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多酚是植物体内的次级代谢产物，是具有不同数量羟基芳香环化合物的统称，广泛存在于水果、蔬菜、茶、豆科类以及中草药等植物内。目前多酚类化合物已超过10 000多种，是最大的一组植物化学物质[1]。多酚因具有强抗氧化、抗癌、控制肥胖、缓解抑郁、保护心脏、调节胆固醇水平以及控制高血压和心脑血管疾病等生理功能而成为国内外医药、保健、功能食品研究领域的关注焦点[2-3]。但是食品多酚生理功效的发挥跟其生物利用率有密切关联，会受到食品中其他组分、加工条件、胃肠道消化环境等多种因素的影响，因此，需要对多酚进行生物可利用性研究，以评估摄入后经过胃肠消化/吸收阶段释放的多酚物质能够到达全身循环的量。目前诸多研究表明，食品中多酚类物质会与食品其他成分，如糖类、蛋白质、淀粉以及其他小分子物质发生反应，从而改变多酚在食品体系的存在状态，最终导致其在机体内的生物可利用性发生变化，造成其生理功能的改变。蛋白是食品组分中具有重要生理功能的一大类物质，因此研究食品体系中多酚与蛋白质之间的相互作用及其对多酚生物可利用性的影响，对于提高食品多酚类物质的生物利用性和健康功能性，促进含多酚类健康食品的加工制造具有重要的指导意义。
食品中多酚根据分子质量大小及结构的不同，可以分为两大类，即多酚单体和多酚低聚或多聚体。多酚单体主要为酚酸类(如没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸和鞣花酸等)和黄酮类化合物。黄酮类化合物是由2个具有酚羟基的苯环(A环和B环)通过中央三碳原子(C链)连结组成C6-C3-C6基本碳骨架的一类化合物，根据各环上羟基结合的数目和位置、B环的结合位置、C环是否闭合、是否有双键、聚合度等差异进一步细分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇(儿茶素)、异黄酮、花青素类等。多酚低聚或多聚体为多酚单体的聚合物，包括水解型多酚如没食子单宁和鞣花单宁等，以及缩合型多酚如原花青素等[4]。目前研究与多酚相互作用的食品蛋白主要集中在牛乳蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、蛋清蛋白和肌肉蛋白等，因蛋白二级结构及表面游离氨基酸不同，其相互作用存在较大差异，有研究表明蛋白表面脯氨酸含量越高，更易于同多酚结合[5]。受多酚的多反应活性、蛋白的高度复杂性以及多酚与蛋白种类及反应条件不同的影响，多酚与蛋白之间的相互作用会发生不同程度的改变。多酚结构和环境条件的改变使得对蛋白多酚相互作用的评估更加复杂。目前多酚与蛋白之间的相互作用主要有两类：非共价相互作用和共价相互作用。通常情况下非共价相互作用是可逆的结合过程，相对较弱，而共价相互作用为不可逆的强结合过程，2种结合作用对多酚和蛋白质性质可能产生不同的影响。迄今为止，有关多酚和蛋白质的相互作用研究基本集中在室温和人体生理环境等相对较温和条件下的相互作用，并且主要是以非共价作用为主，共价结合作用报道较少[6]。多酚与蛋白相互作用表征方法主要有荧光光谱、圆二色谱、等温滴定量热、红外光谱、飞行时间质谱、傅里叶红外光谱、电泳等[7-9]。
多酚与蛋白之间的非共价作用主要发生在温和条件下，如自然生理条件(植物细胞内部环境、人体体内环境)以及食品中的一些中低温处理过程，例如巴氏杀菌、预热处理，主要包括氢键、静电吸附、疏水相互作用和范德华力。氢键是多酚上的羟基与蛋白质亲水基团(含N、O或S侧链基团)结合而形成；静电吸附是多酚类物质通过正负离子交换而吸附到蛋白质分子表面，作用强度较弱；疏水相互作用是非极性基团与非极性基团产生的作用力，作用力较强[10]。其中疏水相互作用和氢键是多酚和蛋白质发生非共价结合时的主要作用力。HASLAM等首先提出蛋白质与多酚是以疏水作用和多点氢键结合的“手套—手”反应模式理论：多酚分子的非极性基团向蛋白质分子表面靠近并进入蛋白质分子中疏水基团较集中的部位，然后发生多点氢键结合[11]。刘勤勤等研究了茶多酚与大豆分离蛋白反应的作用力主要是范德华力和氢键，茶多酚与大豆分离蛋白中色氨酸残基发生反应，造成大豆分离蛋白亲水基团暴露，引起大豆分离蛋白的二级结构发生改变[12]。肖建波采用荧光光谱，红外光谱等测定了葛根素和牛血清白蛋白之间的相互作用，研究表明，葛根素进入到牛血清白蛋白分子的内部，形成了葛根素-牛血清白蛋白的配合物从而导致内源荧光淬灭，葛根素和牛血清白蛋白之间主要是疏水相互作用[13]。
通常情况下非共价键作用强度低，容易形成和打开，但多酚-蛋白质非共价相互作用可能导致蛋白质溶解度降低，形成聚集和沉淀，或者对多酚降解产生抑制或促进作用，对多酚分子结构本身无显著影响。綦菁华等采用模拟体系研究发现儿茶素和麦醇溶蛋白聚合主要通过疏水键和氢键连接，浊度增加，并认为蛋白质和酚类聚合会使浓缩苹果汁发生二次浑浊[14]。O’CONNELL等报道，由于儿茶素和β-乳球蛋白间的非共价相互作用，低浓度的儿茶素对β-乳球蛋白溶液的发泡能力和泡沫稳定性有所改善[15]。PRIGENT等发现，牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)和α-乳清蛋白与绿原酸非共价结合对蛋白的溶解度无任何显著影响[16]。相反，乳清蛋白与花青素的非共价结合可以显著降低热、光和酶对葡萄皮花青素的降解作用，且经加热预处理的乳清蛋白对花青素的保护作用优于未加热蛋白，其保护机理可能为蛋白与多酚之间的非共价作用打开需要一定能量，在一定加热条件下并不能完全打开，结合多酚未被降解，达到保护多酚的目的[17]。目前研究的蛋白多酚非共价相互作用主要是在体外温和条件、体内消化环境、血液循环环境下的作用，在食品加工环境条件下相互作用的研究较少，尤其是经过高温热处理、高压处理及其他加工技术处理后，体系中蛋白多酚相互作用的变化不清楚，作用机理尚不明确。虽然本实验室徐洁琼等[18]针对奶茶体系不同热处理条件下多酚与蛋白相互作用做了些分析，发现茶多酚与蛋白之间的相互作用与蛋白种类及热加工条件密切相关，经热处理后茶多酚与蛋白非共价键作用类型和强度均发生不同程度的改变，但是是否有共价作用存在没有进一步分析，热加工导致的多酚蛋白作用发生变化的规律及内在的分子机制仍不明确。
目前研究显示，多酚与蛋白的共价结合可能发生在碱性、氧化酶存在以及高温处理等条件下。在碱性条件下，多酚会裂解以及被氧化成不同形式活跃的亲电性邻醌结构，邻醌环与蛋白的亚氨基或者巯基结合，形成不可逆的共价键[19]。NIKIFORIDIS等研究了在碱性条件下向日葵蛋白分离物与绿原酸的反应，发现蛋白分离物和绿原酸形成有色共价复合物，且共价结合程度与绿原酸用量成正比关系[20]。在高温处理以及极端处理(如高压均质等)条件下，多酚会发生氧化和裂解，蛋白的二级结构也同时改变，氨基酸暴露程度增加，多酚与蛋白之间生成不可逆的化学键[21]。BUDRYN等在90 ℃条件下观察到咖啡提取物与牛奶蛋白之间有少量共价键生成[22]。另外，在有氧及氧化酶存在条件下，多酚被氧化成醌，从而与蛋白亲核加成，形成不可逆的化学键。PRIGENT等研究表明多个绿原酸(chlorogenic acid, CA)可以同时与1个蛋白质分子反应，蛋白与醌的共价作用不仅可能发生在伯氨基上，还可能与半胱氨酸，色氨酸和组氨酸残基的侧链发生作用，多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)氧化CA的反应中，溶菌酶的存在会诱导低二聚体形成[23]。综上所述，多酚和蛋白共价结合程度受外界条件及自身结构影响较大。
多酚与蛋白之间的共价作用对多酚结构无显著影响，但是会对蛋白的热稳定性、乳化性等界面性质以及蛋白质功能及消化率和抗原性产生很大的影响，同时多酚蛋白共价复合物的抗氧化性等功能性质也会发生改变[24-25]。O’CONNELL等认为多酚与牛奶蛋白的共价结合可以提高牛奶的热稳定性[26]。NIKIFORIDIS等通过向日葵蛋白分离物与纯绿原酸的共价结合改变了蛋白质表面的疏水性分布[20]。WU等通过MALDI-TOF-MS和SDS-PAGE研究证明多酚与乳球蛋白的共价作用是通过氨基酸侧链的巯基结合而发生的，多酚与乳球蛋白的相互作用降低了β-乳球蛋白的过敏性和改善其功能特性[24]。LIU等在乙醇-水溶液中研究了玉米醇溶蛋白(zein)与表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)和绿原酸的相互作用，证明了zein-EGCG共价复合物比非共价复合物具有更高的热稳定性和更强的抗氧化活性[27]。目前，对于多酚与蛋白之间共价连接的分析研究依旧处于起步阶段，对于连接方式可能是氨基或者巯基的连接或者加成只是系列实验的推测结果，尚未分离出纯共价结合的产物，未观察到多酚与蛋白分子或者原子结合的构象图，所以对于多酚与蛋白究竟如何共价连接，作用位点、作用环境以及结合强度如何尚不清楚，是今后多酚与蛋白相互作用研究的一个重要方向。
生物可利用性是反映食品中营养和活性组分进入人体内并被吸收利用的难易程度，是营养和活性组分对人体发挥健康功效的前提性条件[28]。多酚的生物利用过程包括人体进食含多酚的食品后，酚类成分经口腔、胃、肠等消化从食品基质中释放出来，然后被肠道表皮细胞吸收进入血液循环分布到达人体不同靶向器官，并经代谢最终排出体外整个过程[29]。生物利用度的高低对于多酚在人体内发挥生理作用和健康功效至关重要。然而目前许多研究显示，食品中的多酚类成分生物利用率较低，很多在10%以下，这严重制约了多酚类物质功能活性的体现及对人体健康的作用。影响食品多酚生物可利用性的因素主要有以下几方面：(1)多酚自身结构特征，包括聚合度、羟基化、甲基化、甲氧基化、酯化度以及酰基化等，结构特性不同，多酚生物可利用性存在很大差别[30]；(2)食品中其他营养成分，如蛋白质、脂肪碳水化合物等[31]生物大分子会与多酚发生相互作用，从而导致多酚的生物可利用性发生改变[32]；(3)肠胃消化生理条件，胃消化和肠道过渡环境导致多酚结构发生改变，从而致使多酚的生物利用度发生改变；(4)加工条件，通常情况下热处理强度越大，多酚因稳定性差而发生降解，从而导致多酚的生物可利用性降低[33]。碱性条件会使多酚结构发生改变，稳定性降低，生物可利用性降低[29]。多酚经消化和吸收后化学结构的变化很可能会影响它们的生物活性，因此多酚在消化系统中的生物可利用性和代谢决定了它们对机体的作用大小。生物可利用性可以通过使用体外模拟消化系统模型、细胞实验、动物实验和人体临床实验来确定，从而评估多酚在体外胃肠道以及动物和人体内的稳定性和生物可利用度[34]。目前提高多酚生物利用性的方法主要包括采用新型的载运系统(如微乳、纳米胶粒、脂质体等)提高酚类在小肠的吸收率[35-36]，对酚类进行结构修饰提高其在消化、代谢中的稳定性[37]以及改变酚类吸收部位等[38]。
食品本身是一个多组分共存的复杂体系，其中蛋白质是食品重要的营养组分。有关食品基质中蛋白组分对多酚生物可利用性的影响研究目前仍然存在争议。多酚与蛋白之间的相互作用受多酚和蛋白种类以及反应条件的影响较大，多酚类化合物与蛋白质相互作用可能会提高或降低多酚的生物利用性或者对其无显著影响，其影响机理可能为蛋白与多酚结合后影响多酚类物质在胃肠道的释放和吸收，从而导致其生物可利用性的差异。本实验室刘婵等研究奶茶模拟体系中茶多酚的生物利用性发现，在体外模拟消化环境下，茶多酚和乳蛋白、消化酶均存在非共价相互作用，且三者间的竞争相互作用随多酚、蛋白和酶种类的不同而不同，对多酚生物利用性的影响也不同，当茶多酚-乳蛋白相互作用力大于茶多酚-消化酶时，茶多酚先与乳蛋白结合，随后消化酶水解蛋白释放茶多酚，从而提高茶多酚的生物可利用性。反之，若茶多酚-乳蛋白相互作用力小于茶多酚-消化酶时，茶多酚先与消化酶作用抑制消化酶活性，从而抑制蛋白水解，致使茶多酚与蛋白结合，降低茶多酚的生物可利用性[39]。DUFOUR等研究了水果和蔬菜中的多酚类物质与蛋白相互作用后在胃肠道消化吸收的生物可利用性，表明牛奶蛋白可以增加儿茶素的生物可利用性[40]。最近的一项研究还表明，向不同的乳制品中添加绿茶多酚可以增强多酚的稳定性和抗氧化活性。他们还指出，乳制品的物理状态是影响多酚生物利用度的重要因素[41]。HELAL等通过研究肉桂饮料中多酚和肉桂醛的体外生物可利用性发现，添加牛奶对多酚生物可利用性没有影响，添加牛奶蛋白质水解物可使多酚抗氧化活性增强[42]。ROURA等观察到类似的结果，他们研究表明，牛奶对食用可可粉中多酚的生物利用度没有显著影响[43]。相反，GREEN等研究发现，儿茶素与蛋白质相互作用使儿茶素衍生物暴露于消化环境中，从而促进了儿茶素衍生物的降解，导致儿茶素的生物利用性降低[44]。本实验室陶亚丹对果奶实际体系的研究发现，添加豆奶和牛奶对不同果汁(苹果汁、葡萄汁、橙汁、柚子汁、猕猴桃汁)中多酚的体外生物可利用性影响不同，添加牛奶可提高葡萄汁、橙汁、柚子汁和猕猴桃汁中总多酚生物利用率13.3%～62.7%，而对苹果汁多酚生物利用性没有显著影响；添加豆奶可提高橙汁和猕猴桃汁多酚的生物利用率20%左右，但使苹果汁和柚子汁多酚生物利用率分别下降26.3%和14.9%，而对葡萄汁多酚生物利用性无显著性影响[17]。牛奶蛋白组分影响多酚生物可利用性结果存在明显差异，除了与采用的生物可利用性体外和体内模型测试方法存在一些差别有关外，很可能主要是由不同体系中蛋白质与多酚分子相互作用的不同从而引起多酚释放和吸收不同所致[45]。
实际上，多酚与蛋白质的结合方式、结合位点和结合强度大小受多种因素影响，如多酚和蛋白质种类、分子结构、分子质量、活性基团、浓度比例以及温度、pH、离子强度等外界条件等[46]。特别是在食品热加工过程中，如热烫、巴氏杀菌、高温灭菌、蒸煮、烘烤、油炸等，多酚和蛋白质分子结构都会发生不同程度的变化，多酚与蛋白的相互作用形式和强度也必然发生不同程度的改变，从而对食品多酚生物利用性造成不同影响。目前关于多酚与蛋白相互作用对多酚生物利用性影响的研究报道不少，多数研究集中在温和条件以及胃肠道消化环境下相互作用的影响，而在食品热加工条件下的研究较少，虽然XIE等和本实验室徐洁琼等通过体外消化模型研究了热处理对奶茶模拟体系茶多酚生物可利用性影响，并发现80 ℃加热处理可以提高奶茶中茶多酚生物可利用性，而100 ℃热处理会降低其生物可利用性[18,47]，但对于加热条件下引起茶多酚生物可利用性发生改变的内在原因没有解释清楚，尤其是热加工诱导的多酚和蛋白分子相互作用变化及其对多酚生物利用性的影响没有进行深入研究。
综上所述，目前对于食品多酚与蛋白相互作用的研究基本限于温和条件和生理条件下，在食品加工环境条件下研究较少，但食品经高温加工处理后，多酚和蛋白质分子结构都会发生不同程度的变化，如多酚化合物在高温下容易氧化并发生聚集或降解反应，蛋白质分子受热后结构也会发生部分展开、变性及不同程度的聚集，因而多酚和蛋白质相互作用也将发生变化。热加工处理后，食品多酚和蛋白相互作用到底发生怎样的变化，存在哪些结合作用，除了非共价键外，有多少共价键结合的形成，热加工强度与相互作用类型和强弱变化有何关系，多酚和蛋白相互作用的变化跟多酚生物利用性的改变之间存在怎样的内在关联，相关方面目前未见更深入的研究。因此，今后需要进一步研究阐明不同热加工条件下多酚与蛋白质相互作用的模式及变化规律及其对多酚生物利用性的影响机制，这对于提高食品多酚的生物利用率和产品健康品质具有重要意义，将为多酚类健康食品的设计制造提供科学依据和理论指导。
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