N等[13]分离奶酪多肽的条件，改进了酒糟多肽半制备分离方法。将上述R溶液稀释5倍体积至质量浓度20 mg/mL，进样，收集12个组分(见图1)。魏冬1，2，范文来1，2*，徐岩1，2
1(教育部工业生物技术重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122) 2(江南大学 生物工程学院，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)
摘 要 以白酒酒糟为研究对象，采用超滤、反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)分离制备酒糟中的水溶性多肽组分，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry, UPLC-Q-TOF-MS)共分离鉴定出30种多肽，包括6种血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)抑制肽AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF，2种抗氧化肽VPSGK、LH和1种抑制紫外线引起红斑的功能短肽HP。研究结果表明,白酒酒糟中含有多种生物活性肽。
关键词 白酒酒糟；多肽；超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018545
第一作者：硕士研究生(范文来研究员为通讯作者，E-mail：Wenlai.Fan@ 163.com)。
基金项目：国家重点研发计划(National Key R&D Program, 2016YFD0400503)
收稿日期：2017-02-27，改回日期：2017-07-31
白酒酒糟是高粱蒸煮加曲后经固态发酵、蒸馏后的残渣，含有较丰富的营养成分，包括粗蛋白、脂肪、糖类、维生素、无机盐和许多风味物质等，如鲜酒糟中粗蛋白含量约为6.99%，干酒糟中粗蛋白含量高达16.78%[1]。
早期研究大都关注酒糟中蛋白、淀粉、脂肪等常规营养成分的分析[1-2]，自20世纪80年代开始，日本研究人员开始研究清酒糟的多肽，并在清酒糟中发现抗高血压的ACE抑制肽[3-4]。目前白酒酒糟中多肽成分的研究尚未见报道。
多肽常见的研究方法包括分离纯化和结构分析两方面。其中分离纯化方法主要有离子交换色谱法[5]、反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)[6]、电泳法[7]等技术，而常用的多肽结构分析技术主要有电喷雾离子化质谱(electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS)[8]、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)[9]等。
半制备RP-HPLC技术不仅分离效果好，而且兼具制备作用，是目前使用的较为广泛的分离制备方法[10]。Q-TOF-MS技术作为高分辨质谱具有分辨能力强、分析速度快等特点[11]。利用RP-HPLC的高效分离和Q-TOF-MS技术的灵敏性，对成分复杂的样品的鉴定和分析效果显著[12]。
本研究以浓香型白酒酒糟为对象，建立了半制备RP-HPLC分离技术，结合UPLC-Q-TOF-MS对酒糟中水溶性多肽进行分离、鉴定，并试图发现其中的功能性多肽。白酒酒糟中功能性多肽的研究对提高酒糟的附加值具有重要意义。
浓香型白酒酒糟取自某酒业股份有限公司，当天取样后于-20 ℃条件下保存备用；超纯水(Millipore-Q系统)；乙腈、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA),Sigma-Aldrich公司，色谱级。
冷冻离心机(Centrifuge 5418)，德国Eppendorf公司；磁力加热搅拌器(MS-S)，大龙兴创实验仪器有限公司；旋转蒸发仪(R-300RL)，瑞士BUCHI公司；半制备型高效液相色谱仪(Waters 2767)，美国Waters公司；Xbridge BEH C18反相色谱柱(10 mm×250 mm，5 μm)，美国Waters公司；超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪，美国Waters公司。
取出在-20 ℃冰箱中储藏的白酒酒糟于常温下放置5 h解冻后备用；称取100 g酒糟样品，加入200 mL超纯水，于40 ℃恒温条件下搅拌60 min，将搅拌后的浑浊溶液进行离心(4 ℃，3 800×g，30 min)，取上清液，用滤纸(Whatman No.2)过滤，进一步高速离心(4 ℃，10 000×g，20 min)。上清液经0.22 μm水系滤头过滤后用超滤管(截留分子量> 1 kDa)超滤，收集下层溶液，真空旋转蒸发，浓缩至原体积的1/20；再冻干后复溶至质量浓度为100 mg/mL(记为R)以备用。
参考TIMN等[13]分离奶酪多肽的条件，改进了酒糟多肽半制备分离方法。将上述R溶液稀释5倍体积至质量浓度20 mg/mL，进样，收集12个组分(见图1)。
色谱柱：Xbridge BEH C18反相色谱柱(10 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A超纯水(含体积分数0.1%的TFA)、B乙腈(含体积分数0.08%的TFA)；洗脱程序：0～60 min，90%～40%A；60～70 min，40%～90%A；流速：2 mL/min；检测波长：214 nm；柱温：20 ℃；进样量：800 μL。
将半制备分离后收集的各个组分分别旋蒸、冻干并复溶，待UPLC-Q-TOF-MS分析，利用质谱软件Biolynx解析鉴定。
色谱柱：BEH C18反相色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：A 100%乙腈、B超纯水(0.1%甲酸)；洗脱梯度：0～0.1 min，2%A；0.1～8 min，2%～40%A；8～10 min，40%～80%A；10～12 min，80%～100%A；12～12.1 min，100%～2%A；流速：0.3 mL/min；检测波长：200～500 nm；柱温：45 ℃；进样量：5 μL。
质谱条件：离子源：电喷雾源(electrospray ionization，ESI)；毛细管电压：3 500 V；锥孔电压：20 V；模式：正负离子双模式；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：400 ℃；碰撞池电压：6V；离子扫描范围：m/z 20～2 000。
RP-HPLC能根据溶质的极性大小使其达到分离的效果。实验选用波长214 nm表征多肽的分离效果。根据图1的紫外吸收情况，把R溶液共分为12个组分。
图1 酒糟样品在214 nm处的反相制备色谱图
Fig.1 Semi-preparative RP-HPLC separation of distilled spent grains at 214 nm
在分析未知物结构时，无法预知它是否适合于正离子或负离子电离，在这种情况下，进行正离子和负离子分析是特别有用的[14]。本研究分别采用正离子[M+H]+和负离子[M-H]-两种模式，通过对比正负离子模式在同一保留时间下的质谱图，判断母离子m/z的大小。
以组分F3在1.055 min处的质谱图为例进行多肽结构分析。从RT 1.055 min时的负离子质谱图(图2-a)可看出，图中存在2个负离子峰[M-H]-，m/z分别为267.3和282.1，而在相对应的正离子质谱(图2-b)上只出现1个分子离子峰[M-H]-=269.3。电喷雾离子源可能使样品基质与溶剂生成加合物，故推测m/z 282.1为溶剂峰，m/z 267.3为多肽峰。
a-组分F3的负离子质谱图；b-组分F3的正离子质谱图
图2 组分F3在1.055 min时离子质谱图
Fig.2 Ion mass spectrum of fraction F3 at 1.055 min
绝大多数碎片离子是由多肽中相邻氨基酸间酰胺键(—CO—NH—)断裂产生的。Biolynx解析软件可以根据肽的分子离子峰计算出肽的质量数，且能在对应的质谱图上匹配多肽碎片离子。根据序列匹配度，预测出氨基酸序列。在正离子质谱中分子离子m/z 269.3的分析结果如下：
其中，A、B、C为肽键的氨基端(N端)产生的离子，X、Y、Z则为羧基端(C端)生成的碎片离子，I为亮氨酸和组氨酸的亚胺离子，有下划线的数值为质谱中出现的碎片离子的质荷比m/z(部分质荷比数值由于相对丰度较低未在质谱图上显示)。低能碰撞主要产生B和Y离子。质谱图中出现了多肽Leu-His的碎片离子和组氨酸的亚胺离子，该多肽序列的匹配度为99.84%。
将多肽标准品Leu-His按照1.5中所述方法鉴定，发现Leu-His的保留时间与样品一致，出峰时间都在1.05 min，且标品Leu-His的分子离子和碎片离子(见图3)与样品在该保留时间下的质谱图吻合，进一步证明了酒糟中存在多肽Leu-His。
图3 多肽Leu-His的标准质谱图
Fig.3 Standard mass spectrum of Leu-His
本实验中多肽鉴定的标准(置信度)设定为75%～100%。前3个组分F1、F2和F3中共鉴定出30种多肽的序列(包括2个相同序列的多肽)(表1)，其中组分F1共鉴定出5种多肽，F2鉴定出16种，F3鉴定出10种，但F4～F12组分中并未检测到多肽。推测酒糟中水溶性肽的极性较大，在前3个组分中就已完全从反相柱中流出，即从F4至余下的半制备组分中不存在多肽。
组分F1和F2中RT 1.224 min处的MS图相同，根据选定母离子m/z 386.3，鉴定为Ala-Ala-Pro-Lys即AAPK。该多肽可能在半制备组分F1和F2收集切换的8.60 min附近出峰。
酒糟中鉴定出30种多肽与文献比对，发现其中9种肽VPSGK、LH、HP、AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF有生物活性，其中6种多肽AAPK[15]、KAGP[16]、TVPK[17]、YE[18]、VPGK[17]、TPF[19]与文献中的多肽完全或部分匹配，且均具有ACE抑制作用，另外AGP具有抗癌作用[20]；2种多肽VPSGK[21]、LH[22]为抗氧化肽；1种短肽HP[23]具有抑制紫外线引起的红斑的功能。另外，抗氧化肽LH和ACE抑制肽YE也具有抑制紫外线引起的红斑的功能。
表1 酒糟中鉴定出的水溶性多肽
Table 1 Water-soluble peptides identified in distilled spent grains
到目前为止，在清酒糟中鉴定出6种具有ACE抑制活性的功能性多肽RF、VW、VWY、YW、FMN、IYPRY [3-4]；而我国浓香型酒糟中共鉴定出9种功能性多肽。除了与清酒糟中多肽具有相同的ACE抑制活性之外，部分肽还具有抗氧化等功能，说明了白酒糟中多肽功能的多样性。
研究人员根据DDBJ数据库氨基酸序列检索结果发现：清酒糟多肽与大米蛋白有相同的序列[24]。在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库中检索本研究中白酒糟多肽的氨基酸序列，发现了与谷蛋白、醇溶谷蛋白等高粱蛋白一致的序列。推测浓香型白酒酒糟中多肽来源于高粱蛋白。通过大曲与环境微生物如酵母等的代谢活动，高粱蛋白被分解形成功能性肽。由于肽的沸点较高，难以在白酒蒸馏过程中蒸馏出来而残留在酒糟中。
本研究在浓香型白酒酒糟中鉴定出30种水溶性多肽，包括6种血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF，2种抗氧化肽VPSGK、LH和1种抑制紫外线引起的红斑的功能短肽HP。由于多肽合成周期较长，接下来的工作将围绕多肽的验证进一步合成余下的20多种多肽，并开始进行酒糟中多肽的定量工作。研究结果表明，白酒酒糟能富集更多的生物活性肽，这将为我国白酒酒糟深加工或高附加值利用提供理论基础。
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WEI Dong1，2，FAN Wen-lai1，2*，XU Yan1，2
1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education(Jiangnan University), Wuxi 214122, China) 2(Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
ABSTRACT The water-soluble peptides in distilled spent grains were isolated by ultrafiltration, and separated by reversed-phase high-performance liquid chromatography(RP-HPLC). The total of 30 peptides were identified by ultra-performance liquid chromatography coupled quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF-MS), including 6 angiotensin converting enzyme inhibitory peptides and 2 antioxidant peptides. The results indicated that there were lots of biologically active peptides in the distilled spirits.
Key words distilled spent grains; peptides; ultra-performance liquid chromatography coupled quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF-MS)