国际稀有糖协会(International Society of Rare Sugar,ISRS)将稀有糖定义为:自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物[1]。例如,L-葡萄糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖、木糖醇和L-木酮糖等都属于稀有糖[2]。其中,L-木酮糖是一种戊酮糖,还是各种原核和真核生物体内的代谢中间产物[3]。虽然它在自然界中含量稀少,但是却在一些领域发挥着重要的功能和作用。L-木酮糖是α-葡萄糖苷酶的高效抑制剂[4],已有以L-木酮糖作为主要成分的降血糖药物,可以用来降低糖尿病患者血液中的葡萄糖水平[5]。此外,它还可以作为前体物质来生产其他稀有糖,如L-来苏糖[6]、L-木糖[7]和L-核糖[8]。
4-木糖醇脱氢酶又称为L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10),与短链脱氢酶/还原酶家族成员有高度相似性[9],可催化木糖醇与L-木酮糖之间的相互转化。目前,已报道的含有这种酶的细菌分别为噬夏孢欧文氏菌(后改名为菠萝泛菌)(Pantoea ananatis)[10]、产碱杆菌(Alcaligenes)[11]、苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidus)[12]和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)[13]。基于生物转化生产L-木酮糖,主要是通过菌体静息细胞催化氧化底物木糖醇。此方法条件温和、工艺简单,且木糖醇价格相对低廉,因此利用4-木糖醇脱氢酶转化木糖醇是生产L-木酮糖的理想方法[14]。
4-木糖醇脱氢酶的工程菌表达宿主主要为大肠杆菌[15-16],还未有研究表明其在枯草芽孢杆菌中成功表达。并且,我国在稀有糖的研究方面主要集中于木糖醇、赤藓糖醇等[17-20],关于L-木酮糖的研究较少,而其在食品与医药等方面的重要作用不可小觑[21],因此优化具有转化木糖醇生产L-木酮糖能力的菌株,对L-木酮糖的研究具有很大的价值和意义。作者所在课题组前期研究中,实现了4-木糖醇脱氢酶在质粒型枯草芽孢杆菌工程菌中的表达。本实验将对已构建的枯草芽孢杆菌工程菌发酵条件以及静息细胞反应条件进行优化以提高酶活,从而提高木糖醇的转化率和木酮糖得率。
1.1.1 菌株
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主菌株1A751(XDH来源于Pantoea ananatis ATCC 43072)为实验室构建并保存。
L-木酮糖标品,百灵威公司;木糖醇,上海生工;其他试剂,均购买自国药集团(分析纯)。
1.1.2 培养基
平板分离培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,琼脂20。121 ℃灭菌15 min,保温。
(LB)种子培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10。121 ℃灭菌15 min。
基础发酵培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10。121 ℃灭菌15 min。
1.2.1 平板培养
在无菌环境中,用接种环蘸取保藏甘油管中的菌体,平板划线。将平板置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养,封口置常温保藏。
1.2.2 种子培养
在无菌超净台中,挑取平板上的单菌落,接种到含30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中,37 ℃,200 r/min摇床过夜培养。
1.2.3 发酵培养
在无菌环境中,将种子液接种1 mL到含30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中,37 ℃培养12 h,转速200 r/min。发酵培养基结束后,取发酵液离心(5 000 r/min,8 min),弃去离心得到的上清,收集菌体,用生理盐水洗涤2次(5 000 r/min,8 min),洗去发酵液,得到待反应的静息细胞。
1.2.4 静息细胞反应
反应体系:取1 mL发酵菌液12 000 r/min离心,2 min后收集菌体,用等体积20 g/L的木糖醇溶液(用pH 10.0,50 mmol/L的甘氨酸-NaOH溶液配制)重悬菌体。反应条件:37 ℃水浴,反应时间3 h。反应结束后离心(12 000 r/min,2 min),取上清液,通过半胱氨酸咔唑法[22]测定产物L-木酮糖的含量。
酶活力单位定义:每升发酵液每分钟产生1 μmol L-木酮糖所需要的酶量为1个活力单位,以U表示。
半胱氨酸咔唑法测定产物L-木酮糖的含量:静息细胞反应结束后离心,取经过适当稀释的反应上清液,加入0.2 mL 15 g/L的半胱氨酸盐酸盐溶液,6 mL体积分数为70%的硫酸溶液,立即振荡摇匀,再加入0.2 mL 1.2 g/L咔唑酒精溶液,摇匀后放入60 ℃水浴,保温10 min,室温冷却10 min。以木糖醇及反应缓冲液作为空白调零,在560 nm处测定吸光度[23]。通过标准曲线,计算生产的木糖醇含量,进而计算活力。
1.2.5 菌体生长量的测定
取1 mL发酵液,离心(12 000 r/min,2 min)后获得菌体,置于烘箱烘干24 h至恒重,称重,即菌体生长量。
1.2.6 发酵培养基成分和发酵培养条件的影响
通过单因素优化实验确定菌株XDH发酵培养基中的最适碳源、氮源、金属离子、发酵温度、初始pH值、装液量和接种量,以 4-木糖醇脱氢酶活力和菌株生长量(干重)为主要指标。
(1)碳源种类及浓度。选取葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘露醇和甘油10种碳源。
(2)氮源种类及浓度。选取硫酸铵、尿素、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏和氯化铵6种常见微生物发酵所需氮源。在基础发酵培养基的基础上,加入各氮源,以10 g/L胰蛋白胨的含氮量为基准,计算含氮量,使所有氮源含氮量相同。
(3)金属离子种类及浓度。以基础发酵培养基为基础,添加不同浓度的Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+。
(4)发酵培养温度。本实验选取28、37和45 ℃这3个常见的发酵培养温度进行实验。
(5)发酵培养基初始pH值。基础发酵培养基的pH值约为5,因此实验取初始pH值为5、6、7、8、9、10和11。
(6)发酵培养基装液量。分别选取发酵培养基的装液量为10、20、30、40和50 mL。
(7)发酵培养基接种量。种子于培养基中活化培养12 h后,分别取0.3、0.5、1、2、3、4、5、6 mL种子液,接种到发酵培养基中进行发酵培养。
(8)基础培养条件。接种量1 mL/30 mL,培养温度:37 ℃,200 r/min,培养时间12 h。
1.2.7 静息细胞反应条件的影响
为获得较高的转化率,实验研究了反应温度、缓冲体系pH值以及底物质量浓度对转化效果的影响。
底物质量浓度。以pH为10.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液配制浓度为5、10、20、50和100 g/L的木糖醇溶液。
反应温度。分别在25、30、35、37、40、45和50 ℃恒温水浴中反应3 h,检测不同反应温度时的L-木酮糖含量。
缓冲溶液pH值。分别配制pH值为9.0、10.0、11.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液和pH为7.0、8.0、9.0的Tris-HCl缓冲溶液。
2.1.1 碳源的选择
以LB为基础培养基,分别添加20 g/L的葡萄糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘露醇、甘油为外加碳源,测定发酵酶活以及菌体生长量。以LB培养基为对照,酶活及菌体生长量,结果如图1所示。
图1 碳源种类对发酵产XDH的影响
Fig.1 Effects of carbon sources on the production of XDH
由图1可以观察到,首先,与LB培养基相比,外加碳源的菌体生长量均有增长,但增长幅度有所差异;其次,与LB培养基相比,外加葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘油这几种碳源后,发酵酶活有所增长。基础LB培养基的酶活为1.57 U/L,其中添加蔗糖一组的酶活最高,为3.64 U/L,提高2.32倍左右。
确定最优碳源为蔗糖后,分别测定蔗糖质量浓度为5、10、15、20、25、30、40 g/L时发酵液酶活以及菌体生长量,结果如图2。
图2 蔗糖质量浓度对发酵产XDH的影响
Fig.2 Effects of sucrose concentration on the production of XDH
由图2可知,与基础培养基相比,加入蔗糖越多,菌体生长量越大,在15 g/L后菌体生长量保持恒定,不因添加量的增大而增大;但是发酵酶活随着蔗糖的增加,出现先增加后降低,最后趋于平缓的趋势。其中,在25 g/L处发酵酶活最高为4.05 U/L。由此,最优碳源为25 g/L蔗糖。
2.1.2 氮源种类及浓度
本实验选择硫酸铵、尿素、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏和氯化铵6种常见微生物发酵所需氮源进行研究,在基础发酵培养基的基础上,加入上述各氮源,以10 g/L胰蛋白胨的含氮量为基准,计算其他各氮源浓度,使所有外加氮源的含氮量相同。对发酵酶活和菌体生长量进行测定,结果如图3。
图3 氮源种类对发酵产XDH的影响
Fig.3 Effects of nitrogen sources on the production of XDH
由图3可知,上述6种氮源对发酵酶活和菌体生长量均有不同程度的影响。其中,就菌体生长量来看,牛肉膏、酵母膏等有机氮源对菌体生长量的提高有显著影响,而添加了尿素的培养基菌体生长量与基础培养基相比并无显著提高,但是得到的发酵绝对酶活最高;因此,基于显著提高酶活的目的,选择尿素作为最优氮源。
确定了尿素作为发酵培养基的最优氮源后,以1.0、1.5、3.0、4.5、5.0、10.0、15.0、20.0 g/L尿素为梯度优化最适氮源质量浓度,结果如图4。
图4 尿素质量浓度对发酵产XDH的影响
Fig.4 Effects of urea concentration on the production of XDH
从图4可以看到,发酵酶活随着尿素浓度的增大,呈现出先升高后降低、15 g/L后的酶活趋于平缓的趋势。其中,浓度在6 g/L时,发酵酶活显著高于其他浓度,酶活达到4.73 U/L;尿素浓度高于6 g/L时,可能由于高浓度的尿素导致蛋白质变性、失去酶活,因此选择6 g/L的尿素为最优氮源浓度。
2.1.3 金属离子种类及浓度
以基础发酵培养基为基础,添加0.05 g/L的Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+,接种量1 mL/30 mL,37 ℃、200 r/min条件下,培养12 h。对菌株XDH在不同金属离子存在条件下的菌体生长量和所产4-木糖醇脱氢酶的酶活进行考察,分析各金属离子的影响,结果如图5。
图5 金属离子对发酵产XDH的影响
Fig.5 Effect of metal ions on the production of XDH
由图5可知,不同的金属离子对枯草芽孢杆菌的生长及酶活力都会产生一定程度的影响。其中Fe2+会产生显著影响,可能是因为Fe2+是细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分,也是发生有氧氧化的必要因素[24];CaCl2虽然可以降低菌体的自溶,显著提高菌体生长量,这与Ca2+能在发酵中控制细胞的透性有关,但是发酵酶活几乎没有提高[25]。因此,实验进一步研究了Mg2+、Fe2+和Mn2+浓度对菌体所产生的影响。
选取质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 g/L的MgSO4来分析不同浓度的Mg2+的影响,结果如图6。
图6 Mg2+质量浓度对发酵产XDH的影响
Fig.6 Effect of Mg2+ concentration on the production of XDH
由图6可知,不同质量浓度的Mg2+对发酵酶活和菌体生长量均有影响。其中,Mg2+从质量浓度0.05 g/L继续增加会导致发酵酶活降低,而添加0.05 g/L的Mg2+得到的菌体酶活与空白相比提高近10%。因此,选择0.05 g/L MgSO4。
此后,又通过实验分析研究了不同质量浓度Fe2+的影响(图7)。由图7可以看出,Fe2+对发酵酶活和菌体生长量都会有一定程度的影响,随着Fe2+质量浓度的逐渐增大,发酵酶活和菌体生长量的变化趋势都是先提高后降低,两者的峰值均出现在质量浓度为0.01 g/L的点。因此,选择最适的FeSO4质量浓度为0.01 g/L。
图7 Fe2+质量浓度对发酵产XDH的影响
Fig.7 Effect of Fe2+ concentration on the production of XDH
此外,本文同时研究了不同浓度的Mn2+对发酵酶活和菌体生长量的影响(图8)。
从图8可以看出,Mn2+对发酵酶活和菌体生长量有不同程度的影响。其中,随着Mn2+质量浓度的增大,菌体生长量曲线呈先增长后降低的趋势,在0.02 g/L出现最高峰,而此处的发酵酶活远远低于0.01 g/L,所以选择MnSO4的最适添加量为0.01 g/L。
图8 Mn2+质量浓度对发酵产XDH的影响
Fig.8 Effect of Mg2+ concentration on the production of XDH
2.2.1 培养温度
本文选取28、37和45 ℃这3个常见的发酵培养温度进行实验。对菌株XDH在不同温度下的菌体生长量和所产4-木糖醇脱氢酶的酶活进行考察,分析发酵温度的影响。结果如图9。
图9 培养温度对发酵产XDH的影响
Fig.9 Effect of fermentation temperature on the production of XDH
由图9可知,3个常见培养温度条件下,28 ℃的酶活和菌体生长量均为最高值,均远高于37、45 ℃时,因此选择28 ℃为最适发酵培养温度。
2.2.2 发酵培养基初始pH值
基础培养基的初始pH值约为5,本实验通过用NaOH溶液调节发酵培养基的初始pH至指定值,探究了初始pH对发酵过程中菌体的生长量以及发酵酶活的影响,选择了pH为5、6、7、8、9、10、11的7组发酵培养基进行发酵培养,培养结束后进行静息细胞反应测定酶活,同时测定菌体生长量,实验结果如图10。
图10 发酵培养基初始pH值对发酵产XDH的影响
Fig.10 Effect of initial pH of fermentation medium on the production of XDH
由图10可知,随着发酵液初始pH的增大,发酵细胞酶活和菌体生长量的趋势近乎相同,先增加后迅速降低;碱性较强的环境中,发酵酶活和菌体生长量急剧下降,可能是强碱性环境严重影响了枯草芽孢杆菌的正常生长代谢。因此,选择峰值处,即pH 8.0为最适发酵培养的初始pH。
2.2.3 发酵培养基装液量
培养基的装液量主要影响的是培养基中的溶氧量,装液量越大,液体培养基中的氧气含量越小,由于枯草芽孢杆菌是需氧型微生物,因此装液量一定程度上会影响枯草芽孢杆菌的呼吸,从而影响生长代谢。本实验选择了装液量10、20、30、40、50 mL进行比较,培养结束后进行静息细胞反应测定酶活,同时测定菌体生长量选择最适装液量,结果如图11。
图11 装液量对发酵产XDH的影响
Fig.11 Effect of work volume on the production of XDH
由图11可知,首先,绝对酶活和菌体生长量分别都随着装液量的增大先增长后下降,绝对酶活在装液量40 mL后开始出现下降的趋势,而菌体生长量在20 mL后就开始下降,可能是液体溶氧量降低无法满足枯草芽孢杆菌的增值。综上,选择装液量40 mL为最适装液量。
2.2.4 发酵培养基接种量
接种量主要影响微生物生长周期中的迟缓期的长短,适宜的接种量可以使发酵周期缩短,从而提高发酵产酶效率[24]。种子培养基中活化培养12 h后,分别以装液量体积的0.3、0.5、1、2、3、4、5和6 mL/30 mL的接种量接种进行发酵培养。培养结束后进行静息细胞反应测定酶活,同时测定菌体生长量选择最适接种量,结果如图12。
图12 30 mL装液体积下接种量对发酵产XDH的影响
Fig.12 Effect of inoculation quantity on the production of XDH
由图12可知,菌体生长量随着接种量的增大先增加后减少;小于3 mL/30 mL时,相对菌体生长量随着接种量的增大而缓慢增大;大于3 mL/30 mL时,随着接种量的增大而减少。此外,发酵酶活随着接种量的增大呈现先增大后减小的趋势,以接种量1 mL为基准,可以发现接种量为0.5 mL/30 mL时,酶活达到峰值;其中,接种量大于0.5 mL/30 mL时,酶活先呈现快速下降的趋势,后趋于平缓。因此选择接种量为0.5 mL/30 mL为最适接种量。
2.3.1 底物质量浓度
反应体系底物为木糖醇,分别以甘氨酸-NaOH溶液配制质量浓度为5、10、20、50和100 g/L的木糖醇溶液,加入菌体后,于37 ℃水浴3 h,再通过半胱氨酸咔唑酒精法测定产物L-木酮糖的浓度,从而反映不同底物浓度条件下产物产量的差异,结果如图13。
图13 反应底物浓度对木酮糖产量的影响
Fig.13 Effect of substrate concentration on yield ofL-xylulose
反应体系菌体含量均为1 mL基础发酵培养基,即细胞含量基本相同,从图13可以看出,随着底物质量浓度的增加,产物产量呈现先增加后减少的趋势。底物质量浓度小于30 g/L时,细胞与底物的结合逐渐饱和,产量呈现逐渐增长的趋势;底物质量浓度大于30 g/L时,细胞与底物的结合已经饱和,产量降低。因此,选择底物质量浓度30 g/L为静息细胞反应的最适底物浓度。
2.3.2 反应温度
酶参与的催化反应常常对反应温度非常敏感,温度过高或过低会导致酶活显著下降,甚至失活。取反应温度为25、30、35、37、40、45和50 ℃,水浴3 h后通过半胱氨酸咔唑酒精法测定产量,结果如图14。
从图14可以看出,温度对L-木酮糖的生成有很大的影响。随着温度的升高,产量呈现出先增大后减小的趋势。温度低于45 ℃时,温度升高,反应速率加快,底物转化量逐渐增大;而温度高于45 ℃后,可能引起酶的部分变性,导致产量下降。综上,选择45 ℃为最适静息细胞反应温度。
图14 反应温度对木酮糖产量的影响
Fig.14 Effect of reaction temperature on yield ofL-xylulose
2.3.3 缓冲溶液pH值
静息细胞反应过程中需要缓冲溶液来维持体系的pH值的稳定性,本实验选择pH值为9.0、10.0、11.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液和pH为7.0、8.0、9.0的Tris-HCl缓冲溶液分别配制底物质量浓度为20 g/L的反应体系进行静息细胞反应,测定产物质量浓度,结果如图15。
图15 反应缓冲体系对产物产量的影响
Fig.15 Effect of buffer system on yield of L-xylulose
由图15可以看出,用Tris-HCl缓冲溶液所配制的反应体系的L-木酮糖的产量都低于甘氨酸-NaOH缓冲溶液所配制的反应体系的产量,其中缓冲溶液为pH为10.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液时,产物产量最高,pH低于或高于10.0都呈下降趋势。因此,选择pH为10.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液为最适反应缓冲溶液。
含Pantoea ananatis来源的4-木糖醇脱氢酶基因的质粒型枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵的条件:最优培养基配方(g/L):蔗糖25,尿素6,MgSO4 0.05,MnSO4 0.01,FeSO4 0.01;最优发酵条件:初始pH 8.0,装液量为40 mL,接种量为1.67%,发酵温度为28 ℃。通过静息细胞反应得到最优的反应条件:底物质量浓度20 g/L,缓冲溶液为甘氨酸-NaOH溶液(pH 10.0),反应温度为45 ℃。以上条件下得到的最终酶活为5.183 U/L,与LB培养基相比提高231.2%,转化率达17.74%。先前报道的1株可氧化木糖醇转化生产L-木酮糖的菌株ZN-14,利用该菌株的静息细胞以木糖醇溶液(20 g/L,pH 9.0)为底物在37 ℃转化24 h,转化率达26.62%。
虽然本研究中枯草芽孢杆菌的转化率不及巨大芽孢杆菌,但是这株枯草芽孢杆菌为食品级微生物,且在工业上应用广泛,且使用枯草芽孢杆菌静息细胞转化生产L-木酮糖未见相关研究。通过对重组枯草芽孢杆菌生产L-木酮糖发酵条件的优化及静息细胞转化木糖醇工艺的研究,为更进一步研究生物转化法制备L-木酮糖提供新材料,这对稀有糖的研究开发具有重要意义。和化学法合成L-木酮糖相比,静息细胞转化法成本低、方法简单且没有副产物的干扰,易于实现工业化生产,基于长远考虑,生物转化法是最具潜力的,也是L-木酮糖生产技术的主要研究方向。然而,关于这种稀有糖制备的研究报告并不多见,严重制约了这种稀有糖的研究与应用,因此进一步提高L-木酮糖的产量是今后研究工作的方向。
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