组酒样总酚、总酸、挥发酸、残糖以及酒精度含量均符合GB15037—2006要求。从发酵的角度分析，3组实验酒精度含量无显著差异时，A、B两组混菌发酵后残糖含量显著低于对照C组，说明非酿酒酵母与酿酒酵母混菌发酵葡萄酒时可降低部分含糖量。选用非酿酒酵母发酵时产酒精能力弱，且可消耗一部分糖，与前人研究结果一致[23-25]。

注：表中同一指标内不同字母代表差异显著，样本量n=3，P<0.05。

2.4 贵人香低醇甜型白葡萄酒感官分析

图3为A、B、C三组不同发酵方式酿造贵人香低醇甜型白葡萄酒的感官分析雷达图。从外观方面分析，3组酒样颜色及澄清度并无较大差异。从香气角度分析，2组混菌发酵酒样花香、果香的评分显著高于对照组，这是由于混菌发酵提高了酯类、高级醇、萜烯类香气化合物的含量，VARELA等[11-12]发现，共同发酵能明显提高酒样中花香及果香，且B组花香果香较为突出，进而促成强烈的香气浓郁度。而风味方面，3组酒样酸度感基本一致，但A、B两组甜味都低于对照C组，这是由于混菌发酵中非酿酒酵母可消耗部分糖且转化为酒精的能力较差[9,25]。混菌发酵显著提高了酒样的余味长短和平衡感，由于B组丰富的香气组分致使这两项的评分最高。总体来看，采用PL-Sc发酵贵人香低醇甜型白葡萄酒时酒体具有良好的感官品质。

3 结论

以贵人香葡萄为原料，发酵初期先接种非酿酒酵母菌株，发酵至酒精度为3.5%时再接种酿酒酵母进行混菌发酵，酒精度达到6.5%时发酵终止酿造低醇甜型白葡萄酒。酒样香气品质结合分析表明，混菌发酵后酒样香气复杂性远远大于对照组，且不同非酿酒酵母与同种酿酒酵母混菌发酵的酒样香气成分差异较大。与其他2组相比，B组混菌发酵后显著提高酯类、高级醇、萜烯类香气化合物的种类及含量，且具有较多的特征香气化合物，赋予贵人香低醇葡萄酒更浓郁的果香、花香。综上所述，采用T. delbrueckii-S. cerevisia混菌发酵方式可作为提升贵人香低醇甜型白葡萄酒香气品质的有效手段，具有很好的应用前景。

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