翟红月1，王德萍1，敬思群2*
1(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐， 830046) 2(韶关学院 英东食品科学与工程学院，广东 韶关，512005)
摘 要 以油莎草总黄酮为研究对象，探究其纯化工艺、抑菌性及对牛奶贮藏性的影响。采用AB-8大孔树脂纯化油莎草总黄酮，通过考察静态吸附和动态吸附的条件，确定油莎草总黄酮的最佳纯化工艺；采用抑菌圈法研究了油莎草总黄酮对几种常见菌的抑制效应，并将其加入鲜牛乳中，以酸度、菌落总数为考察指标，研究油莎草总黄酮对鲜牛乳贮藏的影响。结果表明，油莎草总黄酮最佳纯化工艺为进样速度1.0 BV/h、进样质量浓度1.0 mg/mL、洗脱剂体积分数70%、洗脱速度1.5 BV/h，在此条件下，油莎草总黄酮的纯度可达(32.63±0.61) %，相比纯化前提高3.5倍；油莎草总黄酮对革兰氏阳性菌抑制作用最强；添加油莎草总黄酮可降低鲜牛乳的菌落总数及牛乳总酸度，且油莎草总黄酮浓度越大，牛乳酸度变化幅度越小。油莎草总黄酮有助于鲜牛乳的贮藏。
关键词 油莎草总黄酮；纯化；抑菌活性；鲜牛乳；贮藏
第一作者：硕士研究生(敬思群教授为通讯作者，E-mail：jingsiqun@163.com)。
基金项目：国家自然科学基金(31770385)
收稿日期：2018-07-19，改回日期：2018-09-28
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018326
油莎草(Cyperus esculentus L.)为莎草科莎草属多年生草本植物，又被称为油莎豆、人参豆、油莎果、地下板栗等[1]。油莎草原产于非洲地中海沿岸，在含沙60%以上的疏松砂质土壤里结果率可达90%以上，易于存活[2]。然而，人们对油莎草的开发利用多集中于油莎豆油，油莎草地上茎叶利用率较低，造成资源浪费。
油莎草总黄酮是油莎草长期自然选择过程中的一类次生代谢产物。绝大多数黄酮类化合物具有很强的生物活性，可用于药理研究，如抗氧化作用[3-5]、增强免疫调节作用[6]、降血脂作用[7-9]、抑菌作用[10-12]等。油莎草地上茎叶含有黄酮类物质，含量可达13.201 mg/g[13]，且具有很好的抗氧化活性[14]，可促进血液微循环，具有抗凝血作用[15]等。本研究优化了油莎草总黄酮的纯化工艺，探究油莎草总黄酮的抑菌性，并将其添加到牛乳中，以期为油莎草总黄酮作为天然防腐剂提供科学理论依据。这不仅提高了油莎草的附加值，也丰富了食品添加剂市场。
油莎草由新疆克拉玛依汇利有限责任公司提供；油莎草总黄酮，实验室自制(总黄酮提取率为1.46%[16])；芦丁标准品(UV≥98%)，上海源叶生物技术有限公司；无水乙醇、NaOH等试剂均为分析纯；鲜牛乳，市售。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus)、大肠杆菌(Eshrichia.coil)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、青霉(Penicillium)、黑曲霉(Aspergillus nige)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)均由新疆大学生命科学与技术学院微生物实验室提供。
分光光度计(722S型)，上海安亭科学仪器厂；冷冻干燥机，德国SIGMA电仪器有限公司；旋转蒸发器(RE-52AA)，上海亚荣生化仪器厂。
1.3.1 AB-8大孔树脂对油莎草总黄酮的静态吸附实验
(1)吸附实验。准确称取预处理的大孔树脂3.00 g，置于50 mL锥形瓶中，加入20 mL，3 mg/mL油莎草黄酮溶液，30 ℃、110 r/min振荡，每隔2 h测定1次吸附量，并计算吸附率，总黄酮含量参考敬思群等[17]的方法进行测定。以时间为横坐标，吸附率为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线。
(1)
(2)
式中：Q，吸附量，mg/g干树脂；C1，吸附前总黄酮溶液质量浓度，mg/mL；C2，吸附后溶液中总黄酮质量浓度，mg/mL； W，AB-8大孔树脂质量，g；V，溶液体积，mL。
(2)解吸实验。准确称取上述已吸附油莎草总黄酮的饱和树脂3.00 g，加入70%乙醇溶液15 mL，于30 ℃、110 r/min振荡，每1 h测定1次解吸量，以时间为横坐标，解吸率为纵坐标，绘制静态解吸动力学曲线。
(3)
式中：Q，吸附量，mg/g干树脂；C3，解吸后溶液中总黄酮质量浓度，mg/mL； V，解吸液体积，mL； W，树脂质量，g。
1.3.2 AB-8大孔树脂对油莎草总黄酮的动态吸附实验
(1)上样质量浓度对AB-8大孔树脂吸附性能的影响
称取一定量的总黄酮冻干粉配成质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL样液溶液，各取250 mL在柱床体积为250 mL的AB-8大孔树脂上进行上样，吸附流速2 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液无色，收集洗脱液，定容至500 mL，计算吸附率。
(2)进样速度对AB-8大孔树脂吸附性能的影响
取总黄酮质量浓度为1.0 mg/mL的样品液250 mL过柱，流速分别为0.5、1.0、1.5、2.0 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液无色，收集洗脱液，定容至500 mL，计算吸附率。
(3)乙醇体积分数对AB-8大孔树脂洗脱性能的影响
取黄酮质量浓度为1.0 mg/mL的样品液250 mL过柱，吸附流速1BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液无色，再用4倍柱床体积的乙醇洗脱，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%和90%，收集洗脱液，计算解吸率。
(4)洗脱速度对AB-8大孔树脂洗脱性能的影响
取总黄酮质量浓度为1.0 mg/mL的样品液250 mL过柱，吸附流速1.0 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液无色，再用4倍体积的体积分数为70%的乙醇以0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，计算解吸率。
1.3.3 滤纸片法测定油莎草总黄酮的抑菌作用
预先活化供试菌株，并备好培养基平板，制备菌悬液。参考陈凤清等[18]的方法将灭菌后的滤纸片分别浸入不同浓度的提取液和无菌水1～3 h。在无菌操作条件下，分别取0.2 mL各种菌悬液加入已制备好的培养基平板中，涂布均匀。用无菌镊子取浸有提取液的滤纸片贴在含菌平板上，每个含菌平板贴2片，每组3个重复，并用浸有无菌水的滤纸片作对照。贴好滤纸片的平板置于恒温培养箱中培养，最后观察总黄酮的抑菌效果，并测量抑菌圈直径，结果取平均值。
1.3.4 油莎草总黄酮的最小抑菌浓度(MIC)的测定
按照程书朋等[19]的方法并稍作修改，在无菌操作条件下，把质量浓度为1 mg/mL的总黄酮母液分别稀释成50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的系列溶液。向平皿中分别加入不同质量浓度的总黄酮稀释液各2 mL，然后加入不同供试菌悬液0.2 mL，倒入灭菌后的固体培养基(60 ℃左右)，充分混匀，待完全冷却凝固后，倒置于恒温培养箱中培养。以菌落不生长的最低浓度为该黄酮对检测菌的MIC。每个受试样平行重复3次，以不含黄酮的琼脂板作对照。
1.3.5 油莎草总黄酮对牛乳贮藏的影响
(1)油莎草总黄酮在牛乳中的抑菌效果
取100 mL的鲜牛乳2份，其中1份加入0.2 g油莎草总黄酮，另1份作为空白对照，室温放置。每隔 24 h采用平板菌落计数法按照一定的稀释梯度稀释，并涂于固体培养基上，于(36±1)℃培养48 h，测出每板菌落数。
(2)油莎草总黄酮对牛乳酸度的影响
取300 mL的鲜牛乳6份，加入油莎草总黄酮配制成质量分数分别为0、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.8%的溶液，室温放置，每隔24 h采用NaOH滴定法测定1次牛乳酸度。
图1 油莎草总黄酮在AB-8大孔树脂上的吸附动力学曲线
Fig.1 Adsorption kinetics curve of total flavonoids on AB-8 macroporous resin
由图1可知，AB-8型大孔吸附树脂对油莎草总黄酮的吸附趋势先快速增加，然后逐渐趋于平衡，静态吸附起始阶段吸附率较大，2 h后增加趋势变缓，6 h后基本达到吸附平衡。AB-8型大孔吸附树脂对油莎草总黄酮具有良好的吸附动力学特性，适合油莎草总黄酮的分离纯化，这与李超等[20]利用AB-8型大孔吸附树脂纯化大叶金花草总黄酮得到的结果一致。
随后，对上述吸附油莎草总黄酮达到饱和的AB-8大孔树脂进行解吸。由图2可知，静态解吸起始阶段解吸率不断增大，随着时间的延长曲线变得平缓，解吸率变化缓慢，4 h后达到解吸平衡。
图2 油莎草总黄酮在AB-8大孔树脂上的解吸动力学曲线
Fig.2 Desorption kinetics curve of total flavonoids on AB - 8 macroporous resin
2.2.1 上样浓度对AB-8大孔树脂吸附性能的影响
由图3可以看出，随着油莎草总黄酮质量浓度的增加，吸附率逐渐减小，低质量浓度有利于总黄酮的吸附，当总黄酮质量浓度为0.5～1.5 mg/mL时，吸附较为充分，吸附率均高于90%，综合考虑时间等因素，选取1.0 mg/mL为最佳进样质量浓度。
图3 上样质量浓度对AB-8大孔树脂吸附性能的影响
Figure 3 Effect of concentration of the original solution on adsorption properties of AB-8 macroporous resin
2.2.2 进样速度对AB-8型大孔树脂吸附性能的影响
由图4可以看出，AB-8大孔树脂对油莎草总黄酮的吸附率随着进样速度的增加而急速减小，原因可能是流速加快之后导致总黄酮与树脂的接触时间变少，且容易导致进样管的堵塞，使吸附率减小，这与孟宪军等[21]研究AB-8大孔树脂对蓝莓花色苷的吸附结果一致，而当进样速度为1.0 BV/h时，吸附率最高，故取1.0 BV/h为最适进样速度。
图4 不同进样速度对AB-8大孔树脂吸附性能的影响
Fig.4 Effect of flow velocity on adsorption properties of AB-8 macroporous resin
2.2.3 乙醇体积分数对AB-8大孔树脂洗脱性能的影响
由图5可以看出，随着乙醇体积分数的增加，AB-8大孔树脂对油莎草总黄酮的解吸率先增加后减小，当乙醇体积分数为70%时，解吸率较高，乙醇体积分数大于 70%时，解吸率呈下降趋势。可能是由于不同体积分数的乙醇极性大小不同[22]，而体积分数为70%乙醇的极性和油莎草总黄酮的极性更加接近，使其更容易洗脱下来，并且过高的乙醇体积分数，会降低提取出的总黄酮纯度，因此选择体积分数为70%的乙醇为最佳洗脱剂。
图5 不同乙醇体积分数对AB-8型大孔树脂洗脱性能的影响
Fig.5 8 Effect of the ethanol concention on desorption properties of AB-8 macroporous resin
2.2.4 洗脱速度对AB-8型大孔树脂洗脱性能的影响
由图6可以看出，AB-8大孔树脂对油莎草总黄酮的解吸率随着洗脱速度的增加而逐渐减小，当洗脱速度为0.5 BV/h时，解吸率较高，但由于洗脱速度过小导致耗时较长，且对洗脱剂的浪费较为严重；洗脱速度为2.5 BV/h时，解吸速率快，但解吸率最低；洗脱速度为1.5 BV/h时，解吸率较高，且没有明显拖尾现象，故选择1.5 BV/h为最佳洗脱速度。
图6 不同洗脱速度对AB-8大孔树脂洗脱性能的影响
Fig.6 Effect of desorption velocity on desorption properties of AB-8 macroporous resin
油莎草总黄酮的抑菌作用如表1所示，其对细菌有较好的抑制作用，尤其是革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，其中油莎草总黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌圈可达(13.3±0.3) mm；油莎草总黄酮对酵母菌有一定的抑制作用，抑菌圈直径为(8.8±0.5) mm，但对黑曲霉和青霉的抑菌效果不明显。
表1 油莎草总黄酮对试验菌抑菌圈大小的影响 单位：mm
Table 1 Bacteria inhibition effect of total flavonoidsfrom Cyperus esculentus leaves
注：-表示无抑菌圈;+表示抑菌圈不明显。
由表2可知，油莎草总黄酮的质量分数与抑菌效果成正相关，总黄酮质量分数越大，抑菌作用越强，这与魏珂等[23]研究苦瓜籽黄酮的抑菌效果一致。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值均为 6.25%，大肠杆菌的MIC值为12.5%；与细菌相比，油莎草总黄酮对真菌抑菌效果不明显，其中酵母菌的MIC值为25%，对霉菌的抑菌效果不明显。
2.4.1 油莎草总黄酮对牛乳中微生物的抑制作用
由图7可知，随着时间的增加，牛乳中微生物的总菌数呈上升趋势，常温放置7 d后，添加了油莎草总黄酮的牛乳中菌落总数相比空白牛乳中的菌落总数减少了约60%，且随着对试样稀释比例的增加，菌落总数急剧下降，初步表明添加油莎草总黄酮对牛乳中微生物的具有一定的抑制作用。
表2 油莎草总黄酮的MIC
Table 2 MIC of total flavonoids from Cyperusesculentus leaves
注：-表示无菌生长；+表示有少量菌体生长；++表示有不超过 1/3平皿面积的菌落生长；+++表示有不超过1/2平皿面积的菌落生长；++++表示有超过1/2平皿面积的菌落生长。
图7 牛乳中微生物的总菌数测定
Fig.7 Determination of total microorganism in milk
2.4.2 油莎草总黄酮对牛乳酸度的影响
总酸度是评价牛乳新鲜度的重要指标，牛乳挤出后，在存放过程中由于微生物的活动，分解乳糖产生乳酸，使牛乳总酸度升高。由图8可知，添加油莎草总黄酮的鲜乳总酸度的变化相对较小，且随着油莎草总黄酮添加量的增加，牛乳总酸度变化越小，这与项昭保等[24]研究野生橄榄黄酮对牛奶保鲜作用的结果一致。常温放置7 d后，添加质量分数0.8%的油莎草总黄酮的牛乳总酸度相比空白鲜乳降低了50%，证实了其对牛乳中微生物的活动起到抑制作用，而且油莎草总黄酮的抑菌作用与其质量分数成正相关。因此，将油莎草总黄酮作为天然防腐剂应用于牛乳保鲜中具有一定的推广意义，可以提高油莎草的经济价值。此外，油莎草总黄酮在牛乳保鲜中的最适添加量、温度等条件还需进一步探讨。
图8 油莎草总黄酮对牛乳酸度的影响
Fig.8 Effect of total flavonoids on milk acidity
AB-8大孔树脂纯化油莎草总黄酮的最佳工艺为进样速度1.0 BV/h、进样质量浓度1.0 mg/mL，洗脱剂最适宜体积分数70%、洗脱速度1.5 BV/h，在此条件下，总黄酮最高解吸率可达(94.72±1.21) %。纯化后纯度为(32.63±0.61) %，相比纯化前提高了约3.5倍。油莎草总黄酮对细菌有较好的抑制作用，尤其对革兰氏阳性菌抑制效果更佳，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌MIC值可达6.25%，对霉菌的抑菌效果不明显。此外，添加油莎草总黄酮的鲜牛乳置于常温7 d后，与空白鲜牛乳相比，其菌落总数减少了60%、牛乳总酸度降低了50%，且随着油莎草总黄酮浓度的增加，牛乳酸度变化幅度越小。
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ZHAI Hongyue1, WANG Deping1， JING Siqun2*
1(College of Life Science and Technology, Xinjiang University， Urumqi 830046, China) 2(College of Food Science and Engineering, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)
Abstract Purification process, antibacterial properties of Cyperus esculentus total flavonoids (CETF), and their applications in fresh milk preservation were studied. The AB-8 macroporous resin was used to purify CETF. By examining the conditions of static and dynamic absorption, the optimal conditions to purify CETF was determined. The inhibitory effects of CETF on several common strains were studied using inhibition zone, followed by adding it to fresh milk. The effects of CETF on fresh milk storage were investigated by testing acidity and total number of colonies of milk. The results showed that the optimal purification process for CETF was as follows: injection at 1.0 BV/h, 1.0 mg/mL injection mass, 70% eluent volume, and eluted at 1.5 BV/h. Under this condition, the purity of CETF was (32.63±0.61)%, which was 3.5 times higher than the raw material. The CETF had the strongest inhibitory effect on gram-positive bacteria. The total number of colonies and acidity of milk reduced with CETF. Additionally, the greater the concentration of CETF,the smaller the changes in milk acidity. Overall, CETF has beneficial effects on preserving fresh milk.
Key words Cyperus esculentus total flavonoids; purification; antibacterial activity; fresh milk; storage