周心雅1，贺稚非1,2，王兆明1，甘潇1，李洪军1,2*
1(西南大学 食品科学学院，重庆，400716)2(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400716)
摘 要 为提高兔肉的商品价值，将兔肉背最长肌、腹肌和后腿肌在4 ℃冷藏条件下贮藏10 d，研究腥味物质己醛和己酸的变化规律及各项指标的变化。通过挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)表征兔肉新鲜度，硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS)和脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性表征脂肪氧化程度。研究结果表明，随着贮藏时间的延长， TVB-N和TBARS显著增长(P<0.05)，后腿肌、腹肌和背最长肌的TVB-N分别在2 d和4 d接近国家标准中的限定值；不同部位的LOX活性在贮藏期表现为先增大后减小；腹肌的己醛含量显著增加(P<0.05),而背最长肌和后腿肌的含量变化较小且始终小于腹肌的含量；3个部位的己酸含量都存在显著下降再上升的趋势，但仅后腿肌表现出终点值显著高于初始值(P<0.05)。综上，冷藏能在贮藏初期抑制兔肉不同部位的腥味增长并保持兔肉的新鲜度，提高兔肉的加工品质。
关键词 兔肉；新鲜度；腥味物质；己醛；己酸；冷藏
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018276
第一作者：硕士研究生(李洪军教授为通讯作者，E-mail：983 362225@qq.com)。
基金项目：2017年国家自然科学基金项目(31671787)；国家兔产业技术体系肉加工与综合利用(CARS-43-E-1)；重庆市草食牲畜产业技术体系(Y201706)；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目(cstc2014pt-gc8001)
收稿日期：2018-07-14，改回日期：2018-07-30
兔肉是一种富含蛋白质、低脂肪、低胆固醇、低钠的健康肉品[1]，具有开发为保健食品的潜力。中国是世界上兔肉产量第一大国，据FAO的统计，2016年亚洲兔肉产量占世界产量的75.3%，我国的兔肉产量约85万t[2]。兔肉的市场占有量小[3]，具有广阔的发展前景。兔肉的腥味是限制兔肉发展的一个主要因素。
兔肉腥味是指兔肉加热后产生的一种令人讨厌的气味。张振华等[4]研究发现，未去势公兔的腥味最重，其次是去势公兔，母兔的腥味最轻。在之后的研究中，姜颖等[5]使用氮气吹扫-捕集(nitrogen purge-and-trap)技术提取兔肉腥味物质，经气相-质谱检测确认己醛等中级醛为腥味的主体物质；谢跃杰等[6]使用超临界CO2流体萃取兔肉腥味物质，确认己酸是另一种腥味主体成分。己醛是一种不饱和ω-6脂肪酸的氧化产物[7]；己酸的来源多样，包括酶和化学反应，细菌作用，脂类、氨基酸或碳水化合物的分解[8]，同时己酸也可由己醛氧化得到。
冷藏是一种常见的保藏方式。研究表明[9]，在-55 ℃条件下，酶促反应、氧化酸败和冰的再结晶受到最大限制，肉品很少发生腐败。而冷藏在4 ℃环境下，兔肉易发生氧化反应，腥味物质的含量可能发生变化，影响兔肉的品质。本文研究了在4 ℃冷藏条件下，不同部位兔肉腥味物质含量的变化规律，为贮藏期内减少兔肉腥味生产高品质的兔肉提供了理论依据。
试验材料为70日龄的伊拉克公兔，购买于重庆渝北阿兴记肉兔养殖基地，按常规方式统一宰杀后，分割背最长肌、后腿和腹部肌肉，用装有冰袋的保温箱运回实验室，置于4 ℃冰箱贮藏。己酸标准品和己醛标准品为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
BSA323S 电子精密天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；UV-2450 紫外分光光度计，日本岛津公司；GC-2010 Plus气相色谱仪，日本岛津公司；HSS 86.50 Plus自动顶空进样器，意大利DANI Instruments S.p.A.公司。
1.3.1 材料处理与试验设计
将分割好的兔肉用塑料托盘放置，并使用保鲜膜覆盖，贮藏于4 ℃的冰箱内。分别在0、2、4、6、8、10 d对不同部位的兔肉取样检测。分别随机取背最长肌5条、腹部肌5块、后腿肌5块，绞碎后混合取样，每次测定做3组平行。
1.3.2 挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)的测定
参照GB 5009.228—2016 食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定[10]。
1.3.3 硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS)的测定
参照GB 5009.181—2016 食品安全国家标准食品中丙二醛的测定[11]。
1.3.4 脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性的测定
参考JIN等[12]的方法并稍作修改。粗酶液的提取：称取5 g绞碎的兔肉，加入3倍体积50 mmol/L pH 7.0 磷酸缓冲液(含有1 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L 二硫苏糖醇)。在冰浴条件下均质4次，每次10 s，25 000 r/min。均质后，在4 ℃、12 000 ×g条件下离心60 min，用4层纱布过滤得到上清液，即为LOX酶粗酶液，在4 ℃冰箱保存备用。底物的配制：取140 mg亚油酸加入5 mL重蒸水和180 μL吐温-20中，用2 mol/L NaOH调节pH直到溶液变得澄清透明，用重蒸水将溶液定容至50 mL。底物溶液充氮保存在4 ℃冰箱备用。活性的测定：向比色皿加入50 mmol/L pH 5.5 柠檬酸缓冲液2.9 mL，底物溶液200 μL和粗酶液100 μL，盖上盖子迅速翻转摇匀，在234 nm下测定1 min内吸光度的变化，空白为50 mmol/L pH 5.5 柠檬酸缓冲液3 mL和粗酶液100 μL。 在234 nm下，每分钟每克蛋白增加的1个吸光度单位定义为1个酶活单位。
1.3.5 己醛和己酸含量的测定
使用静态顶空—气相色谱法测定己醛和己酸的含量。参考邓大川等[13]的方法并稍作修改。
样品的制备：取2.00 g绞碎兔肉加入20 mL顶空瓶中，加入2 mL饱和食盐水，封盖后轻轻振荡摇匀。在70 ℃下静态顶空保温20 min进样，定量管温度130 ℃，传输线温度150 ℃。
气相色谱条件：色谱柱：Rtx-Wax (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；升温程序：40 ℃保持3 min，以20 ℃/min升至115 ℃，再以6 ℃/min升至180 ℃(保持3 min)，最后以20 ℃/min升至230 ℃ (保持3 min)；柱流量为1.5 mL/min，流速1.06 mL/min， 载气为N2；自动顶空进样器进样，分流比10∶1。使用外标法计算物质的含量。
1.3.6 气味活度值(OAV)分析法
采用OAV法评价风味物质对整体风味的贡献大小。OAV>1，认定该化合物对整体风味有贡献；OAV≤1，认定该化合物对整体风味没有贡献，OAV值越大则化合物对整体风味的贡献越大。计算公式(1)如下：
(1)
式中：C为化合物浓度；T为感觉阈值。
试验重复3次测定，所得数据使用Excel 2013计算平均值和标准偏差，图形绘制使用Origin 2017，SPSS Statistics 19.0统计软件进行差异显著性分析，取95%置信度(P<0.05)。
TVB-N的主要成分是氨、伯胺、仲胺和叔胺，它主要是由肉类贮藏过程中的腐败菌或酶降解产生的[14]。随着细菌消耗肌肉中的糖原和肌肉蛋白质的降解，TVB-N相应的积累呈现出上升趋势。TVB-N含量的变化常用于评价肉品的新鲜程度，随着TVB-N含量的增长，兔肉新鲜程度下降。由图1可知，在贮藏期内3个部位的兔肉的TVB-N含量显著上升，后腿肌、背最长肌和腹肌的初始值分别为9.91 mg/100 g、10.83 mg/100g、9.59 mg/100g。根据GB 2707—2016[15]的规定，鲜肉的TVB-N含量应≤15 mg/100 g。后腿和腹部在2 d时接近临界值，分别为14.9 mg/100 g和14.64 mg/100 g，而背最长肌在4 d时才接近临界值，为14.46 mg/100g。与后腿和腹部相比，背部肌肉的腐败速度较缓，且从2 d开始TVB-N含量始终小于其余2个部位。结果表明，在4 ℃贮藏条件下，兔肉极易发生腐败变质。
图1 贮藏过程中不同部位兔肉TVB-N含量的变化
Fig.1 The change of TVB-N of different parts from rabbit during storage
注：图中大写字母为组间差异显著性比较，小写字母为组内差异显著性比较。
TBARS值被广泛运用于评价脂质氧化程度。图2反应了兔肉不同部位在贮藏期的脂质氧化程度，由图2可知，3个部位在贮藏期脂质氧化程度显著上升(P<0.05)， 在贮藏终点，背最长肌、后腿肌和腹肌分别达到0.71 mg/kg、0.68 mg/kg、0.76 mg/kg，三者存在显著差异(P<0.05)。在相同贮藏条件下，背最长肌在分割后仅剩单面肌膜，与结构完整的后腿肌相比与环境接触面积更大，更容易发生脂质氧化[16]。汪踔等[17]发现，60日龄的四川白兔腹肌脂肪含量高于背最长肌和后腿肌，这可能导致腹肌的脂肪氧化程度比其余2个部位更剧烈。
图2 贮藏过程中不同部位兔肉TBARS值的变化
Fig.2 The change of TBARS value of different parts from rabbit during storage
注：图中大写字母为组间差异显著性比较，小写字母为组内差异显著性比较。
LOX酶是一种含铁的双加氧酶，它能催化氧化含有顺，顺-1,4-戊二烯基的多不饱和脂肪酸，生成具有共轭双键的氢过氧化物[18]。氢过氧化物分解能产生醛、酮、酸、醇等小分子物质，使食品具有令人不愉快的气味。由图3可知，兔肉中不同部位的LOX酶活性在贮藏期均出现先增大再减小的趋势，后腿肌和背最长肌在2 d时酶活性最大，而腹肌的峰值出现在4 d。
图3 贮藏过程中不同部位兔肉LOX酶活性的变化
Fig.3 The change of LOX activity of different parts from rabbit during storage
注：图中大写字母为组间差异显著性比较，小写字母为组内差异显著性比较。
这可能与贮藏期兔肉pH值的变化相关，熊国远等[19]研究发现，兔肉在贮藏期pH值先增大再减小，过高的pH抑制了酶的活性。刘奇[20]测定鲟鱼的不同部位的LOX酶活性，在贮藏期表现出与本研究相同的趋势。腹肌在0～4 d酶活性出现陡增，4 d 时超过背最长肌和后腿肌，而背最长肌的酶活性始终小于后腿肌且二者存在相似的变化趋势。兔肉的腥味物质己醛的产生也与LOX酶相关，酶活性的变化与己醛含量的变化存在一定联系。
己醛由不饱和脂肪酸分解产生，被描述为青草味，其含量的变化常作为食品脂质氧化程度的监测指标，在短期贮藏(0～6 d)时，己醛可以作为肉品风味恶化的主要指标[21]。由表1可知，腹肌己醛含量呈波动式增长，其含量的增长与脂肪酸的氧化有关。
表1 贮藏过程中不同部位兔肉己醛含量的变化及OAV分析
Table 1 The change of hexanal content and OAV of different parts from rabbit during storage
注：己醛含量用平均值±标准偏差表示，上标字母为同组内差异显著性比较，己醛阈值[23]为4.5 ng/g。
后期的下降可能是由于己醛聚合成具有强烈臭味的环状三聚物——三戊基三噁烷[22]导致的，这与贮藏后期能闻到明显臭味的现象一致。此外，己醛氧化形成己酸也能导致其含量的减少。背最长肌和后腿肌的己醛含量虽然也有先增长再下降的趋势，但变化幅度相对较小。在整个贮藏期，腹肌的己醛含量始终高于其余2个部位，上述现象可能与不同部位的脂质含量有关。
己酸是一种短链脂肪酸，被描述为羊膻味，在新鲜的鸭肉[24]和牛肉[8]中均存在。由表2可以看出，背最长肌和腹肌的己酸含量在贮藏期内整体上呈先下降再上升的趋势，含量减少的原因不明，后期的增长可能是由于肉品腐败微生物污染造成的，此外己醛被氧化也能生成己酸，这与上述己醛含量的下降相符。后腿肌的初始己酸含量最低为3.00 ng/g，贮藏终点时为5.91 ng/g显著高于初始(P<0.05)。比较贮藏期内己酸和己醛的OAV值可知，己酸对腥味的贡献大于己醛。由表1和表2可知，相较于己醛，己酸的波动范围较广，含量受贮藏时间的影响更大。
表2 贮藏过程中不同部位兔肉己酸含量的变化及OAV分析
Table 2 The change of hexanoic acid content and OAV of different parts from rabbit during storage
注：己酸含量用平均值±标准偏差表示，上标字母为同组内差异显著性比较，己酸阈值[25]为1.1 ng/g。
研究发现，在4 ℃贮藏条件下，随着兔肉的腐败加深，兔肉脂质氧化加剧，腥味物质己酸的含量出现先下降再上升的趋势，而另一种腥味物质己醛的含量较稳定，在一个小范围内波动。LOX酶活性在贮藏期呈现先上升再下降的趋势，酶活变化的主要原因是兔肉pH的变化，温度对酶的抑制作用较小。兔肉在贮藏期内腥味物质的变化规律可以为提高兔肉品质提供理论依据。在本研究中，己醛的含量没有随脂质氧化的加剧而不停增长，这与其他文献报道不同，可以进行更深入的研究。
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ZHOU Xinya1, HE Zhifei1,2, WANG Zhaoming1, GAN Xiao1, LI Hongjun1,2*
1 (College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China) 2 (Chongqing Special Food Engineering and Technology Research Centre, Chongqing 400716, China)
ABSTRACT In order to promote the commodity value of rabbit meat, this study evaluated the changes in hexanal and hexanoic acid contents as well as other indicators in longissimus dorsi muscle, abdominal muscle, and hind leg muscle of rabbit meat during chilled storage at 4 ℃ for 10 d. Total volatile basic nitrogen (TVB-N) indicated the freshness of rabbit meat, thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) value and lipoxygenase (LOX) activity indicated the degree of fat oxidation. The results were as follows: TVB-N and TBARS increased significantly with increasing storage time (P<0.05). TVB-N in hind leg muscle, abdominal muscle and longissimus dorsi muscle was close to the national standard on day 2 and day 4. Lipoxygenase (LOX) activity in different parts increased first and then decreased during storage. The content of hexanal in abdominal muscle increased significantly (P<0.05), while its content in longissimus dorsi muscle and hind leg muscle changed slightly and was always lower than that of abdominal muscle. The content of hexanoic acid in all three parts significantly decreased and then increased, but only the hind leg muscle had an end point that was significantly higher than the initial value (P<0.05). In summary, refrigeration can inhibit odor formation in different parts of rabbit meat at the beginning of storage as well as maintaining the freshness to improve the processing quality of rabbit meat.
Key words rabbit meat; freshness; off-odor compounds; hexanal; hexanoic acid; chilled storage