镇江香醋是中国四大名醋之一[1]，作为传统酸性调味品在人们日常饮食生活中发挥着重要作用[2]。酸味是食醋最重要的味觉特征，而羧酸是影响食醋味觉和口感的重要因素，其中不挥发性有机酸和氨基酸能够调和挥发酸乙酸刺激的酸味，赋予食醋轻柔的口感[3]。
国内外测定醋中不挥发羧酸的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[4]、离子色谱法[5]、液相色谱质谱联用(LC-MS)[6]法、核磁共振[7]等。目前应用HPLC和搅拌棒吸附萃取结合气质联用(SBSE-GC-MS)等方法在镇江香醋中检测到的不挥发酸有：乳酸、焦谷氨酸、草酸、酒石酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸[4]、苹果酸、富马酸[8]、马来酸[9]、苯甲酸、苯乙酸和3-甲硫基丙酸[10]等10余种，应用氨基酸自动分析仪测得各类氨基酸20余种[11]。与HPLC或LC-MS相比，气相色谱-质谱法(GC-MS)灵敏度和分辨率更高，检测限更低[12]。当然，在GC-MS分析前，不挥发化合物须经衍生化处理，增强其挥发性。
在众多衍生化方法中，硅烷衍生化是较为常用的一种手段，已经广泛应用于白酒[13]、烟草[12]、酒醅[14]等多种基质和原料检测中。常用的硅烷衍生化试剂有N-特丁基二甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide, MTBSTFA)、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSTFA)，对检测没有空间位阻的羧酸来说，使用MTBSTFA作衍生化试剂效果更佳[15]。
本研究以市售恒顺镇江香醋为研究对象，采用MTBSTFA硅烷化衍生结合GC-MS检测不挥发羧酸，并进行定量分析，以期更深入地认识镇江香醋中不挥发羧酸的种类组成和含量分布，为食醋的品质提升和工艺改进提供依据。
样品：江苏省恒顺醋业股份有限公司生产的恒顺金梅镇江香醋成品(优级，总酸≥5.50 g/100 mL)，于2018年9月购买自当地超市。
试剂：表1和表2中所有全定量羧酸及同位素有机酸(十六烷酸-d31、十八烷酸-d35、琥珀酸-2,2,3,3-d4)、 MTBSTFA(99.5%)、乙醇、乙腈(色谱级)，美国Sigma-Aldrich公司；NaH2PO4、H3PO4(AR级)，上海国药公司。
Centrifuge 5418冷冻离心机，德国eppendorf公司；N-EVAP111氮吹仪，美国Organomation公司；电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司；GC6890M-MSD5975 GC-MS仪，美国Agilent公司；Waters UPLC H-Class超高相液相色谱仪，美国Waters公司；Millipore-Q超纯水系统，美国Millipore公司。
1.3.1 样品前处理与MTBSTFA衍生化
参考ESTEFAN
A等的前处理和衍生化方法[16]并做适当修改。取100 μL原醋样于1.5 mL微量离心管中，加入250 μL乙腈摇匀，将离心管于4 ℃，10 000 r/min离心3 min，样品去蛋白。取离心后全部上清液于2 mL液相小瓶内，加入10.0 μL内标十六烷酸-d31(终质量浓度100.00 mg/L)，氮气吹干。残余水分通过在瓶中加入50 μL二氯甲烷后继续氮吹至干。最后，在干燥的液相小瓶中加入100 μL的衍生化试剂MTBSTFA和100 μL乙腈并摇匀，于100 ℃ 的烘箱中反应1.0 h，冷却至室温后于24 h内进行GC-MS分析。
1.3.2 GC-MS分析条件
GC条件：色谱柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气(流速1.0 mL/min)；不分流进样；升温程序：65 ℃保持2 min， 以6 ℃/min升温至320 ℃，保持10 min。进样量1.0 μL。
MS条件：EI电离源；电子能量70 eV；发射电流25 μA；离子源温度230 ℃；质量扫描范围35～650 amu。
1.3.3 化合物定性和定量
化合物鉴定：定性结果通过与NIST05a.L数据库(Agilent Technologies Inc.)中标准质谱图比对，并与羧酸标准品衍生后的质谱图和保留时间对比确定。通过对C5～C30正构烷烃混合标样进行相同条件GC-MS 分析计算保留指数[17]。
化合物定量：配制一定质量浓度羧酸标准品母液，进行梯度稀释后经过与样品一致的衍生化处理，采用选择离子模式(SIM)定量，以标准品与内标物质量浓度(100.0 mg/L)之比为纵坐标，峰面积之比为横坐标，绘制标准曲线。通过将样品中化合物与内标的SIM模式下积分峰面积比代入标准曲线得到样品中化合物含量。
1.3.4 去蛋白和衍生化方法回收率测定
在去蛋白之前，分别于100 μL原醋样中加入终质量浓度为57.32、80.25、97.44 mg/L的琥珀酸-2,2,3,3-d4；然后按方法1.3.1去蛋白后，取上清液分别加入终质量浓度为20.33、50.05、79.77 mg/L的十八烷酸-d35，氮吹干后加内标十六烷酸-d31(终质量浓度100.0 mg/L)， MTBSTFA衍生化，接着GC-MS分析。方法回收率的计算见公式(1)：
(1)
式中：p表示方法回收率;c1为样品中检测出的同位素有机酸的浓度;c0为样品中加入的同位素有机酸的浓度。
1.3.5 超高相液相色谱法(UPLC)定量乳酸
参照文献[18]，用超纯水将镇江香醋稀释50倍，取1.0 mL过0.22 μm针头式有机滤头后进行UPLC分析。
色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (i.d 2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)；流动相：20 mmol/L NaH2PO4溶液(磷酸调节pH至2.7)；检测波长：210 nm； 柱温：30 ℃，流速：0.25 mL/min，进样1.0 μL。
标准曲线：用超纯水配制初始质量浓度为5.40 g/L的乳酸标准储备液，并进行梯度稀释，以乳酸峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标建立标准曲线。
镇江香醋经衍生化后，共鉴定出含乳酸在内的61种不挥发羧酸，其中氨基酸17种、芳香酸13种、羟基酸11种、长链脂肪酸8种、二元及多元酸7种(不含羟基)、含硫有机酸1种、杂环酸2种、酮酸1种和1种不挥发酸酯，其中羟基酸含量最高，达16.01 g/L，其次是杂环酸和氨基酸，总含量在500 mg/L以上，二元及多元酸、芳香酸、酮酸，长链脂肪酸总含量次之，在100～ 400 mg/L，含硫有机酸及酯含量最低，小于25 mg/L。
与镇江香醋早期研究结果[2-4, 8-11]相比，新检测到的化合物有2-糠酸、乙醇酸、3-羟基丙酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-羟基-4-甲基戊酸、2-羟基己酸、2-甲基丁二酸、戊二酸、甘油酸、扁桃酸、2-羟基-3-苯丙酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、棕榈油酸、丙三酸、2,6-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、dl-对羟基苯乳酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、阿魏酸、柠檬酸、芥子酸、没食子酸、咖啡酸等24种。
醋中添加琥珀酸-2,2,3,3-d4的回收率为80.44%，表明去蛋白和衍生化方法的总回收率不是太高，但相较于传统添加沉降剂K4Fe(CN)6·3H2O和ZnSO4·H2O 去蛋白方法的回收率(41.30%)已经有了较大的提升[10]；在氮吹衍生化前加入十八烷酸-d35的回收率为94.06%，说明衍生化方法的回收率高。2个回收率比较后发现去蛋白过程有机酸损失率较大，推测可能是由于去蛋白时某些有机酸被包裹于蛋白中或有机酸与蛋白质结合形成了结合态有机酸。
除乳酸含量过高采用UPLC方法定量外，其他化合物均采用衍生化的方法绘制标曲并定量。各羧酸标准曲线线性良好，线性相关系数R2均在0.983 8～0.999 9，回收率在82%～118%(表1和表2)，这些化合物回收率在十八烷酸-d35的回收率上下波动，说明衍生化方法适用于醋中羧酸的检测。
在所有检测到的化合物(表1和表2)中，乳酸(15.86 g/L)含量最高，其次是焦谷氨酸(580.9 mg/L)，含量排第三位的是琥珀酸(273.3 mg/L)，后两种酸是国家标准GB/T18623—2011[19]中镇江香醋的特征有机酸。
质量浓度高于50 mg/L的酸有：精氨酸(187.1 mg/L)、草酰乙酸(150.2 mg/L)、2-羟基-3-苯丙酸(122.3 mg/L)、草酸(97.46 mg/L)、缬氨酸(68.53 mg/L)、半胱氨酸(61.33 mg/L)、丝氨酸(57.76 mg/L)、脯氨酸(56.86 mg/L)。其余酸含量均低于35 mg/L，2,6-二 羟基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸含量最低，为20～308 μg/L，棕榈油酸和没食子酸含量低于定量限。
如表1所示，在镇江香醋中共检测到羟基酸11种，包括首次检测到的乙醇酸、3-羟基丙酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-羟基-4-甲基戊酸、2-羟基己酸、3-羟基-3-甲基戊二酸(共6种)。羟基酸总质量浓度达16.01 g/L，其中乳酸质量浓度最高为15.86 g/L(文献报道乳酸含量为9.53～34.28 g/L[4, 8])，3-羟基-3-甲基戊二酸(33.68 mg/L)和乙醇酸(31.48 mg/L)含量次之。
乳酸来源于产酸菌分解葡萄糖[20]，没有香气但呈柔和酸味，可以减轻挥发性醋酸的刺激性气味和口感[21]。新发现的化合物乙醇酸、3-羟基丙酸、2-羟基-3-甲基丁酸呈酸味，2-羟基-4-甲基戊酸除了呈酸味外还呈甜味[13]。
芳香酸是镇江香醋中除氨基酸外种类最多的一类化合物，共检测到13种(其中酚酸9种)，总含量193.4 mg/L。除苯甲酸、苯乙酸外，其余芳香酸均是首次检测到。鉴定出的酚酸主要为对羟基苯甲酸类(如对羟基苯甲酸、没食子酸、原儿茶酸)和对羟基肉桂酸类(如咖啡酸)，以及酚醚类酸阿魏酸、芥子酸等。这些酚酸和酚醚类化合物是呈涩味的化合物，多具有抗氧化活性，主要通过苯丙酸途径产生[17, 22]。
在芳香酸中，2-羟基-3-苯丙酸(俗称苯乳酸)含量最高，达122.3 mg/L，占芳香酸总含量的63.58%，是以前研究中没有关注的芳香酸。该酸在白酒中曾检测到，呈酸味和涩味，在水中味觉阈值为1 360 μmol/L[13]。
在镇江香醋中检测到的二元酸主要有草酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、戊二酸和2-甲基丁二酸；多元酸是丙三酸。戊二酸、2-甲基丁二酸、丙三酸为首次检测到。该类酸中，琥珀酸(273.3 mg/L)含量是最高的。琥珀酸是三羧酸循环的中间产物，其酸味阈值1 074 μmol/L，涩味阈值84.58 μmol/L[13]。
表1 镇江香醋中不挥发有机酸标准曲线及含量
Table 1 Standard curves and concentrations of nonvolatile organic acids in Zhenjiang aromatic vinegar
序号RI化合物m/z斜率截距R2n回收率/%有机酸质量浓度a/(mg·L-1)羟基酸61 486乳酸(lactic acid)-2TBDMSb-0.009 4-0.099 10.999 7119215.86±0.4281 512乙醇酸(glycolic acid)-2TBDMS2471.429 80.005 50.999 899531.48±0.25141 5793-羟基丙酸(3-hydroxybutyric acid)-2TBDMS2610.158 40.000 60.997 58902.821±0.20151 6022-羟基-3-甲基丁酸(2-hydroxy-3-methylbutyric acid)-2TBDMS2892.681 70.004 70.999 998712.72±0.56161 6502-羟基-4-甲基戊酸(2-hydroxy-4-methylpentanoic acid)-2TBDMS2752.739 20.004 10.999 998123.29±0.12181 6742-羟基己酸(2-hydroxyhexanoic acid)-2TBDMS2751.331 80.063 80.992 3119117.07±0.19271 878甘油酸(glyceric acid)-3TBDMS2311.807 00.004 00.998 371032.842±0.04372 110苹果酸(malic acid)-3TBDMS2872.483 20.032 70.998 1111121.542±0.01492 429酒石酸(tartaric acid)-4TBDMS41712.425 0-0.001 50.996 411905.131±0.01552 6033-羟基-3-甲基戊二酸(3-hydroxy-3-methylglutaric acid)-3TBDMS2731.458 00.004 10.999 998133.68±1.29572 626柠檬酸(citric acid)-4TBDMS5913.052 60.049 50.997 698220.43±0.00
续表1
序号RI化合物m/z斜率截距R2n回收率/%有机酸质量浓度a/(mg·L-1)二元及多元酸131 567草酸(oxalic acid)-2TBDMS2611.387 70.432 40.998 3119197.46±0.05211 744马来酸(maleic acid)-2TBDMS2874.512 3-0.005 50.998 271141.747±0.09221 757琥珀酸(succinic acid)-2TBDMS2891.666 8-0.005 50.999 81195273.3±3.60241 7662-甲基丁二酸(2-methylsuccinic acid)-2TBDMS3036.348 5-0.036 80.993 8111156.004±0.03251 786富马酸(fumaric acid)-2TBDMS2872.717 70.000 80.999 2111184.545±0.15261 854戊二酸(glutaric acid)-2TBDMS3030.972 5-0.004 10.996 811940.939 1±0.06442 374丙三酸(tricarballylic acid)-3TBDMS4611.049 80.006 90.995 58951.019±0.13芳香酸41 453苯甲酸(benzoic acid)-TBDMS1792.788 9-0.023 90.983 888816.48±0.0191 526苯乙酸(phenylacetic acid)-TBDMS1931.806 7-0.000 20.999 3119911.66±0.02281 894扁桃酸(mandelic acid)-2TBDMS2212.256 80.007 90.996 911852.158±0.00332 0372-羟基-3-苯丙酸(2-hydroxy-3-phenylpropionic acid)-2TBDMS3371.679 20.002 00.999 711110123.0±6.51362 102对羟基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid)-2TBDMS3230.822 80.001 80.996 711896.539±0.02382 112对羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)-2TBDMS3090.711 40.002 20.997 7118919.12±0.52462 4002,6-二羟基苯甲酸(2,6-dihydroxybenzoic acid b)-3TBDMSc4390.277 9-0.003 30.992710621.37±5.33512 530原儿茶酸(3,4-dihydroxybenzoic acid)-3TBDMS4390.645 0-0.000 20.993 57840.926 2±0.02542 595dl-对羟基-苯基乳酸(dl-p-hydroxy-phenyl lactic acid)-3TBDMS1471.796 80.010 70.996 711859.458±0.05562 611阿魏酸(ferulic acid)-2TBDMS3651.537 8-0.015 90.991 071103.757±0.09582 760芥子酸(mustard acid)-2TBDMSc3952.497 2-0.000 30.999 08104308.8±5.58592 819没食子酸(gallic acid)-4TBDMS5690.557 9-0.008 60.992 97-<q.l.612 862咖啡酸(caffeic acid)-3TBDMSc4651.713 2-0.001 40.991 578920.02±0.00长链脂肪酸342 081十四烷酸(myristic acid)-TBDMS2852.908 1-0.000 30.999 2111041.316±0.00402 158棕榈油酸(palmitoleic acid)-TBDMS3116.024 6-0.000 20.998 7783<q.l.412 183十五烷酸(pentadecanoic acid)-TBDMS2992.578 30.000 30.998 5111091.519±0.00432 284十六烷酸(palmitic acid)-TBDMS3132.513 3-0.013 30.997 3119229.63±0.12472 409十七烷酸(heptadecanoic acid)-TBDMS3272.351 90.001 90.996 611896.883±0.03482 459亚油酸(linoleic acid)-TBDMS3376.384 20.008 70.995 3118827.83±0.74502 488十八烷酸(stearic acid)-TBDMS3416.803 9-0.004 00.997 91110532.71±0.67522 542油酸(oleic acid)-TBDMS3356.435 90.002 10.996 111935.068±0.04杂环酸11 3622-糠酸(2-furoic acid)-TBDMS1691.944 1-0.001 90.999 31110316.38±0.78291 948焦谷氨酸(pyroglutamic acid)-2TBDMS3002.328 1-0.029 40.995 48107580.9±2.33酮酸101 536草酰乙酸(oxaloacetic acid)-2TBDMS25933.202-0.069 20.986 511112150.2±3.23含硫有机酸31 4073-甲硫基丙酸(3-methylthiopropionic acid)-TBDMS1774.417 4-0.002 60.997 86917.569±0.31酯51 477丁二酸单乙酯(succinic acid monoethyl ester)-TBDMS2034.067 8-0.016 40.999 899824.37±0.01
注：a：数值为3次测量的平均值(即n=3)；b：采用UPLC法定量，浓度单位为g/L；c：浓度单位为μg/L；<q.l.：含量低于定量限；TBDMS：叔丁基二甲基硅烷基(tert-butyldimethylsilyl)，下同。
镇江香醋中首次检测到长链脂肪酸8种，包括5种饱和脂肪酸和3种不饱和脂肪酸，总含量105.0 mg/L，其中十六烷酸、十八烷酸和亚油酸含量较高。这些长链脂肪酸多呈油脂口感[23]，可能来源于酿造过程中脂肪的分解。
醋中检测出2种杂环酸，一种是常见的焦谷氨酸(580.9 mg/L)，另一种为首次检测到的2-糠酸(16.38 mg/L)。 焦谷氨酸呈酸味，阈值30 mg/L[4]，含量远高于阈值，说明其对镇江香醋的酸味有一定的贡献。
另发现一种含硫有机酸，3-甲硫基丙酸(7.569 mg/L)，该物质曾通过SBSE-GC-MS方法检测到过[10]。
新检测到一种酮酸即草酰乙酸(150.2 mg/L)，为三羧酸循环中间产物，可通过转氨基作用偶联尿素循环转化为天冬氨酸、丙酮酸和丙氨酸[24]。
在镇江香醋中共鉴定出17种氨基酸(如表2)，总含量达546.5 mg/L，8种人体必需氨基酸除色氨酸未检测到以外，其余7种都能通过MTBSTFA衍生化方法检测到，总含量119.1 mg/L，占整个氨基酸含量的21.80%。
表2 镇江香醋中氨基酸标准曲线及含量
Table 2 Standard curves and concentations of amino acids in Zhenjiang aromatic vinegar
序号RI化合物m/z斜率截距R2n回收率/%有机酸质量浓度a/(mg L-1)21 384精氨酸(arginine)-2TBDMS2132.537 20.004 10.999 41189187.1±1.0461 508半胱氨酸(cysteine)-2TBDMS2074.571 5- 0.537 20.983 378961.33±0.81101 538丙氨酸(alanine)-2TBDMS1580.117 90.000 90.993 888510.28±0.28111 560甘氨酸(glycine)-2TBDMS2180.240 5-0.002 30.993 981091.579±0.01161 655缬氨酸(valine)-2TBDMS1861.280 10.010 20.995 4811468.53±0.69191 696亮氨酸(leucine)-2TBDMS2000.112 70.000 10.996 9811210.33±0.24201 727异亮氨酸(isoleucine)-2TBDMS2000.113 40.000 90.999 38834.127±0.08231 761脯氨酸(proline)-2TBDMS1841.119 50.010 30.996 189656.86±1.11301 964甲硫氨酸(methionine)-2TBDMS2183.234 40.001 50.999 3118610.92±0.36311 987丝氨酸(serine)-3TBDMS2880.145 30.002 80.997 588257.76±0.27322 018苏氨酸(threonine)-3TBDMS3031.438 10.002 10.996 38951.988±0.00352 085苯丙氨酸(phenylalanine)-2TBDMS3022.314 50.002 70.999 5118418.90±0.15392 154天冬氨酸(aspartic acid)-3TBDMS3020.227 2-0.001 50.990 689213.57±0.16422 273谷氨酸(glutamic acid)-3TBDMS3301.856 30.008 60.998 7811028.17±0.02452 380赖氨酸(lysine)-3TBDMS3003.277 10.022 20.990 081164.330±0.16532 590组氨酸(histidine)-3TBDMS1965.397 2-0.007 90.997 071029.708±0.02612 851酪氨酸(tyrosine)-3TBDMS2443.164 1-0.000 20.997 3101090.990 0±0.00
在镇江香醋中检测到61种不挥发化合物，包括17种氨基酸、13种芳香酸、11种羟基酸、8种长链脂肪酸、7种二元及多元酸(不含羟基)、1种含硫有机酸、1种酮酸，2种杂环酸，还有1种不挥发酸酯，其中新检测到如2-糠酸、乙醇酸、3-羟基丙酸、甘油酸、扁桃酸、对羟基苯乙酸、2,6-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、阿魏酸、柠檬酸、芥子酸、没食子酸、咖啡酸等24种不挥发性有机酸。采用MTBSTFA衍生化定量方法的回收率82%～118%，符合定量要求。研究发现羟基酸含量最高，其次是杂环酸和氨基酸。单个酸中，含量从高到低依次为乳酸、焦谷氨酸、琥珀酸、精氨酸、草酰乙酸和2-羟基-3-苯丙酸(含量大于100 mg/L)。丰富的有机酸和氨基酸构成了镇江香醋的独特风格，后续应侧重单个以及群体羧基酸对镇江香醋口感贡献的研究，为香醋品质提升奠定基础。
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