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1(渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁 锦州，121013) 2(生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心(渤海大学)，辽宁 锦州，121013) 3(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连，116600)
摘 要 冷藏可抑制食源性细菌的生长，延长食品的货架期，是最为常用的食品保藏策略。然而，许多食源性致病菌和腐败菌具有较强的低温适应能力，这严重威胁到食品的质量与安全。阐明食源性细菌低温适应的分子机制，对制定和实施更有效的控制措施是至关重要的。主要从食源性细菌低温应激响应关键基因的发掘，转录组学和蛋白组学在食源性细菌低温适应机制研究中的应用两个方面展开综述，以期为食源性细菌的研究和控制提供理论参考。
关键词 食源性腐败菌；食源性病原菌；低温适应；基因；组学
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.019148
第一作者：博士(励建荣教授为通讯作者，E-mail：lijr6491@163.com)。
基金项目：辽宁省海洋与渔业厅科研项目(201712)；渤海大学博士启动项目(0517bs016)
收稿日期： 2018-10-24，改回日期：2018-11-15
食品原料自身会携带一定量的微生物，在后续运输及加工等多个过程中也容易受到微生物污染。微生物的控制是食品安全最重要的方面之一[1]。在食品生产、运输、加工和购买后，通常被采用常规的冷藏方式进行贮藏。冷藏的温度范围通常为4～6 ℃(冰箱)和10～12 ℃(开放式冷藏柜)。在这一温度范围下，有些微生物仍能够以一定的生长速率进行生长，如假单胞菌(Pseudomonas spp.),单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes),小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)等耐冷菌[2]。因此，食源性细菌的低温适应性对冷藏食品的质量和安全构成了严重威胁，当细菌菌群达到一定水平，能够引起严重的食品腐败或食物中毒。理解食源性细菌的低温适应机制是提出有效的保藏策略的基础。在细菌的生存温度降低时，其细胞生理机能会发生重要的变化，比如膜流动性降低，核酸二级结构稳定性增强，转录和翻译效率降低，以及蛋白折叠效率降低等。这时细菌会启动大量的基因来调整低温对其生存的影响[3]。目前，关于低温微生物适冷机制的研究已成为热点，而食源性耐冷菌的适冷机制仍有待深入研究。本文主要从食源性细菌低温应激响应关键基因的发掘，转录组学和蛋白组学在食源性细菌低温适应机制研究中的应用两个方面展开综述，对国内外近年来对食源性细菌低温适应的分子机制研究进行总结，为我国食源性细菌的研究和控制提供理论参考。
低温促使微生物发生一系列的生理变化，其中，RNA的二级结构趋向稳定，易形成发夹结构，会导致转录过早终止或造成RNAs的翻译和降解无法正常进行。因此，对RNA代谢的调节是微生物低温适应的重要策略之一[4]。冷激蛋白(cold shock proteins，Csps)是一类包含核酸结合冷休克结构域(CSD)的高度保守小分子量蛋白(～7.4 kDa)，可结合单链RNA和单链DNA[5]。在低温时，冷激蛋白作为核酸伴侣可能通过与mRNA的结合防止其二级结构的形成，进而促进翻译的进行。目前研究最为透彻的是大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的冷激蛋白。大肠杆菌有9个冷激蛋白同源基因，命名为CspA～CspI，枯草芽孢杆菌有3个冷激蛋白(CspB～CspD)家族成员，其中大肠杆菌的CspA和枯草芽孢杆菌中的CspB是细菌中比较典型的受低温诱导的冷激蛋白[6-7]。目前已经对多种食源性耐冷菌中的冷激蛋白在低温适应中的作用进行了研究，如单核细胞增多性李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S. enteritidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)等。
已报道的食源菌通常具有多个冷激蛋白，但冷激蛋白的作用规律是十分复杂的。在一些食源菌中，不是所有的冷激蛋白均受低温诱导，而常有几个冷激蛋白为最主要的低温诱导蛋白。金黄色葡萄球菌表达3个冷激蛋白(CspA、CspB和CspC)，其中CspB是唯一受低温诱导表达的，表明它是最主要的冷激蛋白[8]。类似的，在肉毒杆菌(Clostridium botulinum ATCC 3502)应对低温时，它的3个冷激蛋白(CspA、CspB和CspC)基因的转录水平均有升高，但仅有CspB基因缺失株在低温下生长受阻，表明CspB基因是肉毒杆菌低温适应中最主要的冷激蛋白[9]。在鼠伤寒沙门氏菌中，已经鉴定到了6个同源的冷激蛋白，StCspA-E和StCspH。已研究的StCspA、StCspB和StCspH的表达受低温的诱导[10]。而在另外一些食源菌中，几乎每个冷激蛋白均参与了低温适应过程。比如单核细胞增多性李斯特氏菌，它具有3个冷激蛋白(CspA、CspB和CspD)，通过基因表达分析和突变体研究发现，在应对低温时，这3个冷激蛋白均是必不可少的[11]。作为低温胁迫的急性应激蛋白，冷激蛋白不仅在细菌遭遇低温时立即响应，在后续较长时间的低温适应中仍发挥作用。ANNAMALAI等[12]报道了在温度从30 ℃降到4 ℃时，分别培养于LB培养基、牛奶和叉烧肉中的小肠结肠炎耶尔森氏菌的冷激蛋白基因表达情况。在低温胁迫时，该菌迅速上调了CspA1和CspA2基因的表达水平，并在低温处理后的24 h内持续表达；在30 ℃培养下，这两个冷激蛋白是几乎不表达的[13]。目前，针对食源性细菌的冷激蛋白的研究多集中于其受低温诱导的表达规律研究及其突变体研究，而关于冷激蛋白的作用靶点、互作蛋白及其参与的食源菌低温应激策略涉及哪些细胞进程，尚有待研究。
冷激蛋白作为广泛存在的低温诱导蛋白在细菌低温适应中起到重要作用。而随着越来越多的细菌完成了全基因组测序，发现多数细菌基因组具有多个冷激蛋白同源编码基因，少数仅有一个冷激蛋白基因[6,14]。还有些细菌基因组中缺少冷激蛋白的存在。如食源性致病菌二型肉毒杆菌(Group II Clostridium botulinum type E)的基因组中没有发现冷激蛋白基因，表明该致病菌应具有其它应对低温的策略[15]。
感应环境变化，应对环境变化引起的负面效应，这对细菌的生存是至关重要的。因此，细菌需要具备能识别和应对多种环境刺激的信号转导机制。细菌的双组分信号转导系统就起到了这样的关键作用。典型的双组分信号转导系统包括一个组氨酸激酶感应因子和一个结合DNA的响应调节蛋白[16]。双组分系统的信号通路基于蛋白磷酸化。组氨酸激酶通常嵌在细胞膜中，通过它的N-端结构域感应一个特定的刺激信号。当受到特定刺激时，感应因子会发生构象的变化，激酶结构域中的C-端组氨酸残基自动磷酸化，磷酰基被转移到细胞内同源响应调节蛋白接收结构域的N-端天冬氨酸残基上。进一步，磷酰基被转移到其C-端输出结构域，磷酸化的调节蛋白被激活，可诱导或抑制靶基因的转录[16]。双组分系统参与许多环境应激反应，包括pH，渗透性，氧化应激和温度[17-19]。研究较透彻的参与细菌低温适应的双组分系统是枯草芽孢杆菌中的DesK/DesR，该双组分系统对于低温下恢复膜流动性具有重要作用[20-21]。近来，多个食源性细菌中报道了参与低温适应的双组分系统。蜡样芽胞杆菌(B. cereus)的CasKR双组分系统对于该耐冷菌在低温下的生长是必不可少的，与枯草芽孢杆菌DesK/DesR的作用类似，CasKR可能在低温时参与调节膜脂肪酸的组成[22-23]。在一型肉毒杆菌(Group I type A C. botulinum ATCC 3502)中，发现了两套分别命名为CBO0366/CBO0365和CBO2306/CBO2307的双组分系统在其低温适应中发挥重要作用[24-25]。在二型肉毒杆菌(Group II type E C. botulinum Beluga)中也发现一套具有类似功能的双组分系统，命名为CLO3403/CLO3404[26]。
PALONEN等发现双组分系统CheA/CheY对于假结核耶尔森菌(Y. pseudotuberculosis)在低温下的生长是十分重要的，突变编码CheA组氨酸激酶的基因会导致该菌在低温下生长受阻，而突变对应的编码CheY调节蛋白的基因则不会影响该菌在低温下的生长[27]，这表明双组分系统参与低温应激响应时，其感应因子和调节因子的重要性可能存在差异。双组分系统中的组氨酸激酶感应因子和调节蛋白也可能在细菌应对低温胁迫时单独起作用。PALONEN等发现假结核耶尔森菌中有4个组氨酸激酶和2个调节蛋白在3 ℃下表达上调，而与它们对应的4个调节蛋白和2个组氨酸激酶的表达水平保持不变[27]。关于双组分系统单个组分在低温适应中的作用，在李斯特氏菌中研究较多。在单核增多性李斯特氏菌野生型EGD-e的基因组中有16个双组分系统，其中一个仅具有调节蛋白lmo2512 (degU)[28]。CHAN等通过突变分析了3个调节蛋白，lmo1060、lmo1172和lmo1377 (lisR)，发现它们对单核增多性李斯特氏菌在4℃下的低温适应是必不可少的[29]。PÖNTINEN等构建了每个双组分系统组氨酸激酶基因的缺失突变株，并监控EGD-e野生型和突变株在3 ℃和37 ℃下的生长情况。结果表明组氨酸激酶yycG和lisK基因表达受低温诱导，并且其缺失造成低温敏感的突变表型；其它基因在低温下表达水平上调，但不产生冷敏感突变株；表明李斯特氏菌的组氨酸激酶yycG和lisK对于其在低温下的生长和适应更为重要[30]。尽管已从各类食源性菌中发现了很多与低温调控有关的双组分系统，但对于这些双组分系统所调控的下游靶点的研究还有待深入。
Sigma因子是RNA聚合酶的一个亚基，结合到RAN聚合酶的核心酶上负责转录的起始。Sigma因子对调控细菌的基因表达起着重要作用，以使细菌能适应快速变化的环境条件[31]。参与应激响应的Sigma因子主要包括一些革兰氏阴性菌中的Sigma S(RpoS)和革兰氏阳性菌中的Sigma B，许多研究者认为它们是功能同源的两个Sigma因子[32]。细胞质外功能(ECF)Sigma因子被用于将细胞质外信号传递到细胞质[33]。目前，基因组序列分析显示一些食源性菌中存在细胞质外功能Sigma因子，但是它们的在低温适应中的确切功能尚不明确[34]。
RpoS不是低温诱导蛋白，但它与许多参与应对低温胁迫基因的表达有关。对大肠杆菌的研究发现，低温下40%差异表达的基因受到RpoS的调控[4,35]。鼠伤寒沙门氏菌RpoS的缺失突变株与野生株在低温下的生长速率及表型差别不大，表明RpoS对该菌在低温下的生长并不起至关重要的作用[36]。但是，另一组研究发现Rpos还是参与了沙门氏菌的低温适应的[37-42]。MCMEECHAN等调查了应激响应RpoS因子和细胞质外功能RpoE因子对鼠伤寒沙门氏菌在低温下生存能力的贡献。在检测环境中，rpoE/rpoS双突变菌株的生长和存活能力弱于单基因突变菌株，表明这两个Sigma因子对该菌应对低温胁迫的过程中均起一定作用[37]。
革兰氏阳性菌通过招募Sigma B(sigB)因子来实现应对各种环境刺激的调控[38]。虽然研究发现肉毒杆菌中似乎缺少编码sigB的同源基因[39]，但在一型肉毒杆菌中，孢子形成Sigma因子sigK是受低温诱导的[40-41]。单核细胞增多李斯特氏菌中受sigB调控的一些基因在应对低温胁迫时表达上调，推测sigB可能在低温胁迫时起到一定调控作用[42]。近来，UTRATNA等人的研究发现李斯特氏菌群sigB因子在低温和最适温度生长下具有类似的表达模式，推测sigB在该菌低温适应中没有起到非常关键的作用。但是，在4 ℃，抗Sigma因子拮抗剂RsbV缺失的情况下能检测到sigB活性；在37 ℃，抗Sigma因子RsbV的缺失下未能检测到sigB活性，表明低温时sigB独特的作用方式，但支撑这种效应的机制需要进一步研究[43]。
微阵列技术和高通量RNA测序技术的飞速发展，推动着食源性细菌低温适应机制的转录组学研究取得较大进展，为发现参与低温适应的新基因、全面阐述食源性菌的低温适应机制提供了可能。CHAN等[28]通过微阵列技术比较分析了单核细胞增多性李斯特氏菌在4 ℃和37 ℃下的全基因组转录水平。4 ℃与37 ℃生长条件下的李斯特氏菌相比，大量基因呈现了差异转录，转录水平上调的基因数多于下调的基因数，其中，转录水平较高的基因均为之前报道过的参与低温适应的关键基因，如双组分系统，冷激蛋白，RNA解旋酶等[28]。在4 ℃下转录水平较低的基因包括毒力相关基因以及一些热激蛋白基因。
一型肉毒杆菌(Clostridium botulinum ATCC 3502)进行了低温下的全基因组微阵列分析，当温度从37 ℃降到15 ℃ 1 h时，观察到16个基因表达显著上调，11个基因显著下调，在温度降低5 h后，199个基因上调，210基因下调。低温胁迫最初，相对较少的基因表达受到了影响，表明存在有针对性的急性冷休克反应，而随着处于低温的时间不断延长，该细菌发生了广泛代谢重构。除了之前发现的细菌耐冷性相关的机制，与脂肪酸生物合成有关的机制也被显著影响，数据分析表明一型肉毒杆菌可能能够利用低温诱导脂质生物合成和修饰机制来应对低温导致的脂质固化。一些未知的DNA结合转录因子编码基因是受低温诱导的，表明可能存在新的调节机制参与肉毒杆菌的冷激胁迫。此外，氧化应激反应，铁吸收和储存及氧化还原平衡等相关基因的转录水平也受到低温胁迫的影响[44]。
副溶血弧菌全基因组基因表达分析表明不同程度的低温胁迫下该菌的基因表达模式不同，该菌根据温度降低程度的不同，采用不同的应激策略[45]。与37 ℃的转录组数据相比，4 ℃条件下有193个差异表达基因，而15 ℃条件下有638个差异表达基因。在4 ℃时, 78% 的差异基因表达下调，仅有22%为上调，上调的基因包括转录调节因子、参与RNA代谢的基因、及部分参与能量代谢的基因。在15 ℃时，参与能量代谢的基因的表达受到抑制，如戊糖磷酸途径，糖酵解和三羧酸循环的基因表达下降。与4 ℃不同，15 ℃下参与氨基酸种类和DNA合成的基因诱导表达了。另外，转录组分析结果还表明该菌的毒力相关基因(如tdh1, tdh2, toxR, toxS, vopC，T6SS-1，T6SS-2)没有受到低温的影响。
在食源性细菌中，蛋白组学不仅被用来研究致病、致腐机制，也已应用到低温适应机制的研究中，这促进了对食源性细菌的低温适应机制更全面的了解。蛋白组结合转录组、代谢组等其他组学技术可弥补单个组学技术产生的偏差。
蛋白质组学分析表明食源性细菌在低温下诱导表达了大量的蛋白。在副溶血弧菌中，低温下69个蛋白显著上调，涉及核酸转运和代谢，转录等多种功能[46]。在麦氏弧菌(V. metschnikovii)中，低温下有288个蛋白表达量上调，最丰富的包括冷激蛋白，延伸因子，分子伴侣，核糖体蛋白，外膜蛋白等[47]。低温使麦氏弧菌增加了大量冷激蛋白和核糖体蛋白的表达，减少了参与能量转换和新陈代谢的蛋白表达。生长在不同温度下(5 ℃和26 ℃)的乳酸菌(Lactococcus piscium)的蛋白组研究发现，低温条件下该菌上调了参与氧化应激反应、脂肪酸和能量代谢的蛋白[48]。蛋白组学分析有助于发掘一些参与低温适应的关键基因。例如，在腐败菌肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides NH04)的蛋白组分析中，鉴定了一个受低温诱导表达的蛋白，烷基氢过氧化物还原酶的同源蛋白(AhpC)[49]。AhpC催化烷基氢过氧化物和过氧化氢的还原，在各种细菌中具有抗氧化的作用。在低温条件下，AhpC在NH04菌株中的表达量是对照菌株中的六倍，AhpC可能增强了NH04的抗氧化能力并在促进生长方面起重要作用[49]。蛋白组学不仅能鉴定大量参与低温适应的蛋白质，还能分析食源性细菌低温适应的特定机制。李斯特氏菌的蛋白组分析发现该菌的低温适应过程主要影响了与蛋白合成和折叠，营养吸收和氧化应激有关的生化途径。在4 ℃生长的李斯特氏菌细胞中，与能量产生的代谢途径有关的蛋白呈现出更高的表达水平，如糖酵解和Pta-AckA通路，这表明细胞通过增强对能源的需求来维持低温下的生长[50]。在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的低温适应研究中，蛋白组与代谢组结合起来用于比较指数生长中期细胞在37 ℃与低温胁迫条件下(4 ℃，2周)的细胞质蛋白和代谢变化[51]。蛋白组和代谢组数据的主成份分析表明，在指数生长中期，不同温度条件下的蛋白和代谢表达谱不同，在受低温胁迫的细胞中，9个核糖体蛋白含量大幅升高，但大多数氨基酸含量却减少了，表明代谢稳态和蛋白组成的特定变化对细菌低温胁迫下的适应是至关重要[51]。这些研究与转录组学分析类似，均反映了食源性细菌更全面的低温适应过程，这个过程涉及到多个系统的参与。全面的蛋白组学研究将有助于增加我们对食源性细菌低温适应机制的理解。
许多食源性致病菌和腐败菌具有较强的低温适应能力，它们通过自身的基因调控抵消了低温带来的有害影响。但是，在这个过程中，不同的细菌可能采用了不同的策略，这是不同细菌分子进化和适应的结果。转录组学和蛋白组学都能很好的揭示了食源性细菌在低温适应过程中的全细胞反应。而通过基因组学、转录组学、蛋白组学及代谢组学等多个组学的结合分析将为食源性细菌低温适应机制的研究提供了强有力的基础。尽管目前已经发现了许多参与低温适应的关键响应基因，但是这些基因的上下调控通路尚不够清楚。随着多组学技术的应用，越来越多参与低温适应的关键基因会被发掘，细菌的整个低温适应调控网络会越来越明晰。食源性细菌在低温下的生存能力对食品的质量与安全是至关重要的，通过分子生物学角度研究其低温适应的机制，能帮助人们更加深入的了解食源性细菌在低温下的生理行为，进而为更好的控制食源性细菌提供了指导。
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LI Qiuying1,2, ZHANG Dongdong1,2, WANG Siwen1,2, SUN Tong1,2, LI Tingting3, LI Jianrong1,2*
1(College of Food Science and Technology, Bohai University,Jinzhou 121013,China) 2 (National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products (Bohai University), Jinzhou 121013, China) 3 (College of Life Science, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China)
ABSTRACT Refrigeration can inhibit the growth of foodborne bacteria and extend the shelf life of foods, therefore, it is the most commonly used strategy for food preservation. However, many food-poisoning and food-spoilage bacteria possess strong cold adaptability, which are serious threats to food quality and safety. Elucidating molecular mechanisms underlying cold adaptation of foodborne bacteria is essential for developing and implementing more effective controlling measures. This review focused on discovering key genes responsible for cold response of foodborne bacteria, and the applications of transcriptome and proteomics in researches on mechanisms of cold-adaptation of foodborne bacteria, providing a theoretical reference for researching and controlling foodborne bacteria.
Key words food-borne bacteria; food-borne pathogen; cold-adaptation; gene; omics