真菌毒素是各种霉菌在适宜的温度、湿度及生长基质上产生的高毒性代谢产物，其中，镰刀菌、青霉、曲霉是产生霉菌毒素的主要霉菌[1]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，俗称呕吐霉素，是最常见的真菌毒素之一，属于单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生[2]。DON感染农作物时会加重作物赤霉病的发病程度，降低粮食的产量和品质[3]；而且具有很强的细胞毒性，即使在DON浓度较低的情况下，长期摄入也会损害人类和动物的健康[4]，如发生厌食、呕吐、腹泻、反应迟钝、神经障碍等多种症状[5-7]，严重时还可能使造血系统受到损害从而造成死亡[8]。
DON在全世界范围内对粮食的污染都很普遍，特别是在中国、美国、阿根廷等粮食生产区的污染情况更为突出，有的地区其检出含量最高者可达6.496 mg/kg[9]。中国政府规定面粉、大米、玉米等食品中DON的最高限量为1 mg/kg，动物饲料中DON最高限量为5 mg/kg。该毒素是造成粮食污染的重要原因之一，并逐步蔓延至乙醇发酵工业，被污染的粮食谷物经发酵、蒸馏后，大量DON聚集浓缩在发酵糟液中，严重影响了发酵副产品酒糟蛋白饲料(distillers dried grains with soluble，DDGS)的品质[10]。DDGS是一种高营养价值的动物饲料，积累在DDGS中的毒素可通过食物链传递，最终影响动物和人类的健康，因此寻找一种经济有效的DON脱毒方法十分必要。用紫外光照射[11]、臭氧降解[12-13]、微波处理[14]、加压加热[15-16]等方式对DON进行处理，或使用从自然界中筛选的DON降解菌进行生物降解[17]，均取得了一定的进展。
ClO2是国际公认的安全、无毒的绿色消毒剂，具有强氧化性及广谱杀菌效力，且不会对环境造成二次污染，无“三致效应”(致癌、致畸、致突变)[18]，被广泛地应用于自来水消毒[19-20]、食品保鲜[21]、面粉和纸浆的漂白、医疗灭菌[22]等方面。现已有研究显示，500 mg/L ClO2对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮有较好的降解效果[23]，但就ClO2对DON是否具有同样的降解效果，这方面的研究还很少，本文就ClO2对DON纯品及玉米乙醇发酵糟液中的DON的降解效果作了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
经发酵蒸馏后的玉米乙醇发酵糟液，取样于四川省资阳市银山鸿展工业有限责任公司酒厂；脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品，美国Sigma公司；色谱甲醇、乙腈，成都蜀都有限公司；ClO2粉末(纯度>98%)，北京湘怡源生环保科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱系统(Waters 1525-2998PDA)，美国Waters科技有限有公司；质谱仪(TSQ Quantum Ultra)，赛默飞世纪尔科技有限公司；高速台式冷冻离心机(Centrifuge 5804R)，艾本德(Eppendorf)科技有限公司；超声波清洗仪(PS-20)，洁康有限公司；Oasis HLB固相萃取柱，沃特世科技(上海)有限公司。
1.3 方法
1.3.1 DON标准储备液及工作液的制备
标准储备液：精确称量5.0 mg的DON标准品于5 mL容量瓶中，色谱甲醇溶解，定容后配制成1.0 mg/mL的DON标准储备液，于0～4 ℃冷藏备用。
标准工作液：将DON标准储备液用超纯水稀释为质量浓度0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的标准工作液，现配现用。
1.3.2 不同质量浓度ClO2对DON纯品的影响
准确称取25.0 g ClO2粉末于1 L容量瓶中，用超纯水溶解，定容，配制成2 000.0 mg/L的ClO2浓溶液，避光密封保存，备用。
将ClO2浓溶液用超纯水稀释为质量浓度为50.0、100.0、150.0、300.0、600.0、900.0、1 200.0、1 500.0 mg/L的ClO2处理液，并向其中添加DON纯品，使DON的终浓度为5 μg/mL。室温下避光静置处理，并于12、24、36和48 h分别取样检测DON的含量。
1.3.3 ClO2对玉米乙醇发酵糟液中DON的影响
准确称取5.0 g玉米乙醇发酵糟液，向其中加入5 mL质量浓度50.0、100.0、150.0、300.0、600.0 mg/L的ClO2溶液，室温下避光处理12 h。
12 h处理后，加入20 mL V(乙腈)∶V(水)=84∶16提取液，40 ℃恒温下超声提取30 min，8 000 r/min离心5 min，取6 mL上清液于Oasis HLB小柱上样过滤(小柱提前用3 mL甲醇和3 mL去离子水预活化)，过滤后用3 mL去离子水淋洗柱，空气抽干小柱，2 mL甲醇洗脱，45 ℃氮气吹干，用1 mL色谱甲醇复溶，经0.22 μm有机滤膜过滤后进样检测。
1.3.4 pH值对DON纯品降解的影响
使用pH计对玉米乙醇发酵糟液以及600.0 mg/L ClO2溶液的pH值进行测定。根据pH值测定结果，将600.0 mg/L的ClO2溶液pH值用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液分别调节至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，并向其中添加DON纯品，使DON的终浓度为5 μg/mL。室温下处理12 h，取样检测DON含量。
1.3.5 DON含量的检测
HPLC条件[24]：色谱柱：Waters C18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：V(乙腈)∶V(水)=10∶90；柱温：30 ℃；紫外检测波长：218 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。
质谱条件：扫描模式：负离子场扫描；离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子源温度：500 ℃；电喷雾电压：4 500 V；雾化气压力：0.28 MPa；气帘气压力：0.21 MPa；辅助气压力：0.28 MPa；扫描范围：m/z 100～600。
1.3.6 统计分析
对于每组处理，均设置3个平行实验，将来自独立重复实验的数据组合并通过平均值±标准偏差计算。使用SPSS软件通过方差分析(ANOVA)和Duncan的多范围检验(P<0.05)分析所有数据。
2 结果与分析
根据标准工作液HPLC检测结果，DON的保留时间为15 min左右，以DON进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到回归方程为Y=18 835x-5 291.1，R2=0.999 9，在0.1～20.0 μg/mL范围类线性关系良好(图1)。
图1 ClO2处理前后的DON纯品HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of DON pure product before and after ClO2 treatment
2.1 ClO2对DON纯品的影响
用不同浓度ClO2溶液对DON纯品进行处理，DON的降解率随ClO2浓度的提高以及处理时间的延长而提高。如图1-a所示，在处理时间为12 h的条件下，50 mg/L ClO2溶液处理DON纯品，降解率只有2.37%，当ClO2溶液浓度为150 mg/L时，降解曲线斜率最大，降解率增长速度最快，之后逐渐减小，当ClO2溶液质量浓度达到600 mg/L时，降解率为28.23%，当ClO2溶液浓度达到1500 mg/L时，降解率仅为31.97%，降解率增长幅度较小，说明降解曲线逐步趋向平稳，降解率提升缓慢。如图1-b所示，ClO2溶液为质量浓度600 mg/L，处理12 h后降解率为28.23%，处理48 h后降解率提升至38.51%，说明延长时间可以在一定程度上增强对DON的降解效果，但与通过提高ClO2浓度来提高降解率相比，延长时间的效果提升不太明显。因此，综合经济效益及降解效果来看，确定最佳ClO2溶液质量浓度为600 mg/L，处理时间为12 h。
a-处理12 h后不同浓度ClO2对DON的降解;b-不同浓度ClO2在不同处理时间下对DON的降解
图2 不同处理对DON降解的影响
Fig.2 Different treatments on DON
2.2 ClO2对玉米乙醇发酵糟液的影响
由于ClO2的氧化性较强，为了防止过高浓度ClO2溶液以及过长的处理时间影响玉米乙醇发酵糟液的营养成分，结合ClO2对DON纯品的降解效果，选取质量浓度50.0、100.0、150.0、300.0、600.0 mg/L的ClO2溶液对玉米乙醇发酵糟液处理12 h。结果如图3所示，随着ClO2质量浓度的增加，玉米乙醇发酵糟液中DON的降解率逐步提升，当ClO2浓度为100 mg/L时，降解曲线斜率最大；600.0 mg/L的ClO2溶液对其处理12 h后，玉米乙醇发酵糟液中DON含量由13.013 μg/mL降低至7.167 μg/mL，降解率达40.70%，降解效果较好。说明该方法能在一定程度上去除玉米乙醇发酵糟液中的DON。
图3 不同质量浓度ClO2对玉米发酵糟液中DON处理12 h的降解效果
Fig.3 Degradation effect of DON in wet corn distillers
grains by different concentrations of ClO2 for 12 h
注：不同字母表示不同处理组差异显著(P <0.05)。下同。
2.3 pH值对DON纯品降解的影响
根据pH值测定结果显示，600 mg/L ClO2溶液pH值为3.71，而玉米乙醇发酵糟液的pH值为4.82。本文研究了pH值对DON降解的影响实验，结果如图4所示，当DON所处环境溶液pH值小于4.5或大于5.5时，降解率偏低；当DON所处环境溶液pH值为4.5～5.5时，降解效果最佳，降解率最高可达36.78%，但仍低于玉米乙醇发酵糟液中40.70%的DON降解率，说明pH值确实对DON的降解有一定的影响，但pH值不是导致ClO2溶液对玉米发酵糟液中DON的降解效果较好的唯一原因。
图4 pH值对DON纯品降解的影响。
Fig.4 Degradation effect of pure DON in different pH
2.4 降解产物的初步分析
图5的HPLC-MS图谱所示，DON的质荷比为295.17，经600 mg/L ClO2溶液对DON纯品处理12 h后，DON的相对丰度降低，并产生了2种质荷比为238.96和380.90的新物质，推测应该是DON的降解产物。一般情况下，氧环键的化学性质较为活泼，容易断键开环。YOUNG等[25-26]的研究表明，用强氧化剂O3处理单端孢霉烯族毒素时，O3首先攻击单端孢霉烯族毒素分子的双键部位，并且此氧化作用的效果与C8位上的基团有很大关系，当C8位是酮基时，所需O3的量更少。ClO2具有与O3分子类似的SP2杂化轨道和“V”型分子构型，其在发挥强氧化作用时，很有可能出现与O3类似的降解情况[27]。如图5所示，首先ClO2与DON的双建结构发生反应，形成ClO2-DON中间复合物，最后DON在双键处开环降解。此外，在酸性条件下，强氧化剂可以将环己酮氧化为己二酸[28]，ClO2水溶液、玉米乙醇发酵糟液均显示为酸性，在强氧化剂ClO2作用下也可能在酮基处开环形成新的降解产物(图6-d)。
a-降解前；b-降解后
图5 经600 mg/L ClO2处理DON纯品的HPLC-MS图谱分析
Fig.5 HPLC-MS analysis of DON treated with 600 mg/L ClO2
3 结论与讨论
a-DON分子结构；b-ClO2-DON复合物；c-DON碳碳双键处开环降解产物；d-DON酮基处开环降解产物
图6 ClO2处理DON降解产物分析
Fig.6 Analysis of DON degradation products by ClO2 treatment
实验结果表明，ClO2的确对DON有一定的降解效果，结合ClO2对DON纯品以及玉米乙醇发酵糟液的降解情况来看，提高ClO2浓度比延长处理时间的降解效果更佳，ClO2质量浓度为0～600 mg/L时，DON降解率随ClO2浓度提升而提高，之后降解率提升缓慢并逐步趋于稳定。值得注意的是，处于玉米乙醇发酵糟液的环境下，DON的降解效果也较好，推测是玉米乙醇发酵糟液中某种条件促使DON的化学键处于活泼状态，使其容易开环降解，实验结果表明，当DON所处环境pH值为4.5～5.5时，降解率最高，YOUNG[26]的研究表明，当pH值为4～6时，O3对DON氧化效果更好；常晓娇等[23]的研究也显示，pH 7的中性样品中ZEN的降解情况优于pH 3的酸性样品。此外，玉米乙醇发酵糟液中可能含有更活泼的电子接受者，能及时与断开的键结合，防止断开的键复原，以提高降解效果。本文为大规模去除DON提供了一种新的思路，但目前仅ClO2对DON的降解做了初步研究，其中的降解原理以及降解产物的具体结构，还有待进一步研究。此外，二氧化氯具有广泛的氧化作用，可能会降低玉米乙醇发酵糟液中的营养，因此将该DON去毒方法应用到实际中还需要一段时间。
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