表1 双孢蘑菇感官评定标准
Table 1 Evaluation criteria for the sensual sense of mushroom
牛耀星，贠建民*，李彦虎，郭娟，邓展瑞，刘小霞
(甘肃农业大学 食品科学与工程学院,甘肃 兰州,730070)
摘 要 为了防止双孢蘑菇采后微生物侵染引起的子实体腐败变质问题，延长双孢蘑菇的保质期，以新鲜的双孢蘑菇子实体为材料，以产抗菌肽P-2的短小芽孢菌HN-10菌株(Bacillus pumilus)的发酵液粗提物为防腐保鲜剂，经无菌水稀释为1∶1、1∶2、1∶3 (V/V)比例的梯度稀释液后对双孢蘑菇进行喷涂处理，开展了在常温(25±1)℃条件下的最优浓度筛选试验和低温(4±1)℃条件下的防腐保鲜贮藏试验。结果表明，常温下抗菌肽P-2保鲜双孢蘑菇最优稀释比例为1∶1 (V/V)，在贮藏3 d时，处理组仍保持着一定的感官品质和较低的腐烂指数。低温贮藏条件下抗菌肽P-2处理能显著抑制双孢蘑菇的菌落总数的上升,降低双孢蘑菇的失重，维持稳定的可溶性蛋白质含量，有效抑制PPO活性的增加,在贮藏5 d时，仍保持着良好的感官品质和一定的商品价值。可见，低温(4±1)℃条件下结合抗菌肽P-2处理对双孢蘑菇有良好保鲜效果，延长了双孢蘑菇的保质期，可为食用菌抗菌肽保鲜剂的开发提供技术参考和依据。
关键词 双孢蘑菇；抗菌肽；保鲜；喷涂处理
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018917
第一作者：硕士研究生(贠建民教授为通讯作者，E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn)。
基金项目：国家重点研发计划(2018YFD0400205)；甘肃省自然科学基金(18JR3RA172)
收稿日期： 2018-09-27，改回日期：2018-11-05
近年来，我国食用菌产业发展迅速，已成为当今世界食用菌的生产和出口大国，其中，双孢蘑菇已成为工厂化生产中产量最大的一种。但由于新鲜双孢蘑菇自身组织脆嫩，营养价值高，含水量较高，呼吸强度大等易腐烂的特点，在采后贮藏运输过程中极易受到微生物侵染，引起食用菌子实体变色甚至腐烂[1]，降低了双孢蘑菇的商品价值和食用价值，对食用菌工业造成损失。而食用菌保鲜最主要的两大因素，首先是控制其衰老进程，其次控制微生物[2]。研究证明，低温下能够有效降低果蔬采后的呼吸速率，延缓衰老[3]。目前对于微生物的抑制主要是通过使用抗生素和传统的化学保鲜剂来保鲜，但是长期使用不仅危害人体健康，使腐败菌产生耐药性，且易造成环境污染[4]。因此，亟待开发出一种新型绿色的食用菌保鲜剂来抑制双孢蘑菇采后微生物侵染引起的腐败变质。
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)，又称肽抗生素或抗微生物肽，是一种广泛存在于生物界中的新型抗菌物质，具有广谱的抗菌活性和不易产生耐药性，抗菌肽热稳定性和水溶性好等特点，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用[5]。目前，抗菌肽在植物保护、食品保鲜、药剂开发等领域已经得到了广泛的应用[6]。最早在1980年欧洲各国就已经将链球菌素添加到食品中作为天然的防腐剂使用，并且也是当时世界卫生组织认可的细菌素食品使用防腐剂[7]。在1990年，DELVES用nisin保鲜牛奶、肉汤，延长了其保藏期[8]。近年来已有抗菌肽应用于荔枝[9]，牛肉[10]，草莓汁、牛奶、馒头、猪肉[11]，柑橘[12]等防腐保鲜中的研究，均具有一定的保鲜效果，但目前国内外对于将抗菌肽作为保鲜剂应用于食用菌保鲜的研究还比较少见。
为此，本文以新鲜的双孢蘑菇子实体为材料，以实验室前期分离鉴定的1株短小芽孢菌(Bacillus pumilus)HN-10菌株经过发酵液粗提和初步分离后的提取液为防腐保鲜剂原液(有效成分为抗菌肽P-2)，经稀释成不同浓度梯度后对双孢蘑菇进行喷涂处理，开展常温和低温防腐保鲜贮藏试验，通过测定双孢蘑菇的感官指标，筛选出抗菌肽保鲜双孢蘑菇的最佳浓度，并以最优浓度再次对双孢蘑菇进行喷涂处理后低温贮藏，以期延长双孢蘑菇保质期。
双孢蘑菇920，采自张掖市爱福农业发展股份有限公司，当天4 h内运回实验室后，放入冷库(4±1) ℃预冷2 h，剔除病、伤菇体，挑选菇盖大小均匀(直径约30～40 mm)、成熟度一致，无病，无机械损伤的双孢蘑菇，分组并立即进行试验。
短小芽孢菌(B. pumilus)HN-10菌株，为甘肃农业大学食品科学与工程学院微生物实验室分离鉴定保存的产抗菌肽P-2菌株。
聚乙二醇6000(PEG 6000)、交链聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、邻苯二酚、均为国产分析纯，天津光复精细化工研究所；牛血清蛋白生化试剂，上海源聚生物公司；12 000～14 000 D透析袋，上海源叶生物科技有限公司；
LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，水1 000 mL，pH 7.0，用于培养短小芽孢杆菌(B. pumilus)HN-10菌株。
SW-CJ-1FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；THZ-98A恒温振荡器、HWS-型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计、UV756CRT紫外可见分光光度计、FA1004B 电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；101-1-S-Ⅱ电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司。
1.3.1 短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2的粗提与初步纯化
取一环短小芽孢杆菌(B. pumilus)HN-10 接种至LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min下培养72 h；将培养好后的菌液于4 ℃、8 000 r/min下离心20 min，收集上清液，然后向无菌的上清液中加入(NH4)2SO4至75 %饱和度，4 ℃下静置，沉淀过夜；将沉淀后的菌液于4 ℃、8 000 r/min离心 20 min，除去上清液，加入20 mmol/L pH值6.8 PBS缓冲液溶解沉淀，后放入截留分子量为 12 000～14 000 D的透析袋中脱去(NH4)2SO4，透析48 h后，收集袋内样品，即得到具有抗菌活性的粗提液。然后采用AB-8大孔吸附树脂对粗提物进行纯化，取 20 mL粗提物，加载进AB-8大孔吸附树脂，体积分数70%乙醇洗脱，流速为2 BV/h，收集洗脱液，排除乙醇残留，即得防腐保鲜剂原液，在4 ℃下保存备用。
1.3.2 抗菌肽喷涂处理
挑选菇盖大小均匀的双孢蘑菇，每30个子实体为1组(约600 g)，使全部菇体侧位放置，采用无菌小型喷雾器，按顺序均匀喷涂经无菌水按1∶1、1∶2、1∶3(V/V)比例稀释的各浓度抗菌肽保鲜液20～30 s，约10 mL，以无菌水处理作为对照，将双孢蘑菇通风20 min，在冷库(4±1)℃预冷2 h后备用，开展保鲜贮藏试验。
1.3.3 常温浓度筛选试验
将喷涂完成后的双孢蘑菇装框并封上保鲜膜，转移至室温(25±1)℃、RH 80%～90%条件下存放，然后用消毒牙签在用保鲜膜密闭的保鲜框上均匀戳6～8个小孔，使体系内的积水散失，每24 h测定双孢蘑菇的感官评分及腐烂指数，测定5 d。
1.3.3.1 感官评分的测定
参照石启龙[13]的感官评价标准，结合本实验中双孢蘑菇的特点制定感官评价标准评定。由受过专业培训的10人对双孢蘑菇子实体的色泽、组织形态和滋味、气味进行评定(表1)。
表1 双孢蘑菇感官评定标准
Table 1 Evaluation criteria for the sensual sense of mushroom
1.3.3.2 腐烂指数测定
参照杨燕婷[14]的方法，并稍作修改(表2)。
表2 腐烂指数等级划分表
Table 2 Rating index ranking table
续表2
腐烂指数
1.3.4 低温贮藏试验
选用筛选出的最优保鲜浓度对双孢蘑菇进行喷涂处理，完成后通风20 min，转移至低温(4±1)℃、RH 80%～90%条件下存放，每隔24 h测定双孢蘑菇的感官评分，失重率、菌落总数、可溶性蛋白含量、PPO活性，测定5 d。
1.3.4.1 感官评分测定
参照1.3.3.1的方法进行评定。
1.3.4.2 失重率测定
参照王靖博[15]的方法采用称重法计算失重率。
1.3.4.3 菌落总数测定
采用棉拭取样法，无菌条件下，在子实体表面取3个约1 cm2大小的区域，将灭菌棉签用无菌水稍沾湿，在子实体每个选定区域揩抹多次，随后将棉签立即剪断，投入10 mL无菌生理盐水中振荡培养(120 r/min、37 ℃、30 min)，制备10-1菌悬液，参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[16]测定子实体表面菌落总数。
1.3.4.4 可溶性蛋白测定
参照邓丽莉[17]的方法，以牛血清蛋白测定标准曲线。取1.0 g样品加入2.0 mL生理盐水，加入一定量4 ℃预冷的石英砂冰浴条件下研磨匀浆，经4 ℃、10 000 g离心20 min后，取上清液即为粗蛋白液，然后采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，单位为mg/g，重复3次。
1.3.4.5 PPO活性测定
参照曹健康[18]的方法测定PPO活性
酶液制备：称取1 g样品，置于研钵中，加入1 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液即为酶提取液，0～4 ℃保存备用。
活性测定：在试管中加入4 mL质量浓度50 mmol/L、pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液和1.0 mL质量浓度50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中，以蒸馏水为参比，在反应15 s时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1 min记录1次，连续测定，重复3次。以每克香菇样品每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位，单位是ΔOD420/(min·g)。
1.3.5 数据处理
采用Excel 2010统计数据，所有数据为3次重复试验所得，计算平均值和标准误差，并绘制图表；采用SPSS 18.0对数据进行差异显著性分析。
由表3可知，双孢蘑菇菇体在常温贮藏过程中随着时间的延长发生感官品质的劣变及腐烂变质。贮藏期内，双孢蘑菇的感官评分不断下降，腐烂指数不断升高。对照组在贮藏第4天时有大部分菌伞发黏，出现了严重的开伞，伞面出现大量褐斑，菌柄腐烂现象，感官评分及腐烂指数达到了50.33分和68.44%，已经失去了一定的商品价值。但经1∶1(V∶V)抗菌肽P-2喷涂处理的子实体在贮藏第5天时感官评分仍为61.67分，腐烂指数为65.27%，均显著优于同期其他处理组(P<0.05)。可见，1∶1(V∶V)抗菌肽处理是抗菌肽P-2保鲜双孢蘑菇的最优浓度，可有效延缓双孢菇贮藏过程中的腐烂变质，延长食用菌的保质期。
表3 常温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇菇体感官评分及腐烂指数的影响
Table 3 Effect of P-2 antibacterial peptide on sensory score and decay index of Mushrooms at room temperature
注：不同小写字母代表在同一时间不同处理间的差异性。
2.2.1 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇感官评分的影响
感官评分是最能直观反映食用菌贮藏期间品质变化的指标。由图1可知，双孢蘑菇的感官评分随着贮藏时间的延长呈不断下降的趋势，且经抗菌肽P-2处理过的食用菌的感官评分高于同期对照组食用菌。双孢蘑菇在贮藏5d时，对照组感官评分为72.90分，还具有一定的商品价值，显著高于常温贮藏同期的感官评分(P<0.05)，说明低温贮藏已经有效地延缓了双孢蘑菇的腐败变质。而经过抗菌肽P-2处理的双孢蘑菇的感官评分达到了78.90分，由此可见，低温条件下结合抗菌肽P-2处理双孢蘑菇有效地延缓了双孢蘑菇的感官品质的下降。
图1 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇感官评分的影响
Fig.1 Effect of antimicrobial peptide P-2 on sensory score of mushrooms at low temperature
2.2.2 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇菌落总数的影响
鲜菇在保鲜贮藏时，往往因微生物的活动而发生腐败变质[19]。菌落总数的多少间接反映了食用菌品质的好坏。由图2可知，在整个贮藏期间，对照组和处理组双孢蘑菇的菌落总数随着时间的延长呈不断上升趋势，而经1∶1稀释度抗菌肽处理后的双孢蘑菇菌落总数显著低于对照组(P<0.05)。这可能是由于抗菌肽具有广谱的抑菌性，抑制了贮藏期间部分微生物的生长繁殖[20]。
图2 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇菌落总数的影响
Fig.2 Effect of antibacterial peptide P-2 on colony count of mushrooms at low temperature
2.2.3 低温下抗菌肽P-2对双孢菇失重率的影响
新鲜采摘的双孢蘑菇的含水量较高，达90%以上，在贮藏期间其水分含量因子实体表面发生蒸腾作用而散失，失重现象会引起双孢蘑菇软化、衰老等症状,导致其鲜度下降[21]。SINGH[22]等研究表明，采后新鲜双孢蘑菇失重率在6%以上时，品质会变坏，影响其商业价值。低温条件下抗菌肽P-2对双孢蘑菇失重率的影响见图3，可知贮藏期抗菌肽P-2处理过的双孢蘑菇失重率显著低于对照组(P<0.05)，贮藏第5天，处理组的失重率比对照组低了0.251%，这可能是由于抗菌肽喷涂处理抑制了表面微生物的滋生，延缓了菇体内营养物质和水分的流失，降低了双孢蘑菇的失重率[23]。由此可见，低温条件结合抗菌肽P-2处理可显著减缓新鲜双孢蘑菇的失重。
图3 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇失重率的影响
Fig.3 Effect of antibacterial peptide P-2 at low temperature on weightlessness rate of mushrooms
2.2.4 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇可溶性蛋白含量的影响
可溶性蛋白质参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，是果蔬品质和营养的重要指标之一[24]。其含量的下降被认为是采后果蔬衰老的一个重要特征，随着贮藏时间的延长，由于缺乏氮源和菇体内蛋白酶活力的增强，加速了蛋白质的分解作用，从而改变了菇体的风味[25]。由图4可知，双孢蘑菇的可溶性蛋白含量随着贮藏时间的延长总体呈不断下降趋势，而对照组在贮藏5 d时较4 d略有上升，这可能是因为贮藏后期对照组菇体代谢旺盛，产生了大量保护类的酶系，使蛋白含量略有升高[26]。经1∶1(V∶V)抗菌肽处理后的双孢蘑菇可溶性蛋白含量显著高于贮藏同期对照组，且较对照组下降趋势缓慢，处理组在贮藏5 d时可溶性蛋白含量仍维持在最初贮藏时的95%以上，这可能是因为抗菌肽P-2抑制了菇体微生物的大量生长，在低温条件下延缓了菇体的衰老，维持了膜脂系统的完整，降低了蛋白酶活力，维持了稳定的可溶性蛋白含量[27]。
图4 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇可溶性蛋白含量的影响
Fig.4 Effect of antimicrobial peptide P-2 on soluble protein content of mushrooms at low temperature
2.2.5 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇PPO活性的影响
多酚氧化酶是食用菌酶促褐变的主要酶类，可以使产品褐变甚至败坏，严重损害食用菌的营养价值、风味及外观质感[28]。PPO活性越低说明耐贮性能越好，低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇PPO活性的影响见图5，随着贮藏时间的延长，处理组与对照组的多酚氧化酶活性呈不断上升的趋势，且经过抗菌肽P-2处理后的双孢蘑菇多酚氧化酶活性受到一定的抑制，这可能是由于抗菌肽抑制了双孢菇菇体微生物的滋生，延缓了菇体的衰老和呼吸代谢，保持了脂膜系统的完整性，从而抑制了双孢蘑菇菇体内PPO活性，延缓了双孢蘑菇的褐变[29]。由此可见，低温条件下抗菌肽P-2处理可抑制双孢菇菇体PPO活性的增加。
图5 低温下抗菌肽P-2对双孢蘑菇PPO活性的影响
Fig.5 Effect of antibacterial peptide P-2 on PPO activity of mushrooms at low temperature
微生物污染食用菌后，借助体内的各种生物酶分解食用菌中的糖类、蛋白质和脂肪等营养物质,使食用菌感官性状恶化，营养价值降低，甚至腐败变质[30]。因此，如何抑制双孢蘑菇贮藏期间微生物的生长繁殖，对于延长双孢蘑菇的保质期，保持双孢蘑菇的营养品质具有重要的意义。而生物来源的抗菌肽作为一种安全、无毒副作用、抗菌谱广、高效杀菌的天然防腐剂，具有潜在的应用价值[31]。低温条件下食用菌呼吸作用减弱，产热量较少，且低温条件下抑制微生物活动，使得贮藏时间延长[32]。本研究结合这2种保鲜方法贮藏双孢蘑菇，以期解决因微生物生长繁殖导致的双孢蘑菇子实体腐败变质问题，延长食用菌的保质期。
采后生理变化和微生物的生长繁殖是导致双孢蘑菇腐败变质的主要原因[2]。试验结果表明短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2处理双孢蘑菇可显著抑制贮藏期间菌落总数(P<0.05)，抑制了微生物的生长繁殖，这是由于抗菌肽具有良好的抑菌性[5]。采后双孢菇的失重主要来自于失水和营养物质的损失，失水是由于表层缺乏有效防止水分散失的组织结构，在蒸腾作用的影响下水分散失很快，而部分营养物质的损失是由于微生物的分解[33]。本研究中抗菌肽P-2处理显著降低了双孢蘑菇的失重(P<0.05)，贮藏5 d时，对照组和处理组失重率分别为2.884%和2.391%，这是由于抗菌肽的抑菌性使菇体微生物数量减少，降低了营养物质的损失。而双孢蘑菇子实体洁白，菇体极易褐变，出现褐斑，是影响双孢菇商品价值的主要问题[34]，因此抑制菇体内多酚氧化酶的活性是解决食用菌褐变问题的关键。本试验结果表明，抗菌肽P-2处理后的双孢蘑菇菇体内PPO活性与对照组差异显著(P<0.05)，贮藏同期PPO的活性较对照组较低，从而抑制了双孢蘑菇的褐变。总体来说，抗菌肽P-2喷涂处理双孢蘑菇，抑制了菇体的失重和多酚氧化酶的活性，维持较高的可溶性蛋白含量，主要是由于抗菌肽的抑菌性，抑制了菇体微生物的滋生，减少了微生物对营养物质的分解，同时保持了脂膜系统的完整，抑制了多酚氧化酶的活性，延缓了双孢蘑菇的褐变，使双孢蘑菇保持一定的感官品质。
短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2作为一种新型保鲜剂，对双孢蘑菇保鲜具有一定的应用价值。然而，抗菌肽如何影响食用菌的采后生理，在理论上还缺乏深入的认识，其作用机理有待进一步探究；并且抗菌肽的应用还是存在一定未知的安全性问题，其应用于食用菌保鲜的安全性仍需继续研究证实。
本试验以感官评分和腐烂指数为指标，利用常温(25±1)℃贮藏试验筛选短小芽孢菌HN-10抗菌肽P-2适于双孢蘑菇保鲜的最优稀释浓度，并评价了最优保鲜浓度喷涂双孢蘑菇在低温(4±1)℃贮藏条件下感官品质、菌落总数、失重率、可溶性蛋白含量、多酚氧化酶活性等生理生化指标，结果表明：
(1)常温(25±1)℃条件下抗菌肽P-2保鲜双孢蘑菇的最优稀释浓度为1∶1(V/V)，能够显著减缓双孢蘑菇感官品质的下降及腐烂变质。
(2)低温(4±1)℃条件下抗菌肽P-2能显著抑制双孢蘑菇的腐烂及褐变，延缓失重率和菌落总数的上升，维持稳定的可溶性蛋白质含量，有效抑制PPO的活性，有效延长双孢蘑菇的保质期。
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NIU Yaoxing,YUN Jianmin*,LI Yanhu,GUO Juan,DENG Zhanrui,LIU Xiaoxia
(College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070,China)
ABSTRACT In order to prevent mushroom spoilage caused by postharvest microbial infection and prolong its shelf-life, effects of Bacillus pumilus HN-10 antimicrobial peptide P-2 on preserving Agaricus bisporus were studied. Fresh Agaricus bisporus was used as raw material, antimicrobial peptide P-2 extracted from fermentation broth of B. pumilus HN-10 was used as the preservative and sprayed to Agaricus bisporus with different concentrations(the gradient dilution ratio was 1∶1 ,1∶2, and 1∶3(V/V), using sterile water). The optimal concentration of antimicrobial peptide P-2 was selected at room temperature (25±1)℃, and the preservation and storage experiments were conducted at low temperature (4±1)℃. The results showed that the optimal dilution ratio was 1∶1 (V/V) at room temperature. After storing for 3 days, treated mushrooms still maintained certain sensory qualities and their decay indexes were relatively low. The antimicrobial peptide P-2 could significantly inhibit the increase of total number of bacterial colonies of Agaricus bisporus, reduce the weight loss, maintain a stable soluble protein content, and effectively inhibit PPO activity under low-temperature storage conditions. After 5 days of storage, treated mushrooms still maintained good sensory qualities and certain commercial values. Therefore, low temperature storage (4±1)℃ together with antimicrobial peptides P-2 treatment had good preservative effects on Agaricus bisporus and prolonged its shelf-life, which could provide technical reference for developing antimicrobial peptides preservatives for edible mushrooms.
Key words Agaricus bisporus; antimicrobial peptides(AMPs); preservation; spray treatment