薛蓓1，罗章1，刘振东1*，李梁1，扎罗2，王波2
1(西藏农牧学院，西藏 林芝，860000) 2(西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏 拉萨，850032)
摘 要 研究采用顶空固相微萃取技术联合气质联用技术分别对松口蘑和红菇蜡伞子实体香气成分进行分析测定和比较分析，以期建立准确、快速、高效的鉴别方法。结果显示，松口蘑检测到74种香气成分，红菇蜡伞检测到72种香气成分，松口蘑相较红菇蜡伞检测到特有的香气成分14种，包括乙醛、庚醛等6种醛类，2(5H)- 呋喃酮1种酮类，3-苯丙醇1种醇类，正己酸乙酯、丙位戊内酯2种酯类，萜品烯和异松油烯等4个烯烃类；红菇蜡伞相较松口蘑，检测到特有的香气成分16种，包括2-丁基-2-辛烯醛1种醛类，3-羟基-2-丁酮、甲基庚烯酮等4种酮类，丁醇等5种醇类，(1-羟基-2,4,4-三甲基戊-3-基) 2-甲基丙酸酯1种酯类，异丁酸、丁酸等3种羧酸类，邻甲酚1种酚类，乙二醇单丁醚1种醚类，N-甲基吡咯烷酮1种含氮化合物。经过主成分分析，得到红菇蜡伞中的主要特征性香气成分为：己醛、3-羟基-2-丁酮、3-辛烯酮、2-甲烯基丁内酯、异戊酸；松口蘑中为：异戊醛、庚醛、壬醛、2,5,2-三甲基吡嗪、2,6，2-三甲基吡嗪。同时对松口蘑与红菇蜡伞干品挥发性香气成分相对含量对比发现，松口蘑主要香气成分含量关系为醛类>烯烃类>醇类>酯类，红菇蜡伞主要香气成分含量关系为醛类>醇类>烯烃类>酯类。通过松口蘑与红菇蜡伞子实体干品香气成分的比较分析可为市售的2种产品的快速检验鉴别奠定理论基础。
关键词 松口蘑；红菇蜡伞；挥发性香味成分；顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)；气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018202
第一作者：硕士，副教授(刘振东副教授为通讯作者，E-mail：Liu304418019@126.com)。
基金项目：食品科学与工程重点学科建设(2017ZDXK-01)；西藏自治区自然科学基金(2016ZR-NZ-03)；西藏自治区科技重大专项(XZ201801-GA-15)
收稿日期：2018-07-05，改回日期：2018-09-01
松口蘑(Tricholoma matsutake)又名松茸，是一种与松属或栎属植物共生形成的外生菌根食用菌[1-2]，松口蘑具有丰富的营养价值、浓郁的风味和广泛的药用及保健作用素有“菌中之王”的美誉[3-5]。松口蘑多糖具降血糖、抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等作用，同时还具有益胃补气、理气化痰等功效[6-8]。淡红蜡伞[ Hygrophorus russula (Fr.)Quél.]别名红菇蜡伞、红青冈,是树木的外生菌根真菌，属真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、蜡伞科(Hygrophoraerae)[9-10]。松口蘑除在我国东北黑龙江吉林有少量分布外，在我国西南地区的云南及西藏两地也有少量分布，其中西藏地区主要集中分布在西藏林芝地区。淡红蜡伞在西藏地区秋季生于波密、林芝、米林等地,海拔2 700～3 800 m的混交林地上，其子实体个体大、肉厚、味较好[9-10]。林芝地区出产的松口蘑由于生产季节较为集中，交通条件较为闭塞，松口蘑除鲜售外，大部分被烘干成干品销售，而松口蘑干品在外观形态上与红菇蜡伞极为相似，所以常有用红菇蜡伞冒充松口蘑销售的情况。快速高效的进行干品松口蘑和红菇蜡伞的鉴别是打击和杜绝这种违法行为的前提，由于二者干品在外观形态上极为相似，所以通过嗅觉器官和相关仪器设备对二者挥发性香气成分的分析，将成为二者高效快速鉴别的首选。
本研究利用具有高选择性、高富集能力、分析快速等特点的顶空固相微萃取(HS-SPME)技术分别提取林芝松口蘑和红菇蜡伞的香气成分，通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪对二者香气成分进行对比分析，为松口蘑的品质评定及与红菇蜡伞的区分鉴定打下基础。
试验所用两类食药用菌子实体(松口蘑、红菇蜡伞)均来自西藏米林县帮仲菌类有限公司。
气相色谱质谱联用仪(Agilent 7890A-5975C GC-MS);气相色谱柱：HP-5MS UI(0.25 mm×0.25 um×60 m,Agilent 19091s-436UI)；CTC前处理平台：CTC RTC(包含热脱附+冷阱模块)
1.2.1 样品的前处理
将帮仲菌类有限公司提供的两类食用菌鲜品清洗，切片后于真空冷冻干燥，粉碎后密封，保存-20 ℃备用。
1.2.2 热脱附条件
取30～50 μL样品于60 μL内衬管中，置于热脱附衬管中，热脱附温度150 ℃，脱附时间5 min；脱附吹扫流速1 mL/min，分流比5∶1，吹扫时间5 min；冷阱捕集温度-20 ℃，脱附温度280 ℃，脱附时间5 min， 脱附后冷阱维持温度120 ℃。
1.2.3 GC-MS条件
GC条件：进样口温度110 ℃，气质接口温度250 ℃， 载气流速1.5 mL/min。
升温程序：初始50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温到100 ℃保持5 min；4 ℃/min升温到140 ℃保持10 min； 4 ℃/min升温到180 ℃保持10 min；4 ℃/min升温到250 ℃保持5 min。
MS条件：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，EI电离70 eV。
1.2.4 化合物鉴定
利用NIST 11.L 谱库的标准质谱图对得到的谱图数据进行串联检索和人工解析(人工比对采用amdis软件比对)，选择匹配度大于80%作为物质鉴定依据。比对有关质谱资料，对基峰、质核比和相对峰度等方面进行分析，结合保留时间和MS对样品中各挥发性成分进行定性分析，采用相互比较的方法确定二者对比情况下的特征性香气成分。釆用峰面积归一化法定量，得到各组分的相对含量(组分峰面积占总峰面积的百分比)。主成分分析采用IBM SPSS Statistic 20.0 软件处理。
松口蘑和红菇蜡伞的气相色谱-质谱(gaschromatography -mass spectrometry，GC-MS)图分别见图1、图2。
图1 红菇蜡伞干品挥发性成分GC-MS总离子流图
Fig.1 The Total ion current chromatograms of volatiles extracted from Hygrophorus russula (Fr.)Quel. by GC-MS
图2 松口蘑干品挥发性成分GC-MS总离子流图
Fig.2 The Total ion current chromatograms of volatiles extracted from Tricholoma matsutake by GC-MS
2种食药用真菌通过4组平行试验，得到其干品挥发性香气组分及相对含量见表1。由表1可知，2种食药用真菌干品共鉴定出91种挥发性化合物，其中红菇蜡伞共鉴定出72种挥发性香气成分，松口蘑共鉴定出74种挥发性香气成分。2种食药用真菌干品中挥发性香气成分：16种醛类，17种醇类，12种酮类，12种酯类，12种羧酸类，8种烯烃类，2 种呋喃类，6种酚类，1种含硫化合物、1种醚类，4种含氮化合物。其中相对含量较高的成分有异戊醛(1.41%～3.91%)、己醛(8.65%～18.97%)、壬醛(4.96%～21.27%)、 3-辛烯酮(0.98%～3.14%)、1-辛烯-3-醇(1.71%～2.18%)、2-乙基己醇(1.27%～4.10%)、正辛醇(0.70%～1.28%)、2-甲烯基丁内酯(1.41%～4.66%)、邻苯二甲酸二异丁酯(1.45%～1.66%)、异戊酸(0.47%～3.60%)、己酸(0.97%～2.65%)、双戊烯(10.53%～11.13%)、2-正戊基呋喃(2.33%～2.45%)；此外，松口蘑相较红菇蜡伞检测到特有的香气成分14种，包括乙醛、庚醛等6种醛类，2(5H)-呋喃酮1种酮类，3-苯丙醇1种醇类，正己酸乙酯、丙位戊内酯2种酯类，萜品烯和异松油烯等4个烯羟类；红菇蜡伞相较松口蘑检测到特有的香气成分16种，包括2-丁基-2-辛烯醛1种醛类，3-羟基-2-丁酮、甲基庚烯酮等4种酮类，丁醇等5种醇类，(1-羟基-2,4,4-三甲基戊-3-基) 2-甲基丙酸酯1种酯类，异丁酸、丁酸等3种羧酸类，邻甲酚1种酚类，乙二醇单丁醚1种醚类，N-甲基吡咯烷酮1种含氮化合物。
表1 红菇蜡伞与松口蘑干品挥发性香气组分及相对含量
Table 1 Volatile compounds and their relative percentage contents identified in two edible-medicinal fungi
续表1
红菇蜡伞与松口蘑干品挥发性香气种类分析及相对含量见图3。由图3可以看出，松口蘑主要香气成分含量关系为醛类>烯烃类>醇类>酯类，红菇蜡伞主要香气成分含量关系为醛类>醇类>烯烃类>酯类；而松口蘑和红菇蜡伞挥发性香气成分的比较可知，醛类化合物在松口蘑和红菇蜡伞中相对含量远高于其他类化合物，其中松口蘑中的醛类物质远大于红菇蜡伞，其相对含量分别为50.85%、31.06%。醇类物质在红菇蜡伞中的含量远高于松口蘑，其相对含量分别为16.95%和8.78%。烯烃类化合物在红菇蜡伞和松口蘑中含量差异不大，其分别为12.65%和14.10%。 排在第4位的化合物是酯类，在红菇蜡伞和松口蘑中分别为9.34%和5.58%。酮类物质在红菇蜡伞中的相对含量(9.33%)高于松口蘑(4.48%)。其次，羧酸类物质在松口蘑中的相对含量远高于红菇蜡伞，相对含量分别为9.46%和2.38%。含氮化合物在红菇蜡伞中的含量(3.46%)大于松口蘑(1.36%)。 酚类物质在红菇蜡伞中和松口蘑中相对含量基本一致，分别为1.82%和1.74%。
图3 红菇蜡伞与松口蘑干品挥发性香气种类分析及相对含量
Fig.3 Classes and contents of volatile compounds identified in two edible-medicinal fungi
为确定红菇蜡伞和松口蘑干品的特征香气成分，选择不同支菌株的红菇蜡伞和松口蘑干品各4组，共计8组菌株，8组菌株样品共检出的91种香气物质含量构成8×91的矩阵，采用IBM SPSS Statistic 20.0软件对其进行分析。如图4所示，红菇蜡伞(即青冈菌)与松口蘑(即松茸)明显分为两类，且松口蘑的4组平行的相似性略优于红菇蜡伞。经过主成分分析，得到红菇蜡伞中的主要特征性香气成分为：己醛、3-羟基-2-丁酮、3-辛烯酮、2-甲烯基丁内酯、异戊酸；松口蘑中的主要特征性香气成分为：异戊醛、庚醛、壬醛、2,5,2-三甲基吡嗪、2,6,2-三甲基吡嗪。
图4 红菇蜡伞与松口蘑干品挥发性香气主成分分析
Fig.4 The key flavor compounds identified in two edible-medicinal fungi
红菇蜡伞在西藏林芝地区又被称为红青冈菌，其干品与松口蘑干品外观极为相似，无良商贩经常将产量较大、价格便宜的青冈菌冒充产量较少、价格较高的松口蘑销售。为防止和杜绝这种乱象的发生，除加大监管和对无良商贩的处罚力度外，快速高效地区分鉴别干品红菇蜡伞和松口蘑才是关键。食药用真菌子实体的特征香气成分一般是由一种或几种具有较高香气值(相对含量/香气阈值)的关键挥发性化合物组成[13-16]，能反映成熟果实的特殊香味，对子实体的风味、品质比较及真伪鉴别起重要作用。本研究发现林芝地区出产的松口蘑与常用来冒充松口蘑的红菇蜡伞相互比较二者均存在的特征性香气成分，其中松口蘑中的醛类物质远大于红菇蜡伞。进一步分析2种食药用菌种的挥发性香气成分，松口蘑检测到乙醛、2(5H)-呋喃酮等14种特有的挥发性香气成分，红菇蜡伞检测到2-丁基-2-辛烯醛1种醛类，3-羟基-2-丁酮等16种特有的挥发性香气成分；经过主成分分析红菇蜡伞中的主要特征性香气成分为：己醛、3-羟基-2-丁酮、3-辛烯酮、2-甲烯基丁内酯、异戊酸；松口蘑中的主要特征性香气成分为：异戊醛、庚醛、壬醛、2,5，2-三甲基吡嗪、2,6,2-三甲基吡嗪。根据其共有特征香气成分的比较分析结果可以很好实现林芝地区干品松口蘑和干品红菇蜡伞的快速鉴别，这对于地理标志产品的保护、对林芝地区食药真菌市场的标准化规范化具有重要的意义。
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XUE Bei1, LUO Zhang1,LIU Zhendong1*,LI Liang1, ZHA Luo2,WANG Bo2
1(Tibet Agriculture and Animal Husbandry University,Nyingchi 860000,China) 2(Institute of Agriculture Science of Tibet Academy of Agriculture and Animal Science, Lhasa 850032,China)
ABSTRACT In order to establish an accurate,rapid and efficient method to authenticate of Tricholoma matsutake and Hygrophorus russula(Fr.)Quel. by using HS-SPME-GC-MS.The results showed that a total of 74 and 72 volatile flavor compounds were identified in Tricholoma matsutake and Hygrophorus russula(Fr.)Quel. Tricholoma matsutake detected 14 kinds of characteristic aroma components, including 6 kinds of aldehydes (such as acetaldehyde and heptaldehyde),1 kind of ketones(2(5H)-furanone), 1 kind of alcohols(3-phenyl-1-propanol), 2 kinds of esters(ethyl caproate and valerolactone), 4 kinds of olkenes (such as g-terpinene,terpinolene).Sixteen kinds of characteristic aroma components were detected in Hygrophorus russula(Fr.)Quel, including 4 kinds of ketones(such as 3-hydroxy-2-butanone, methylheptenone,etc.),5 kinds of alcohols(such as 1-butanol,2-butoxyethanol,etc.),1 kinds of esters(2-methyl-, 1-(2-hydroxy-1-methylethyl)-2,2-dimethylpropyl ester),3 kinds of carboxylic acids (isobutyric acid,butyric acid,etc.),1 kind of phenols(o-cresol),1 kind of ethers(2-butoxyethanol), 1 kind of nitrogenous compounds (1-methyl-2-pyrrolidinone). The key volatile aroma components of Hygrophorus russula(Fr.)Quel were hexaldehyde,3-hydroxy-2-butanone,1-octen-3. one,3-methylenedihydro-2(3H)-furanone,isovalericacid. The key volatile aroma components of Tricholoma matsutake were isovaleraldehyde,heptaldehyde,1-nonanal,2,5-2-methylpyrazine,2,6-2-methylpyrazine. Comparing Tricholoma matsutake and Hygrophorus russula(Fr.)Quel in terms of their relative contents of volatile flavor compounds,the main volatile flavor compounds in Tricholoma matsutake was aldehydes>olkenes>alcohols> esters,the main volatile flavor compounds in Hygrophorus russula(Fr.)Quel was aldehydes>alcohols>olkenes>esters.Based on comparative analysis of volatile flavor compounds of the dried Tricholoma matsutake and Hygrophorus russula(Fr.)Quel, a theoretical foundation for rapid inspection and identification of two kinds of products sold in the market was laid.
Key words Tricholoma matsutake; Hygrophorus russula(Fr.)Quel.; volatile flavor compounds;headspace solid-phase micro-extraction (HS-SPME);gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)