唐柯1，王茜1，周霞1，金杰2，徐岩1*
1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(安徽乳泉酒业有限公司，安徽 怀远，233400)
摘 要 该文采用SPME-GC-MS，对红玛瑙石榴发酵过程不同时期香气成分进行测定分析，结果表明，在石榴酒发酵全过程中，共检测出 123种游离态物质。发酵初始(石榴汁)共检出 25种，发酵第1天到发酵结束时第8天分别检出 29、44、55、59、64、63、67、67种。在石榴果酒的发酵过程中，很多来源于石榴汁中的香气物质发生了迁移，随着发酵的进行，石榴酒中挥发性风味物质的种类也愈发增加。酯类、醇类、酸类无论是数量还是相对含量在整个发酵过程中一直均处于较高的水平。醛类、酮类、烷烃类等化合物则随着发酵的进行相对含量显著降低。此外，萜烯类化合物种类显著增加。该研究明确了石榴果酒酿制过程中香气物质组成的变化规律。
关键词 石榴酒；发酵过程；香气物质；变化规律
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.019114
第一作者：博士，副教授(徐岩教授为通讯作者，E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn)。
基金项目：国家轻工技术与工程一流学科自主课题(LITE2018-12)
收稿日期：2018-10-20，改回日期：2018-12-21
石榴(Punica granatum L.)系石榴科石榴属，落叶灌木或小乔木，果实富含糖类、氨基酸、维生素和矿物质等营养物质，有温补、软化血管、降低血糖、血脂以及延缓衰老之功效[1]。石榴在我国已有两千多年的栽培历史，安徽是我国石榴五大主要产区之一，犹以安徽怀远的玉石籽、红玛瑙、大笨子、青皮糙等闻名[2]。石榴酒是以石榴为原料经破碎、榨汁、低温发酵、陈酿老熟而成，果香浓郁、口味酸饴、酒体醇厚的低度果酒，备受人们青睐[3-4]。石榴果酒酒精度低，营养价值高，风味独特，成为提高石榴附加值、石榴深加工的首选方向[5]，同时也积极响应国家酿酒行业提出的“高度酒向低度酒转变”、“蒸馏酒向酿造酒转变”、“粮食酒向果露酒转变”的倡导。石榴酒不仅风格独特，更具有丰富的营养价值，以及较高的保健作用，符合现代人们追求高质量生活的要求，市场潜力巨大。风味是决定酒类品质的核心因素[6-8]，因此对风味物质的剖析也是实现石榴酒风味调控、品质提高的基础。
目前国内外对于石榴酒相关研究已逐渐展开，ANDREU-SEVILLA等对石榴汁和石榴酒中挥发性化合物进行测定分析，发现在石榴汁中，萜烯类的柠檬烯是最丰富的挥发性化合物，而葡萄酒的挥发性成分则大不相同，辛酸乙酯明显占主导地位[9]。WASILA等研究了石榴皮对果汁及酒感官、多酚组成和抗氧化能力的影响，结果表明，带皮榨汁使果汁变苦变涩，但对石榴酒的感官品质有较好的改善作用，此外果皮可以贡献更多的总酚以及类黄酮[10]。而国内的研究大多侧重于对石榴酒工艺、抗氧化及功能成分方面的研究，如张宪宇[11]对石榴酒发酵工艺进行初探，研究了酵母的选择、加糖和果汁的澄清等，并且酿造出了石榴发酵酒；刘月永等[12]在对酿酒酵母的选择、发酵温度以及SO2的添加这类研究的基础上，酿制出了体积分数12%的干型石榴酒；唐虎利等13]以石榴为原料，采用短时浸渍控温发酵生产石榴发酵酒，再将其加工，得到了石榴干红酒；杜琨等[14]采用石榴果全汁低温发酵，并研究了其发酵温度、时间等，酿造出了低度的石榴果酒；田晓菊等[15]研究了影响石榴酒在发酵过程中甲醇和杂醇油生成量的影响因素，发现在相同条件下，甜石榴汁不仅比酸石榴汁会发酵得彻底，而且其中甲醇、杂醇油的含量也比酸石榴汁高；甲醇和杂醇油的含量与发酵温度呈现正相关性。而有关风味物质特别是石榴酒酿造过程中的香气动态变化规律则鲜有人探究[16]。
因此，本课题以安徽怀远红玛瑙石榴为试材，采用SPME结合GC-MS，对红玛瑙石榴酒发酵过程不同时期香气成分进行测定分析，研究石榴果酒酿制过程中香气物质组成的变化，以及香气成分的动态变化规律，以期为石榴果酒酿造工艺的进一步改进以及发酵过程中的风味控制提供理论依据。
石榴样品由安徽乳泉酒业有限公司提供，品种为红玛瑙石榴。石榴酒发酵期间样品：从加入酵母起，每隔24 h取样1次，直至发酵结束。
2-辛醇、甲醇、二氯甲烷(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；无水NaCl、Na2HPO4、柠檬酸、偏重硫酸钾(分析纯)，上海国药集团试剂有限公司。
Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；固相萃取装置，美国Supelco公司；GC 6890N-MSD 5975气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司；DB-FFAP毛细管柱，美国Agilent公司；DC-12型氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司。
1.3.1 石榴酒的酿制
工艺流程：
石榴→清洗去皮→压榨取汁→澄清杀菌(偏重硫酸钾，60 mg/L)→接种酵母(D254, LAFFORT)→控温发酵(26～28 ℃)→过滤装瓶→石榴酒
1.3.2 理化指标的测定
总糖、总酸、pH、酒精度的测定参照GB/T15038—2006进行[17]。
1.3.3 萃取方法及仪器条件
检测方法在MA等[18]的方法上稍作变动。采用固相微萃取三相头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)来吸附香气化合物。取8 mL石榴酒样品置于20 mL顶空样品瓶中，加入3 g NaCl。在50 ℃下预热平衡5 min， 随后打开电磁搅拌器，将转速调至400 r/min，插入刻度调至2.0的萃取头，搅拌萃取45 min。
GC运行条件：样品经过DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm I.D.，0.25 μm)分离；进样口的温度为250 ℃， 不分流；载气为He，流速为2 mL/min；柱温升温程序：初始温度为50 ℃，稳定2 min后，以6 ℃/min的速率升温至 230 ℃，并保持15 min。分离后的样品，经过MSD5975检测。
MS运行条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度为 230 ℃，扫描范围设定30.00～500.00 amu。每个样品重复测定3次，取均值。
1.3.4 物质定性与相对定量
物质定性：香气活性成分的定性，通过与NIST 05质谱库(Agilent Technologies Inc.)中标准谱图进行检索比对，并根据改进的Kovats法计算得到各物质保留指数(RI)进行确认[19]。
组分峰面积的相对含量：在顶空瓶的待测样品中加入内标(2-辛醇，100 mg/L)，进行GC-MS分离。计算如公式(1)。
(1)
式中：Xi-待测物质相对含量；Cs -内标物质浓度；Ai -待测物质峰面积；As-内标物质峰面积。
对发酵前后石榴汁及石榴酒理化指标进行测定分析，结果表明(表1)，发酵前石榴汁的总糖为(121.97±1.56)g/L，pH为4.21，总酸(以柠檬酸计)为(5.97±0.23) g/L；发酵结束后残糖降为(2.05±0.17) g/L，从残糖含量可以看出发酵顺利，达到了干型石榴果酒的要求。酒精度为(6.60±0.32)%(体积分数)，总酸为(6.52±0.31) g/L，发酵过程中酸度略有增加，与前人的研究结果基本一致[20]。
表1 石榴(汁)酒理化指标分析
Table 1 Analysis of physical and chemical indexes of pomegranate wine (juice)
采用质谱谱库、保留指数比对的方法，鉴定出石榴酒发酵过程中游离态挥发性化合物的情况，香气化合物及其相对定量详见表2。
在石榴酒发酵全过程中，共检测出123种挥发性化合物。石榴酒发酵过程中，挥发性化合物各类型化合物的检出数量见表3。其中，发酵初始(石榴汁)共检出25种，而随着发酵的进行检出的挥发性化合物种类也随之增加。发酵第1天共检出29种，发酵第2天共检出44种，发酵第3天共检出55种，发酵第4天共检出59种，发酵第5天共检出64种，发酵第6天共检出62种，发酵第7天共检出67种，发酵第8天共检出67种。即从发酵第1天开始，挥发性化合物种类不断增加，在发酵第5天时，挥发性化合物种类可以检测到64种，随后基本趋于稳定一直到发酵结束。由表3可以看出，发酵结束时酯类物质的种类最多，为34种，占到了总检出个数的53%，其次是醇类物质，共检出14种。本研究的结果也与李美萍等的研究结果基本一致，李美萍等采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法分析石榴酒中挥发性化合物，总共确定了67种挥发性化合物，其中酯类物质23种，醇类物质16种[21]。
表4是石榴酒发酵过程中各类型化合物相对定量，醇、酸、酯三大类物质基本都是随着发酵的进行含量也随之增加，特别是发酵第3天，酯类物质含量较之前显著增加，最终从发酵初始的163.09 μg/L上升到发酵结束后的1 928.48 μg/L，相对含量增加了将近12倍。酯类物质中，乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯相对含量均有显著增加。醇类、酸类物质的含量也线性上升，醇类物质总量从发酵初始的282.94 μg/L升至发酵第8天的1 540.29 μg/L。醛类、酮类、烷烃类等挥发性化合物在整个发酵过程中，相对含量显著降低。LAN等对石榴酒发酵过程中风味及抗氧化活性变化进行研究，他们发现风味质量的主要变化发生在发酵初期，特别是发酵0～4 d，发酵显著降低了醛、酮、杂环和芳香族化合物的相对含量，但促进了酯类和醇类的生成。本研究结果与之基本一致[22]。
此外，在石榴酒中还检测到一类比较重要的香气物质—萜烯类物质。萜烯类化合物通常含量不高但是阈值较低，对香气的贡献很大，代表着水果的品种香[23]。由表3、表4可以看出，萜烯类化合物虽然总量上较发酵初始相差不大，但是种类上明显增加。石榴汁中只检测到β-蒎烯1种萜烯，而发酵结束后检测到了香茅醇、α-萜品醇、柠檬烯等6种萜烯类化合物。萜烯类化合物在水果中通常都是以糖苷结合态形式存在的[24]，在发酵过程中通过酶解或者酸解释放成可以感知的游离态香气物质[25]。
表2 石榴酒发酵过程中的挥发性香气化合物及其相对定量 单位：μg/L
Table 2 The relative amount of aroma compounds during pomegranate wine fermentation
续表2
续表2
注：RI-计算出的保留指数；RIL-文献中查阅出的保留指数；“-”，未检测到。
表3 石榴酒发酵过程中各类型香气化合物检出数量
Table 3 The quantity of different types of aroma compounds during pomegranate wine fermentation
表4 石榴酒发酵过程中各类型香气化合物相对定量
Table 4 The relative amount of different types of aroma compounds during pomegranate wine fermentation
本课题采用SPME-GC-MS，对红玛瑙石榴发酵过程不同时期香气成分进行测定分析，研究石榴果酒酿制过程中香气物质组成的变化及动态变化规律。在石榴酒发酵过程中，很多来源于石榴汁中的香气物质发生了迁移，随着发酵的进行，石榴酒中挥发性风味化合物也愈发增加。在石榴酒发酵全过程中，共检测出 123种挥发性风味化合物。发酵初始(石榴汁)共检出 25种，发酵第1天到发酵结束时第8天分别检出 29、44、55、59、64、63、67、67种。在这些挥发性风味化合物中，酯类物质含量不断增加，其中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯相对含量均有显著增加。醇类物质与酸类物质随着发酵的进行，相对含量也快速增加；醛类、酮类、醚类、烷烃类等物质相对含量则持续下降。此外，萜烯类化合物虽然总量上较发酵初始相差不大，但是种类上明显增加。
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TANG Ke1，WANG Xi1，ZHOU Xia1，JIN Jie2，XU Yan1*
1 (Key Laboratory of Industrial Biotechnologyof Ministry of Education, State Key Laboratory of Food Science & Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2 (Anhui Ruquan Liquor Company Ltd., Huaiyuan 233400, China)
ABSTRACT Analysis of flavor compounds is a basis for regulating pomegranate wine flavor and improving its quality. This study analyzed the aroma compounds of pomegranate wine at different fermentation stages by solid phase microextraction combined gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS). The results showed that during the whole fermentation process, a total of 123 free compounds were detected. Among them, twenty-five compounds were detected at the beginning of fermentation. There were twenty-nine, forty-four, fifty-five, fifty-nine, sixty-four, sixty-three, sixty-seven and sixty-seven compounds detected from the first day of fermentation to the end (day 8). It was found that many aroma compounds migrated from pomegranate juice during fermentation, and the types of flavor compounds in pomegranate wine increased. Esters, alcohols, and acids always existed at high levels during fermentation. In comparison, the relative contents of aldehydes, ketones, and alkanes declined significantly. In addition, the kinds of terpenoids increased significantly. This study clarified the changes in aroma compounds during fermentation process of pomegranate wine.
Key words pomegranate wine; fermentation process; aroma compounds; variation