表1 火龙果酒香气评价表(总分10分)
Table 1 Aroma evaluation standard of pitaya wine
李凯，王金晶，李永仙*，李崎*
(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)
摘 要 为筛选适合火龙果酒酿造的酵母菌株，从多种浆果表面分离获得200株酵母菌株，在杜氏小管发酵的基础上，进一步在火龙果汁中发酵筛选出发酵性能好并具有较好香气的菌株。结合风味物质分析及感官品评获得1株起酵速度快且果酒香气浓郁、具有火龙果典型特征香气的菌株194。通过18S rDNA序列比对，鉴定其为酿酒酵母，可用于食品发酵。
关键词 红芯火龙果酒；酵母；筛选；鉴定
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018596
第一作者：硕士研究生(李永仙高级工程师，李崎教授共为通讯作者，E-mail：yxli@jiangnan.edu.cn，liqi@jiangnan.edu.cn)。
收稿日期：2018-08-24，改回日期： 2018-10-26
火龙果(Pitaya)又名青龙果、红龙果、仙蜜果等，根据果皮与果肉颜色可分为红皮白肉种(Hylocereus undatus)、红皮红肉种(Hylocereus costaricensis)和黄皮白肉种(Hylocereus megalanthus)，属仙人掌科，量天尺(三角柱)属的果用栽培品种，原产于中美洲热带雨林地区，后来传入越南、东南亚国家和我国台湾、福建、广西等地[1-3]。这种热带水果含有丰富的营养成分，它除含有碳水化合物、有机酸、蛋白质外，还有丰富的膳食纤维、维生素及多酚类物质[4-6]，其中红芯火龙果中还含有甜菜红素、花青素等具有抗氧化作用的物质[2,7-8]。
目前火龙果主要以鲜食为主，深加工产品较少，以火龙果为原料进行果酒发酵，不仅保留了火龙果本身的氨基酸、有机酸、矿物质等成分[9]，而且发酵过程中酵母会产生多种对人体有益的代谢产物，且更容易被人体吸收。对于酿造企业而言，菌株是命脉，目前市售火龙果酒大多是一些小企业生产，除勾兑火龙果汁外多采用商业果酒酵母生产[10-15]，但往往出现发酵迟缓，发酵不彻底等问题。因此筛选适合火龙果酒发酵的专用酵母对工业生产具有重要意义。谢国芳等[16]通过TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)平板、杜氏小管、三角瓶发酵3步筛选，得到1株适合在火龙果原汁中发酵的果酒酵母。
因为火龙果果皮较厚，相比较其他多汁浆果，环境中的酵母菌发酵菌株很难与果肉接触，筛选出性能较好的菌株相对困难。故本研究以多汁水果为筛选源，分离筛选适合酿造火龙果酒的优良酵母，得到了1株发酵性能良好，香气馥郁，风味优良的菌株，并对其进行了鉴定。
红芯火龙果(产地越南)、白砂糖，市售；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、酵母浸膏、氨苄青霉素、酸性磷酸钾、硫酸镁、柠檬酸、TTC，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酵母基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。
TTC底层培养基(g/L)：葡萄糖50.5，蛋白胨10.0，酵母浸膏7.5，酸性磷酸钾5.0，硫酸镁2.0，柠檬酸1.35，氨苄青霉素1.0，调整pH在4.0以上，琼脂30.0。
TTC上层培养基(g/L)：葡萄糖0.5，琼脂15.0；灭菌后冷却后加入TTC 0.5。
YPD培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0。
YPD培养基平板、斜面(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0，琼脂粉20。
菌种：商业酵母D254作为对照。
生化培养箱(BSP-250)、低温水浴槽，上海博迅公司；阿贝折光仪，泰光有限公司；电子天平(PL2002)、分析天平(AL204)，梅特勒-托利多仪器有限公司；精密数显pH计，北京Hanna公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海实验仪器有限公司；高速冷冻离心机(5804R)、自动PCR仪，Eppendorf公司；气相色谱串联质谱联用仪，赛默飞世尔科技有限公司。酵母基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。
1.4.1 菌种收集、初筛与分离
TTC是一种显色剂，能与酵母中的脱氢酶反应而呈现红色，且颜色的深浅和酵母体内呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力高低密切相关。将在特定的培养基上培养的酵母菌落上覆盖1层含有TTC的固体培养基，TTC会附着在菌落表面，产酒精能力强的酵母会呈深红色，次之显粉红色[17]。
以多汁水果为筛选源，收集菌体，稀释涂布于含有氨苄青霉素的TTC下层平板上，28 ℃倒置培养2 d。保留菌株数在100左右的平板，倒入TTC上层平板，28 ℃避光培养2～3 h，挑选菌落较大、红色较深的菌落于YPD液体培养基中培养24～48 h，在YPD固体平板中划线分离，挑选典型酵母形态单菌落(表面光滑、湿润、黏稠，质地柔软，易挑起多为乳白色或奶油色)移接于YPD试管斜面28 ℃培养48 h，取出置4 ℃保藏。
1.4.2 菌株复筛
将斜面中保藏的菌株接种于YPD液体试管中28 ℃活化2 d后进行杜氏小管发酵试验，火龙果汁的糖度为22 °Bx，以火龙果汁的体积计算，接种量为5%，在25 ℃静置培养，观察各菌株的产气速度和产气量，挑选出发酵能力强且发酵香气宜人的菌株。
1.4.3 菌株发酵试验
将试管斜面保藏的菌株接种至YPD液体培养基中28 ℃活化2 d，转接入糖度为22 °Bx的火龙果汁中，25 ℃发酵，根据发酵过程中二氧化碳失重，发酵结束时的酒精含量及感官品评，挑选出最终发酵能力、酒精含量、香气较佳的酵母菌株。
香气感官品评：由江南大学经过感官品评专业培训的师生组成品酒小组，根据表1的评分标准品评发酵结束后的滤液，得出火龙果酒的香气评分结果。
表1 火龙果酒香气评价表(总分10分)
Table 1 Aroma evaluation standard of pitaya wine
1.4.4 菌株发酵香气分析
将上述保留菌株活化后按1×107 CFU/mL的接种量接入含糖22 °Bx的火龙果汁中，25 ℃发酵，每天监测二氧化碳失重，发酵结束测定果酒酒精度及利用气相色谱-质谱(GC-MS)分析火龙果酒酒的香气成分，并对其进行感官品评。
样品前处理萃取条件：20 mL顶空瓶中，加入8 mL火龙果酒样品，3.0 g NaCl，在45 ℃预热5 min，萃取60 min。萃取完成后，将萃取头插入进样口，解吸附5 min，进行GC-MS分析，实验以2-辛醇为内标作半定量分析。
分析条件为：GC条件：PEG-20M弹性石英毛细管柱，30 m×0.25 m×0.25 μm；载气为高纯氦气，恒定流量为0.8 mL/min；升温程序：从180 ℃开始，保持2 min，以3 ℃/min升温到230 ℃，保持10 min；进样口温度250 ℃，出样口温度200 ℃；检测电压350 V。MS条件：EI离子源，发射电流200 μA，电子能量70 eV，扫描范围20～550 U。
1.4.5 菌株鉴定
挑取斜面保藏的菌株于10 mL YPD培养基中， 28 ℃ 150 r/min培养24 h。取适量培养液离心 1 min (12 000 r/min)，弃上清，采用酵母DNA提取试剂盒提取菌体DNA，用酵母ITS通用引物(引物序列见表2)扩增基因组DNA，PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。采用BLAST方式将测定的18S rDNA序列与GenBank中酵母菌的序列进行比对，构建菌株系统发育树。
表2 酵母ITS通用引物序列
Table 2 Common primer sequences of yeast
1.4.6 菌株生长曲线测定
将在斜面保藏的菌株在YPD培养基中活化24 h，以10%的接种量接种于YPD三角瓶中，28 ℃培养测定生长曲线，前期每小时取样，将菌液离心去上清，用无菌水重悬，并稀释适当倍数(吸光值0.2～0.8)在600 nm下测定其吸光值，进入稳定期后每2 h测定1次。每次取3个平行。
1.4.7 菌株耐受性实验
分别给与菌株不同生长条件，考察菌株的耐受性[18]。按表3所列的生长条件及各压力梯度将火龙果汁进行调整，分别装入带有杜氏小管试管中。将斜面中保藏的菌株接种于YPD液体试管中28 ℃活化2 d后接入杜氏小管发酵，以火龙果汁的体积计算，接种量为5%， 25 ℃静置培养，观察菌株在不同压力下的产气情况，每个条件均做3个平行。
表3 酵母菌株生长条件及各条件物质浓度梯度
Table 3 Growth pressure of yeast and the
产酒精能力是评价酵母性能的重要指标之
一。将从不同水果表面收集的菌体分别进行适当稀释后涂布到TTC筛选平板，每种水果涂布3个TTC平板，挑选在TTC平板(如图1)上菌落较大、颜色较深的菌落进一步于YPD固体平板划线中分离，挑出典型的酵母菌菌落(表面光滑、湿润、黏稠，质地柔软，易挑起，多为乳白或奶油色[19])200株，经YPD试管斜面培养后4℃保藏备用，菌株来源见表4。
图1 TTC初筛平板
Fig.1 TTC chromogenic media
注：产酒精能力强的菌株菌落颜色为深灰，次之为浅灰，白色为不产酒精的菌株
表4 菌株来源
Table 4 The sources of the screened strains
菌株发酵产气量的多少与其发酵能力的大小有关。本研究采用杜氏小管进行菌株的复筛。将从TTC显色平板挑出的菌株在YPD培养基中培养到稳定期后，以5%的接种量接种于无菌火龙果果汁中，25 ℃培养48 h，根据产气量和发酵液的香气特征，选出产气量较多(产气量为+++，菌株产气情况见表5)且发酵液香气较好(无异杂味，具有酒香、果香或发酵香)的菌株70株进行后续的研究。
表5 菌株杜氏小管产气结果
Table 5 Results of CO2 release of the strains
注：“-”为不产气，“+”为产气高度≤1/2，“++”为产气高度≥1/2， “+++”为充满杜氏小管。
产酒精能力的强弱是评价果酒酵母性能的一个重要指标，行业规定果酒酒精度范围7%～18%[20]。利用葡萄酒生产酵母D254为对照菌株，将复筛所得的70株酵母进行火龙果果汁的三角瓶发酵。将菌株经YPD培养到稳定期后，接种到22 °Bx的火龙果果汁中，25 ℃发酵7 d，接种量为5%，发酵结束测定其酒精度，结果见表6。结果显示，其酒精度在10.0%以上的菌株有36株，对照菌D254发酵后果酒酒精度为11.2%。对酒精度≥7%的50株菌发酵的果酒进行香气品评，挑选出香气评分较高的15株菌。
表6 菌株发酵产酒精能力
Table 6 Results of alcohol production capacity ofthe strains
将挑选出的15株菌株继续进行火龙果果汁的三角瓶发酵，每株菌做3个平行。三角瓶装液量为60%，火龙果果汁糖度为22 °Bx，发酵起始时的酵母浓度为1×107个/mL，25 ℃发酵。发酵过程中每24 h测定二氧化碳失重，发酵结束测酒精含量、风味物质并进行感官品评。结果如图2及表7。
图2 筛选菌株发酵失重图
Fig.2 Screening strains loss weight during fermentation
菌株的起酵速度与发酵周期是考察该菌株优劣的指标之一。生产过程中菌株起酵速度快，可快速形成生长优势，发酵周期短，可增加生产批次，提高设备利用率。通过各菌株发酵过程失重曲线的斜率可以判断菌株发酵速率，斜率越大发酵速度越快。结果表明，菌株发酵到第2天，有9株菌的二氧化碳失重大于对照菌株，其中194号菌的起酵速度最大，两天的失重为9.34 g，是D254的1.67倍。发酵结束后，测定果酒的酒精度、风味物质含量(相对于内标2-辛醇)及香气感官品评，结果见表7。
表7 不同菌株发酵的火龙果酒酒精度、风味物质含量及香气品评
Table 7 The contents of alcohol and flavor substances, and aroma evaluation of dragon fruit winefermented by different strains
注：同一列中不同字母表示组间显著差异(P<0.05)。
通过GC-MS检测分析可知，构成果酒主要香气成分物质主要有醇类、酯类、酸类、酮醛类及萜烯类化合物，其中酯类、醇类和酸类，占总挥发物质的92%以上；酯类物质对果酒的香味起着积极作用，会给果酒带来类似水果及鲜花等香气[21]；高级醇是酒精饮料中另一类重要的挥发性香气物质，适量的高级醇会给果酒带来浓郁芬芳的感官，若含量过高会使酒体产生不愉快的味道，并且还容易引起饮后“上头”[22]；适量的有机酸会使果酒具有爽口感，不足则会使得果酒显得黏稠、不爽口，但是过高会使酒体口感粗糙、有锐利感、不协调[23]。15株菌中酯类含量较高的有19、33、44、194，其中19与33号菌株的高级醇类含量较高，带有肉味，整体评价得分不高；而44号菌株的酸类含量较高，感官评价酸味较重；194号菌株高级醇类、酸类含量适中，感官评价酒体协调，发酵香气浓郁，同时带有火龙果的清香。
综合以上结果，194号菌株更适合火龙果酒的酿造，其发酵后的火龙果酒酒体香气馥郁且具有典型火龙果香气。
2.5.1 菌株鉴定
如图3所示，菌株194的基因组DNA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验条带清晰。将测序结果与Genbank中酵母菌的18S rDNA序列比对，构建系统发育树，如图4所示，菌株194与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同源性为100%，可确定该菌株为酿酒酵母。对该菌株进行菌落和细胞形态观察，菌落呈大小不一的乳白色凸起，边缘较整齐，挑起粘连；细胞形态呈卵圆形，一端或两端出芽。
图3 酵母18S rDNA PCR产物琼脂糖电泳图
Fig.3 PCR analysis of yeast 18S rDNA
图4 基于18S rDNA测序构建酵母菌株系统发育树
Fig.4 Phylodenetic tree of Saccharomyces cerevisiaebased on 18S rDNA sequencing
2.5.2 菌株生长曲线测定
由图5可以看出，酵母菌株194在培养到1 h之后就开始进入对数生长期，在第7 h后开始进入稳定期，说明该菌株的生长性能较强。
图5 菌株194生长曲线
Fig.5 Growth curve of yeast 194
2.5.3 菌株耐受性研究
分别给与菌株不同的压力，考察菌株的耐受性，表8为菌株在25 ℃下发酵24 h时的产气情况。
果酒酿造过程中，酒精发酵的基础是糖，但是高浓度的糖会抑制酵母菌株的生长；由表8可以看出，当果汁糖度低于30 °Bx时，菌株的发酵速度较快，但当糖度为35 °Bx时，菌株的发酵速度明显受到抑制，说明菌株194可以耐受较高的糖度，符合一般酵母菌酒精发酵的糖度12～20 °Bx[24]。菌株的生长环境的pH过高或者过低都会影响酵母的生长，一般火龙果汁的pH为4.7左右，故考虑菌株194在pH<4.5的耐受性；当初始pH在2.5时，菌株的生长受到明显的抑制，当初始pH≥3时，菌株发酵速度较快，说明菌株194具有较强的耐酸能力[25]。一般而言，SO2的添加可以抑制各类杂菌的生长及繁殖，国标中SO2的最高使用量为250 mg/L，故考虑菌株在低于250 mg/L时的耐受性；菌株194在250 mg/L时仍有较高的发酵能力，说明194具有较强的SO2耐受性。最后考察了菌株194的耐酒精能力，耐酒精能力强的菌株可以发酵更加完全、彻底，从而提高酒的酒精度；菌株在酒精体积分数为14%时仍具有较高的发酵性能，说明该菌株具有强的酒精耐受能力，但当酒精度≥16%时,均不产气。
表8 菌株194在不同生长条件下的产气情况
Table 8 Gas production of strain 194 under differentgrowth conditions
注：“-”为不产气，“+”为产气高度≤1/2，“++”为产气高度≥1/2， “+++”为充满杜氏小管。
评价1株酿酒酵母的优劣主要包括菌的良好发酵性能，较强的耐受性和发酵产品香气的丰富性及协调性[26]。目前关于火龙果酒酿酒酵母筛选的报道，大多是从商业菌株中筛选适合火龙果酒酿造的菌株，鲜有火龙果酒专用酵母的筛选与研究。所以，本文在前人的研究基础上，以多汁浆果为筛选源，使用TTC双层平板挑选出具有酒精产生能力的菌株；杜氏小管挑选出发酵能力较强且具有良好香气的菌株；三角瓶发酵挑选出起酵速度快、酒精度较高、香气浓郁的菌株，分析过程中利用感官品评与仪器检测(GC-MS)结合，可以从酒体风味协调性及具体风味物质综合评价酵母性能。综合以上结果，并与商业酵母D254相比，挑选出的菌株194起酵速度快、产酒精能力较强且果酒香气浓郁、典型性好。通过18S rDNA序列比对，鉴定其为酿酒酵母，并且该菌株具有较强的生长能力及耐高糖、高酒精度、高酸、高SO2能力；该菌株在22 °Bx火龙果汁中，25 ℃发酵7 d，可产生11.75%的酒精，且这株酵母酿造的火龙果酒香气优雅，口感协调且火龙果典型性明显，具有较强的工业应用前景。该菌株发酵的火龙果酒香气特征及主要风味物质需进一步研究。
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LI Kai, WANG Jinjing, LI Yongxian*, LI Qi*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education(Jiangnan University), Wuxi 214122, China)
ABSTRACT In order to select a yeast strain that is suitable for red pitaya wine fermentation, 200 yeast strains were isolated from the surface of various berries. Using Duchene tubular fermentation method, all strains were applied to red pitaya juice fermentation. Strains with higher alcohol yield and better aroma were selected. Strain 194 was finally chosen by flavor compounds analysis and sensory evaluation. It exhibited better fermentation performance, rich fruit wine fragrance, and characteristic pitaya aroma. Strain 194 was identified as Saccharomyces cerevisiae via 18S rDNA sequence alignment, thus it can be used for food fermentation.
Key words red pitaya wine; yeast; screening; identification