赵东，郑佳*，彭志云，杨康卓，张建敏，刘芳
(宜宾五粮液股份有限公司,四川 宜宾，644007)
摘 要 利用顶空固相微萃取(head space solid phase microextraction, HS-SPME)偶联气质联用法(gas-chromatography mass spectrometry, GC-MS)研究了不同空间层次的五粮液出窖糟醅和与之对应的窖泥的香气成分。研究结果表明，共定量了97种香气成分，包括57种酯、10种酸、12种醇、3种醛酮、12种芳香族和3种其他成分。五粮液窖边糟和窖泥中优势香气成分的组成具有高度相似性。窖边糟中香气成分的含量显著高于中心糟。同时，窖边糟中较中心糟优势的香气成分在窖泥中均有检出且含量较高。该研究揭示了不同空间层次糟醅与窖泥的相互影响程度，对全面认识窖池内物质循环及微生物作用具有一定的借鉴意义。
关键词 糟醅；窖泥；空间；相关性；香气成分；固相微萃取
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018624
第一作者：教授级高级工程师(郑佳博士/博士后为通讯作者，E-mail：zhengwanqi86@163.com)。
基金项目：国家重点研发计划(2016YFD0400500)；固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金(2015GTY005)
收稿日期：2018-08-29，改回日期：2018-12-03
五粮液是我国五粮浓香型白酒的典型代表，具有“香气悠久、味醇厚、入口甘美、入喉净爽、各味协调、恰到好处，尤以味全面而著称”的特点。在悠久的酿酒历史过程中形成了极为复杂而独特的酿酒工艺，包括5种粮食配方，传统“包包曲”的制曲工艺、“固态续糟” “沸点量水”“双轮底发酵”“跑窖循环”“分层起糟”“分层蒸馏”“量质摘酒”“按质并坛”等最为突出的传统酿酒工艺，这些优良的传统酿酒工艺形成的运行系统是保证五粮液长盛不衰的根本[1]。其中以高粱、大米、糯米、小麦、玉米为原料的5种粮食配方是五粮液区别于其他浓香型白酒的特色之一，是五粮液优良品质的物质保证与基础[2]。研究表明，5种粮食除了具有相似的淀粉、蛋白质、脂肪外，还在混蒸与发酵中提供不同的微量香气成分[3]，比如高粱产酒清香味正、大米产酒醇和甘香、糯米产酒纯甜味浓、玉米产酒味香冲鼻、小麦产酒曲香悠长等，这些微量成分的综合发酵形成五粮液独特的酒体风格。
俗谚道，“千年老窖万年糟，酒好须得窖池老”。泥窖窖池既作为盛装糟醅的容器外，还具有微生物和营养物质载体的功能，特别是窖泥中微生物与发酵糟醅的互动情况对浓香型白酒的酒质具有决定性作用。五粮液糟醅是年复一年反复使用的所谓“万年糟”。它经微生物长年发酵，日积月累，糟醅中积攒了大量的微生物代谢产物、微生物菌体自溶物以及原料的分解残留物，这些物质的存在为发酵提供了复杂呈香呈味物质生成所必需的前体物，也直接为成品酒提供了大量的香味物质，形成了窖池糟醅成分的丰富积累。窖泥与糟醅长期接触,在糟醅的浸润下，窖泥吸收了大量的酸、酯、醇和其他营养物质，供给窖泥中栖息的微生物生长、繁殖。窖池相对厌氧条件又为以己酸菌为主体的窖泥功能菌群创造了适宜的条件[4]。由于长期不断地富集、驯化，使老窖泥中积累了越来越多的优良窖泥功能菌系，从而发挥出老窖泥特征的生产性能，形成了老窖泥丰富的微生物积累效应。且发酵产生的黄水及糟醅中香味物质和营养物质的积累以及对窖泥的浸润作用，形成了“以糟养窖”“以窖促糟”“窖糟互养”的良性循环和积累，达到了稳定持续出好酒的目的。目前，我国酿酒科研的重心都放在了剖析糟醅—窖泥微生物[5-8]、白酒香气成分[9-13]等方面，迄今为止，探讨窖泥与糟醅间相互关系的研究工作并没有开展。
本研究基于顶空固相微萃取(head space solid phase microextraction, HS-SPME)技术，探讨了不同空间糟醅和窖泥中的香气成分，结合质谱匹配度和保留指数进行成分的定性和内标定量法，获得较为全面的糟醅香气成分数据库；并基于多元统计分析方法探讨了糟醅与窖泥之间香气成分的相互影响关系，以期为探讨窖泥对酒质的影响提供数据支撑，为实际生产提供理论指导依据。
1.1.1 样品采集
所有样品均采自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间，窖池窖龄约40年。
糟醅采集方法：如图1中灰色点所示，将窖池中糟醅垂直中线分为5个点，每点采集3个平行样品，分别取500 g，混合均匀。其中，Z1为窖帽糟醅，Z2为中上层糟醅(距地面约20 cm)，Z2-1为Z2对应的窖中心糟，Z3为中下层糟醅(距黄水线约20 cm)，Z3-1为Z3对应的中心糟，Z4为下层糟醅(黄水线下10 cm)，Z4-1为Z4对应中心糟，Z5为窖底糟醅，Z5-1为Z5对应的中心糟。
窖泥采集方法：如图1中黑色点所示，与糟醅对应位置窖壁上，间隔10 cm，取3个平行样，分别取50 g， 混合均匀。其中，编号为1#，2#，3#，4#，5#的窖泥均与上述糟醅的取样位置相对应。
图1 糟醅和窖泥的取样位置
Fig.1 Sampling positions of fermented grains and pit mud
1.1.2 样品前处理
取100 g样品置于冰箱中，-20 ℃完全冷冻，再将样品置于搅拌机中，搅拌均匀，待用。
1.1.3 试剂和仪器
C7-C30直链正构烷烃购自美国Sigma-Aldrich公司。
搅拌机，Philips公司；顶空固相微萃取手柄、50/30 μm CAR/DVB/PDMS Stableflex纤维萃取头，美国Supelco公司；6890N-5973MSD气质联用仪，美国Agilent公司；DB-WAX石英毛细管色谱柱(30.0 m×0.25 mm ×0.25 μm)，J&W美国安捷伦公司。
称取2 g处理好的样品于20 mL顶空样品瓶中，加入定量内标(4-辛醇，5.5 mg)，置于50 ℃水浴中平衡15 min，插入萃取头吸附45 min，随后插入GC进样口热解析5 min，分析其中香气成分。每个样品分析3个平行。
气相色谱条件如下所述：进样口温度250 ℃，载气(He)流速1 mL/min，不分流模式进样；气相色谱升温程序为：起始柱温40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持15 min。
质谱条件为：质谱EI源，电子轰击能量70 eV；离子源温度200 ℃，四级杆温度150 ℃；质量数扫描范围35～350 amu。
香气成分的鉴定采用以下方法：首先将化合物的质谱图与NIST08标准数据库(美国Agilent公司化学工作站内置)中的标准图谱进行比对，匹配度>800(最大值1 000)，作为初步定性结果。再计算各物质的Kovat’s保留指数(RI)，并与文献报道的保留指数值进行比较，确定该物质的归属。其中，RI计算方法参考文献[14]所述。
香气成分的定量结果基于Agilent化学工作站获得，各成分的含量以其峰面积与内标峰面积之比计算，均采用定量离子定量，含量单位为μg/g(n=3)。
利用SPSS 16.0软件(美国SPSS公司)中因子分析(component analysis)工具进行不同窖泥的主成分分析，计算参数：计算方法为主成分、分析基于相关性矩阵、主成分抽取基于特征值(大于1)、最大收敛迭代次数为25。
分别以不同空间位置的窖边糟、中心糟和对应窖泥为研究对象，GC-MS测定其中含有的香气成分。结果如图2所示，该图展示了部分糟醅、窖泥样品香气成分的丰度信息，图2可知，不同样品间香气成分的丰度是完全不同的，如窖边糟(Z5)和中心糟(Z5-1)的区别十分明显，窖帽泥(1#)和窖底泥(5#)的区别也是十分显著的。
图2 糟醅窖泥的香气成分总离子流图
Fig.2 Total ion chromatograms of volatile compounds in fermented grains and pit mud
在不同空间位置糟醅和窖泥中共定量检出了97种香气组分，其中57种酯、10种酸、12种醇、3种醛酮、12种芳香族和3种其他成分。总含量的比较结果如图3所示，中上层和中下层窖泥(1#和2#)的香气成分总含量低于同层糟醅(Z2，Z2-1，Z3，Z3-1)，而黄水线以下的窖泥的香气成分则显著高于同层糟醅。黄水线以下窖泥的香气成分总量较高，4#最高，为2 831 μg/g。对糟醅而言，窖边糟的总含量均大于中心糟，如Z2为535.7 μg/g，是Z2-1的2.9倍，Z4为1 949.5 μg/g，是Z4-1的2倍。这可能是由于糟醅发酵过程中产生的黄水在窖池中往往下渗至窖池底部，黄水线以下的窖泥长期与糟醅接触而吸收大量黄水中的成分，进而黄水线以下窖泥的香气成分的含量高于同层糟醅。
图3 糟醅、窖泥香气组分总含量的空间分布规律
Fig.3 Spatial variation of total concentration of volatile compounds in fermented grains and pit mud
2.2.1 窖边糟与中心糟的关系
如图4所示，不同层次窖边糟(Z2、Z3、Z4和Z5)的含量均是显著高于中心糟(Z2-1、Z3-1、Z4-1和Z5-1)。这可能是由于在浓香型白酒发酵过程中，窖泥与糟醅长期接触，在窖边糟醅吸收来自于窖泥的营养成分和香气及前体物质，进而形成与中心糟醅相区别的香气物质。
图4 窖边糟和中心糟香气成分含量比较
Fig.4 Comparison of volatile compounds between edge and central fermented grains
2.2.2 窖泥与糟醅中香气成分的关系
表1为糟醅与窖泥中香气成分的含量，可见诸多浓香型白酒优势香气成分在窖边糟的含量显著高于中心糟，且在窖泥中的含量较高，包括己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、己酸己酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁酸、己酸等。
酯类成分是浓香型白酒中含量最丰富的一类化合物。其中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯等在过去的研究中已经证实在浓香型白酒的香气贡献值是最大的一类化合物[15]。这类化合物呈浓郁的果香味，如香蕉、苹果、菠萝等水果香气，尤其是己酸乙酯具有强烈的酒香、菠萝以及香蕉等香气特征。本研究中，酯类对糟醅香气的贡献度最大糟醅中酯类成分占总含量的63%～82%(图4)，检出的57种酯中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸戊酯、己酸己酯、苯乙酸乙酯和棕榈酸乙酯是优势成分。类似的，同香型的非五粮糟醅中也检出了29种酯类成分[16]，占总含量的65%，己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯和棕榈酸乙酯是其丰度较高的酯。这说明五粮浓香与非五粮浓香在糟醅酯香存在着显著的差异。
李恒等[17]比较了浓香型窖壁和窖底泥香气成分的差异性，认为己酸、己酸丁酯、己酸己酯是窖壁泥的主要成分，而窖底泥中同时含有丰富的己酸甲酯。本研究中，窖泥中的酯类成分与糟醅中的含量基本持平或略低于糟醅(表1)，且数量基本一致，检出了酯类数量较多，而这些酯类成分不仅仅局限于乙酯类化合物，且优势酯类成分包括乙酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、癸酸乙酯、辛酸丁酯等。可能是由于糟醅是酸醇酯化反应发生的主要场所，而窖泥中检出的酯类则是从糟醅转移至窖泥并在长期的生产过程中日积月累而成。
酸类成分是窖池中生成酯类物质的前驱物(或者前体物)，本研究中共检出了11种有机酸(表1)，其中，己酸、丁酸和乙酸是糟醅中的主要酸类，窖泥中除了这些外还包括庚酸和辛酸。值得注意的是，窖泥中有机酸的含量明显高于糟醅(表1)，说明窖泥是有机酸合成代谢的主要场所。
表1 不同空间位置糟醅及窖泥的香气成分
Table 1 Spatial variation of volatile compounds in fermented grains and pit mud
续表1
这可能是由于窖泥中产生的有机酸通过窖池的“物质内循环”转移到了相接触的糟醅，糟醅发酵过程中，水蒸气的作用进而将有机酸转移到不同空间位置的糟醅中。
酸类成分呈典型的酸涩味、臭脚丫、汗臭等不愉快气味[18-19]，窖泥中较高含量的有机酸可能会削弱酯类物质的果香味，而使得窖泥中香气特征与糟醅截然不同。
芳香族成分中，除Z3中对甲酚含量较高，对甲酚在窖泥中的含量均高于糟醅。对甲酚在空气中的阈值是0.12 μg/L，并呈强烈的烟熏味、苯酚味、马厩味等不愉快气味，因此，较高含量的对甲酚将极大影响糟醅和窖泥的香气特征。
基于香气成分的糟醅与窖泥关系的PCA表明(图5)，主成分1(PC1)的贡献率为81%，主成分2(PC2)的贡献率为19%，表征了整体数据的信息特征。其中，PC1的贡献率最大，表征了各种样品间的区别与联系。根据在PC1轴上的载荷值，可将不同样品进行区分，窖泥1#、2#、3#在PC1上的载荷值较其他样品小，中心糟样品(Z1-1到Z5-1)则聚集在载荷值为0.9附近(图中圆圈内)，窖边糟Z2到Z5则位于载荷值为1附近(各样品间的区别也可根据PC2载荷值而区分)。
图5 基于香气成分的窖泥糟醅关系PCA载荷图
Fig.5 PCA loading plot of fermented grains and pit mud based on volatile compounds.
五粮配方的糟醅在窖池发酵过程中，不仅为酿酒功能微生物提供了增殖代谢的场所，也为窖泥中栖息的特殊功能微生物提供了必要的营养基质，糟醅与窖泥相接触，窖泥中的微生物与香气物质不断地与糟醅发生着相互交换。本文探讨了不同空间位置的五粮液糟醅与对应窖泥的香气成分的异同点，结果表明，窖边糟与窖泥之间香气成分的交换效果明显，窖边糟中特殊香气成分的含量较中心糟的高，较高含量的有机酸和对甲酚可能是造成窖泥出现有别于糟醅香气特征的缘由之一。
五粮液独特的酿酒生态环境为形成五粮液特殊酒体风格提供了不可复制的微生物群落。目前，我们正在积极开展窖泥微生物群落与糟醅微生物群落的相关性研究以及在五粮液传统工艺条件下的微生物群落的生理代谢特征研究，以期实现五粮液酿造可控化目标。
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ZHAO Dong, ZHENG Jia*, PENG Zhiyun, YANG Kangzhuo, ZHANG Jianmin, LIU Fang
(Wuliangye Yibin Co. Ltd.,Yibin 644007，China)
ABSTRACT Volatile compounds in fermented grains (FG) and their corresponding pit muds (PM) from different spatial positions were analyzed by head space solid phase microextraction (HS-SPME) coupled with gas-chromatography mass spectrometry (GC-MS). The results showed that a total of ninety-seven compounds were quantified, including fifty-seven esters, ten acids, twelve alcohols, three aldehydes and ketones, twelve aromatics, and three other compounds. Highly similar volatile constitution was detected between cellar-wall FGs and PM samples. The level of volatile compounds detected in cellar-wall FGs was significantly higher than those in the cellar-central FGs. Meanwhile, major compounds in cellar-wall FGs were also identified in PM from the same layer with high quantities. This study revealed the influencing level between fermented grains and pit muds at different spatial layers, which may provide useful information for understanding substances recycling and the effects of microbes in cellar.
Key words fermented grains；pit mud；spatial；relationship；volatile compounds；SPME