由于天然KGM固有的性质，如水中溶解度小、稳定性差、耐酸性弱、易降解等[2]，限制了其在食品工业中的应用。因此，在实际应用中，常通过硫酸化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化、烷基化等[3]方法对KGM改性来改变其理化性质和生物活性，拓展其应用范围，提高其附加值。魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan, KGM)是从魔芋块茎中提取的天然植物多糖，其分子式为由于天然KGM固有的性质，如水中溶解度小、稳定性差、耐酸性弱、易降解等[2]，限制了其在食品工业中的应用。因此，在实际应用中，常通过硫酸化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化、烷基化等[3]方法对KGM改性来改变其理化性质和生物活性，拓展其应用范围，提高其附加值。
目前国内外主要以NaH2PO4与Na2HPO4为酯化剂对多糖进行酯化改性，引入了磷酸基团，可改善其结构和理化性质[4]。其主要采用湿法、干法、挤压法。磷酸魔芋葡甘聚糖酯(konjac glucomannan phosphate ester, KGMP)的生产主要以湿法为主，此法操作简便，反应条件温和，但取代度(degree of substitution, DS)不高，均低于0.06，且需使用大量昂贵的有机溶剂，受KGM水溶性的限制，对酯化反应的规律性缺乏探讨[5-6]；干法改性成本低，取代度高(0.08～0.17)， 但反应不均匀，易产生其他副产物，工业生产时对设备要求较高[7-8]；挤压法由于过高的压力和过度的剪切使KGM黏度降得很低，不能满足应用要求。半干法反应相中水分含量在20%～40%，具有节能、降耗、高效、无废水排放等特点[9]。与传统的加热方式相比，微波具有加热速度快、加热时间短、加热均匀等优点，已作为新型能源广泛用于化学改性中[10-11]。此外，杜先锋等[12]研究表明在一定真空度下，物料内水分扩散速度加快，水分的扩散有利于化学反应的进行。ZHANG等[13]发现真空处理技术形成的内外压差使得淀粉颗粒变得疏松，有利于氧化剂与淀粉充分混合。然而，真空辅助微波半干法用于KGMP的制备，目前国内外尚未见文献报道。
本试验根据前人的研究，从快速、节能、减排及降耗考虑，以KGM为原料，NaH2PO4与Na2HPO4混合盐为酯化剂，采用真空辅助微波半干法制备KGMP，并通过响应面试验优化酯化条件，为环境友好制备高取代KGMP提供理论与实际应用的支撑，促进KGMP作为抗老化剂在冷冻食品中的应用。
魔芋粉(符合NY/T494—2010中普通魔芋微粉标准)，重庆市康佳客有限公司；Na2HPO4(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；NaH2PO4(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；尿素(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；其他化学试剂均为分析纯。
DZ600/2S 型真空包装机，上海人民包装股份有限公司；MAS-Ⅱ型微波快速制样系统，上海新仪化学科技有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；YB-750A 型多功能粉碎机，浙江永康市速锋工贸有限公司；NDJ-5S 型旋转黏度计，上海越平仪器有限公司；UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司；Spectrum 100 红外光谱仪，美国Perkin Elmer公司。
1.3.1 魔芋葡甘聚糖磷酸酯(KGMP)真空辅助微波半干法制备方法
准确称取一定质量的KGM，将NaH2PO4与Na2HPO4混合物(摩尔比2∶1)和尿素用质量分数为30%(以KGM用量计)的蒸馏水配制成磷酸盐水溶液，用3 mol/L 的HCl和3 mol/L的NaOH调节到合适的pH值，将所述悬浊液在搅拌条件下喷入到KGM微粉中，混合均匀，制得半干混合物，放入聚乙烯袋中，用真空包装机真空处理一段时间，然后将样品倒入烧杯中，置于微波反应器中进行微波加热，反应完毕后，将反应完毕的物料用体积分数为50%乙醇进行数次洗涤，再用70%、80%、100%的乙醇进行梯度洗脱，滤去洗液，将滤饼放入45 ℃的鼓风干燥箱中烘干过夜，干燥后的物料经粉碎过100目筛，即得到KGMP白色粉末。
1.3.2 取代度的测定
KGMP的取代度测定主要依据结合磷的含量[14]，结合磷的含量是由总磷减去游离磷的含量得到的。产物总磷含量采用GB5009.87—2016《食品安全国家标准食品中磷的测定》[15]方法进行测定，游离磷测定采用HCl溶解试样，蒸馏水多次洗涤后，过滤后取滤液，进行钼酸铵显色反应。由图1所示的标准磷曲线对应出试样中磷含量，从而求得取代度(DS)，DS按公式(1)计算[6]：
(1)
图1 磷含量标准曲线
Fig.1 Criterion curve of phosphorus content
1.3.3 单因素试验
本试验主要考察微波反应时间、微波反应温度、酯化剂与KGM摩尔比、真空处理时间、pH值、尿素用量对KGM取代度的影响，以方法1.3.1制备KGMP，以方法1.3.2测定其DS，以DS作为评价指标。
1.3.3.1 微波反应时间对取代度的影响
考察微波反应时间分别为5、6、7、8、9、10 min时，对样品取代度的影响。固定酯化剂与KGM摩尔比为0.7∶1、尿素用量6%(质量分数)、pH 5.0、真空处理时间30 s、反应温度90 ℃。
1.3.3.2 微波反应温度对取代度的影响
考察微波反应温度分别为70、80、90、100、110 ℃时，对样品取代度的影响。固定酯化剂与KGM摩尔比为0.7∶1、尿素用量6%(质量分数)、pH 5.0、真空处理时间30 s、 反应时间7 min。
1.3.3.3 酯化剂用量对取代度的影响
考察酯化剂与KGM摩尔比为0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1、1∶1时，对样品取代度的影响。固定尿素用量6%(质量分数)、pH 5.0、真空处理时间30 s、反应温度90 ℃、 反应时间7 min。
1.3.3.4 真空处理时间对取代度的影响
考察真空处理时间分别为0、10、20、30、40 s时，对样品取代度的影响。固定酯化剂与KGM摩尔比为0.7∶1、尿素用量6%(质量分数)、pH 5.0、反应温度90 4 ℃、反应时间7 min。
1.3.3.5 pH值对取代度的影响
考察pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0时，对样品取代度的影响。固定酯化剂与KGM摩尔比为0.7∶1、尿素用量6%(质量分数)、真空处理时间30 s、反应温度90 ℃、反应时间7 min。
1.3.3.6 尿素用量对取代度的影响
考察尿素用量分别为0%、2%、4%、6%、8%时，对样品取代度的影响。固定酯化剂与KGM摩尔比为0.7∶1、尿素用量6%(质量分数)、pH 5.0、真空处理时间30 s、反应温度90 ℃、反应时间7 min。
1.3.4 响应面优化试验
根据中心组合试验设计原理，通过单因素试验对KGMP取代度影响的分析，固定微波功率300 W，微波时间7 min，尿素用量6%(质量分数)。选取磷酸盐用量、pH值、真空时间和微波反应温度为自变量(X)，各分3个水平，以取代度为响应值(Y)，采用Design Expert 8.0软件设计响应面试验方案并对试验结果进行回归分析。试验设计采用4因素3水平的响应面试验(见表1)。
表1 响应面试验设计因素水平取值
Table 1 Coded levels of independent variables used in the RSM design
水平因素A(n(磷酸盐)∶n(KGM))B(pH值)C(真空处理时间)/sD(微波温度)/℃10.6∶14.5209020.7∶15.03010030.8∶15.540110
1.3.5 表观黏度的测定
称取1.0 g KGM和不同取代度的KGMP分散于99 mL蒸馏水中，在60 ℃水浴条件下溶胀1 h，冷却至25 ℃，然后分别用NDJ-5型旋转黏度计在25 ℃恒温下测定溶液的表观黏度。
1.3.6 透光率的测定
称取一定质量的KGMP配成质量分数为1%的溶液，60 ℃水浴条件下溶胀，冷却至室温25 ℃。以蒸馏水为空白，用紫外分光光度计进行全波长扫描其透光率。
1.3.7 傅里叶红外光谱的测定
采用KBr压片法，以空气作为对照，扫描波数范围为400～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描累加32次。
1.3.8 数据分析处理方法
以上试验无特殊说明，均重复3次，结果取平均值。采用SPSS 18.0 软件对数据进行统计分析，Origin 8.0 软件制图，Design Expert 8.0软件进行响应面试验及结果分析。
2.1.1 微波反应时间对取代度的影响
微波反应时间对取代度的影响如图2所示，随着微波反应时间的延长，产物的取代度呈现先上升后下降的趋势。反应时间越长，反应物之间的碰撞几率增加，酯化剂能够充分地与KGM表面的羟基进行反应；当微波时间为7 min时，取代度达到最大值，反应7 min之后，取代度不断降低，原因是KGM表面可及的羟基已经与磷酸根发生了反应，而过多的酯化剂无法接触到活性羟基，并且长时间高温反应使得KGM发生了热降解或其他副反应，从而导致取代度的降低，且产品出现发黄现象[16]。因此，微波反应最佳时间为7 min。
图2 微波反应时间对DS的影响
Fig.2 Effect of microwave reaction time on DS
2.1.2 微波反应温度对取代度的影响
如图3所示，微波反应温度对取代度的影响较大，随着微波反应温度的增加，产物的取代度先增加后降低。反应温度升高会促使KGM分子间的氢键断裂，从而酯化剂与KGM分子的羟基充分接触，有利于亲核酯化反应的进行；此外，温度的升高会使分子运动速率加快，使磷酸盐试剂与分子的碰撞几率增加，有利于磷酸基团与羟基的结合，故取代度也相应地增加[7]。反应温度在100 ℃以上，取代度降低，原因是温度过高焦化严重，影响取代效率和产品质量。所以微波反应最佳温度为100 ℃。
图3 微波反应温度对DS的影响
Fig.3 Effect of microwave reaction temperature on DS
2.1.3 酯化剂用量对取代度的影响
如图4所示，磷酸盐用量对取代度的影响很大。当磷酸盐与KGM的摩尔比低于0.7∶1时，加大磷酸盐的用量，产物的取代度显著增加。当磷酸盐与KGM的摩尔比高于0.7∶1时，磷酸盐再增加，取代度的增加变得十分缓慢。这是因为KGM分子上活性羟基基团数目有限，低剂量的酯化剂范围内，取代度受磷酸盐含量控制，高剂量范围KGM酯化反应所需的磷酸盐以及达到饱和，磷酸盐与KGM的摩尔比高于1∶1后，取代度并不会有较大的提高，只会增加产物中游离磷含量，导致产品颜色发黄，给后面的洗涤工序带来困难[17]。故磷酸盐与KGM摩尔比为0.7∶1为宜。
图4 磷酸盐与KGM的摩尔比对DS的影响
Fig.4 Effect of molar ratio of phosphate and KGM on DS
2.1.4 真空处理时间对取代度的影响
如图5所示，真空处理时间对取代度的影响较大。未真空处理时KGMP的取代度为0.138；当真空处理10 s时，取代度显著增加，为0.163；且随着处理时间增加，取代度呈现增加的趋势。这可能是因为在一定的真空度下处理KGM，产生的内外压差可使KGM颗粒结构蓬松，KGM分子上的-OH充分暴露出来；另一方面，内外压差还会促使反应相中反应物彼此混合均匀，提高KGM酯化反应效率[13]。真空处理时间太长使混合物结块，在微波加热时易产生焦糊现象，故真空处理时间为30 s为宜。
图5 真空处理时间对DS的影响
Fig.5 Effect of vacuum treatment time on DS
2.1.5 pH值对取代度的影响
酯化反应的过程中，适量的氢离子能够促进酯化反应，pH低于3.0时，KGM会出现碳化的现象[18]。此外，pH在4.0～5.0，磷酸盐的溶解度为20%～36%，当pH大于6.0时，磷酸盐的溶解度为13%[19]。故选取对pH值3.5～6.0进行单因素试验。如图6所示，随着pH值的增加，取代度先增加后降低。当pH值较低时，KGM适度降解，暴露出更多的活性羟基基团，且分子间相互作用力减弱，有利于酯化反应；当pH值大于5.0后，磷酸盐的溶解度降低，且其存在形式发生变化，导致DS下降。故pH值为5.0左右最佳。
图6 pH值对DS的影响
Fig.6 Effect of pH value on DS
2.1.6 尿素含量对取代度的影响
尿素作为催化剂，能够促进KGM分子中的葡萄糖、甘露糖残基打开氢键，游离出羟基，加快酯化反应速度[6,20]。如图7所示，随着尿素含量的增加，取代度随之增加，当尿素含量达到6%(质量分数)后，尿素自身与KGM发生反应，从而与磷酸盐之间竞争羟基，取代度不再增加。因此尿素含量为6%(质量分数)为宜。
图7 尿素含量对DS的影响
Fig.7 Effect of urea content on DS
按照中心组合试验设计，设定不同A：正磷酸盐与魔芋葡甘聚糖的摩尔比、B：pH值、C：真空处理时间、D：微波温度。试验结果见表2。多元回归拟合所得取代度(DS)的二次多项回归方程为公式(2)：
DS=0.20+0.000 333 3A-0.007 333B+0.001 333C-0.000 5D-0.026AB-0.004 75AC+0.006 75AD+0.023BC+0.001BD-0.005 75CD-0.012A2-0.053B2-0.013C2-0.014D2
(2)
表2 基于4因素3水平的响应面分析中心组合设计实验结果
Table 2 Central composite design, experimental data for three-level-four-factor response surface analysis
序号n(磷酸盐)∶n(KGM)pH值真空时间/s微波温度/℃DS10.6∶14.5301000.11920.8∶14.5301000.17230.6∶15.5301000.15340.8∶15.5301000.10450.7∶15.020900.16960.7∶15.040900.18370.7∶15.0201100.17980.7∶15.0401100.170
续表2
序号n(磷酸盐)∶n(KGM)pH值真空时间/s微波温度/℃DS90.6∶15.030900.176100.8∶15.030900.163110.6∶15.0301100.169120.8∶15.0301100.183130.7∶14.5201000.161140.7∶15.5201000.100150.7∶14.5401000.120160.7∶15.5401000.151170.6∶15.0201000.171180.8∶15.0201000.180190.6∶15.0401000.181200.8∶15.0401000.171210.7∶14.530900.144220.7∶15.530900.130230.7∶14.5301100.134240.7∶15.5301100.124250.7∶15.0301000.195260.7∶15.0301000.202270.7∶15.0301000.208280.7∶15.0301000.193290.7∶15.0301000.205
由表3可以看出，模型的F值<0.000 1，是极显著的，而失拟项P=0.878 2 >0.05，模型失拟度不显著。这说明该数学模型的建立是高度显著的，具有合理性。即可利用此回归方程确定制备高取代的KGMP的最佳工艺。
通过软件分析确定制备KGMP的最佳工艺，即磷酸盐与KGM摩尔比为0.72∶1、pH值4.93、真空处理时间28.65 s、微波温度100.55 ℃，此条件下由公式算出的KGMP取代度理论值为0.201。根据所得的分析数据进行3组验证试验，验证试验条件为磷酸盐与KGM摩尔比为0.72∶1、pH值5.0、真空处理时间29 s、微波温度100 ℃，KGMP的DS为0.199，测定结果稳定，标准偏差不大，证明该结果合理可靠。
图8显示，未改性的KGM黏度达到39 417 mPa·s，而改性后KGMP黏度均有所下降，且随着取代度的增加，黏度逐渐降低，当取代度为0.199时，KGMP的黏度下降到11 516 mPa·s。这是由于在反应过程中，酸和高温的作用下，使得KGM分子链发生部分断裂，降低其分子质量。与SITOHY等[21]在制备磷酸酯淀粉时结果类似。
表3 方差分析及相关统计参数结果
Table 3 Result of analysis of variance (ANOVA) for quadratic model using DS as response
方差来源平方和 自由度均方 F值Prob > F显著性模型0.024140.001 73971.82<0.000 1∗∗∗A-酯化剂1.333E-0611.333E-0.060.0550.817 9B-pH值0.000 645 310.000 645 326.650.000 1∗∗C-真空时间2.133E-0512.133E-050.880.363 9D-微波温度3.000E-0613.000E-060.120.730 1AB0.0026 0110.002 601107.41<0.000 1∗∗AC9.028E-0519.028E-053.730.074 1AD0.000 182 210.000 182 27.530.015 9∗BC0.002 11610.002 11687.38<0.000 1∗∗BD4.000E-0614.000E-060.170.690 6CD0.000 132 310.000 132 35.460.034 8∗A20.000 935 410.000 935 438.62<0.000 1∗∗B20.01810.018759.75<0.000 1∗∗C20.001 05610.001 05643.60<0.000 1∗∗D20.001 31910.001 31954.45<0.000 1∗∗残差3.390E-04142.422E-05失拟1.738E-04101.738E-050.420.878 2不显著纯误差1.652E-0444.130E-05总和0.02528
注：**为差异极显著(P<0.01)；*为差异显著(P<0.05)。
图8 不同取代度KGMP的黏度
Fig.8 Viscosity of KGMP with different substitution degrees
如图9所示，在200～800 nm，与KGM相比，KGMP的透光率增加；随着取代度的增加，KGMP的透光率增加。这是因为带负电荷的磷酸基团引起的相邻KGMP分子之间产生排斥作用，降低链间缔合，增加了水与KGMP相互作用，形成具有高透光率的胶液[22]。
图9 不同取代度KGMP的透光率
Fig.9 Transmittance of KGMP with different substitution degrees
KGM和取代分别为0.046、0.199的KGMP的红外光谱图如图10所示。KGM在3 100～3 600 cm-1处为-OH吸收峰[7]，890 cm-1表示糖结构中的β-构型[23]，1 740 cm-1和1 240 cm-1处的吸收峰分别为C
O 和C—O的伸缩振动特征峰[5]，表征KGM及取代度分别为0.046、0.199的KGMP存在乙酰基。与KGM相比，不同取代度的KGMP分别在1 400 cm-1出现PO的特征吸收峰[7]，1 248 cm-1处吸收峰明显降低，说明KGM磷酸酯化改性成功。
图10 KGM和KGMP的红外光谱图
Fig.10 FTIR patterns of KGM and KGMP
以NaH2PO4与Na2HPO4混合盐为酯化剂对KGM进行改性，通过真空辅助微波半干法获得了高取代度KGMP。短时真空处理能够显著提高产品的DS；微波加热速度快、加热时间短、加热均匀，反应只需7 min就能制备高取代度的KGMP。真空辅助微波半干法制备KGMP减少了酯化剂流失，同时缩短反应时间，能够达到高效、节能、减排、降耗的效果。
真空辅助微波半干改性的最佳工艺条件:微波时间7 min、微波温度100 ℃、磷酸盐与KGM摩尔比为0.72∶1、真空处理时间29 s、pH值5.0、尿素用量6%(质量分数)，在此条件下KGMP的取代度为0.199。随着取代度的增加，KGMP的表观黏度降低，透光率增加。红外光谱表明KGM分子上成功引入磷酸基团。
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