“千年老窖万年糟，酒好须得窖池老”，泥窖固态续糟发酵是浓香型白酒区别于其他香型白酒的根本特征之一。窖泥既是浓香型白酒功能微生物又是营养物质乃至香味物质的重要载体[1]，故可称之为窖池发酵的菌源和香源。长期不间断的发酵过程中，窖泥中微生物利用糟醅中的营养成分产生有机酸等香味物质，窖泥与糟醅之间的接触有效实现了窖泥与糟醅物质与能量的互动[2-3]，而微生物的代谢功能强弱程度则是影响浓香型白酒酒质的关键因素之一。因此，研究窖泥中微生物与香味成分的构成及空间分布规律具有重要的理论与实际意义。
过去关于窖泥香气成分的研究中，基于乙醇提取法的不同窖龄窖泥香气成分的研究发现：仲丁醇含量随窖龄增加而减少，而己醇、己酸乙酯和己酸异戊酯的含量则不断增加，有机酸是任何窖龄窖泥中比例最高的化合物类型[2]；左飞等[3]利用高温孵育-顶空法设计了一种窖泥香气成分的定性方法；孙夏冰等[4]优化了顶空固相微萃取(head space solid-phase microextraction,HS-SPME)分析窖泥中挥发性成份的方法；范文来等[5]利用HS-SPME分析了人工窖泥中的挥发性成分，共检出184种挥发性成分，其中酯类78种、酸类11种、醇类18种、芳香族26种以及内酯、呋喃、硫化物等。李恒等[6]比较了窖壁和窖底窖泥中香气成分的差异，认为窖壁和窖底泥中酸类和酯类成分在种类和数量上均存在明显差异，己酸、己酸丁酯、己酸己酯是窖壁泥的主要特征成分，而窖底泥中含有丰富的己酸甲酯。最近，赵东等[7]研究了以黄水线为分隔依据的5个不同位置糟醅与窖泥在香气成分的关联性。然而，窖泥中香气成分的空间异质性特征的研究还亟待进一步详细分析。
本研究采集了不同空间位置的浓香型白酒窖泥，探讨了窖泥中香气成分的空间分布规律；并基于多元统计分析方法探讨了窖泥之间的相互关系，以期为科学认识窖泥对酒质的贡献提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品采集
窖泥采集自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间，窖池窖龄15年。
采集方法：参考文献[8]所述方法，从地面开始，沿窖池壁往窖池底部垂直距离间隔30 cm取样，利用专用窖泥取样器拨开窖泥表面附着的糟醅后，从表层往里层取约3 cm厚度的窖泥，同一层次取3个平行样(平行样点分布在窖墙同一平面上，以窖墙中心点往两边间隔50 cm分别取样)，分别取50 g，混合均匀。全部样品包括0、30、60、90、120、150、180、210和240 cm共9个窖泥样品。
样品前处理参考文献[8]所述方法，即取100 g窖泥置于-20 ℃中完全冷冻，再用搅拌机搅拌均匀，待测。
1.1.2 试剂和仪器
丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、丁醇、异戊醇、己醇、庚醇、辛醇、苯乙醇、苯酚和对甲酚，均为GC纯，上海TCI公司。4-甲基吲哚和4-辛醇(GC纯，内标)，美国Sigma-Aldrich公司。
50/30 μm CAR/DVB/PDMS Stableflex纤维萃取头，美国Supelco公司；气质联用仪，7890B-5977B MSD，美国Agilent公司；多功能自动进样器，PAL RTC，瑞士CTC公司；DB-WAX石英毛细管色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，J&W Scientific，美国Agilent公司。
1.2 顶空固相微萃取(HS-SPME)方法
参考文献[7]所述方法。称取2 g窖泥于20 mL顶空瓶中，加入定量内标(4-辛醇，5.5 mg)，50 ℃水浴中平衡15 min，再插入纤维萃取头吸附萃取45 min，随后导入GC进样口中热解析5 min，利用GC/MS分析其中香气成分。每个样品做2个重复。
1.3 气质联用(GC/MS)条件
气相色谱条件为：进样口温度230 ℃，载气(He)流速1 mL/min，不分流模式进样，质谱连接线温度250 ℃；升温程序为：起始柱温40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。
质谱条件为：质谱EI源，电子轰击能量70 eV；离子源温度200 ℃，四级杆温度150 ℃；质量数扫描范围35～350 amu。
1.4 香气成分的定量
香气成分的定量采用内标法[7]测定，参考内标质量浓度，以待测成分与内标的峰面积之比计算待测成分的半定量信息，单位以μg/g表示。
1.5 数据分析
利用R软件绘制主要香气成分的热图；利用SIMCA 14.1软件完成样品的偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)[9]。
2 结果与讨论
2.1 窖泥香气成分的总离子流图
实际生产中，在经历长期不间断的发酵后，不同空间位置的窖泥感官差异十分显著；同时，在对窖壁和窖底窖泥香气成分的比较研究中，酯类和酸类物质在两者间的差异显著[6]。为了更进一步认识窖泥中香气成分的空间分布规律，本研究以30 cm为尺度，从窖池顶部到底部的9个不同位置进行取样，利用HS-SPME-GC/MS分析了窖泥中香气成分的空间分布情况。如图1所示，窖泥中香气成分的指纹图谱存在高度相似性，但是在各成分的丰度存在显著差异，如总离子流图中16～20 min、27～40 min等区域在不同空间的窖泥中差异性显著。
图1 不同空间位置窖泥中香气成分的总离子流图
Fig.1 Total ion chromatograms of volatile compounds in pit muds from different spatial positions
2.2 窖泥香气成分的空间分布
2.2.1 分组分布规律
进一步统计窖泥香气成分的分组空间分布规律，如图2所示，窖泥香气成分的总含量随窖池深度增加而增加，窖池顶部(0 cm)的总含量为444 μg/g，而窖池底部(240 cm)的总含量是0 cm处的3.38倍，达到1 502 μg/g。一般地，浓香型窖池内90～120 cm是黄水线的位置，0 cm到90 cm/120 cm部分处于窖池上层，与窖泥接触的糟醅的含水量较120 cm以下的糟醅低。酸类和酯类是窖泥中最主要的2种成分类型，含量范围分别为：156.3～670.6 μg/g和153.3～649.9 μg/g，显而易见，这2个最重要的成分类型的总含量随窖池深度的增加而增加，而醇类成分的含量并未呈现显著的空间异质性。这可能是由于窖池的特殊结构-即顶部较大、底部适当小的地穴式结构[10]，黄水是糟醅发酵过程中产生的副产物[11]，而窖池内不同空间层次的糟醅之间物质的交换主要是通过黄水在重力的作用下自然下渗，下层窖泥吸收与之接触的糟醅中的香气成分[12]，故下层窖泥香气成分明显高于中上层窖泥。
图2 窖泥香气物质中各类型组分的空间分布规律
Fig.2 Spatial variation of different types of volatile compounds in pit mud
2.2.2 主要香气成分的空间分布规律
筛选出窖泥中关键的香气成分进行空间变化情况研究。由图3可知，己酸、丁酸、庚酸、辛酸、己酸乙酯、己酸己酯是窖泥中含量较高的成分，这与先前的研究结果一致[7]。基于香气成分含量的聚类分析可知(图3)，0～90 cm的窖泥样品划归为第一类，120～240 cm的窖泥样品划归为第二类。同时，第二类窖泥中己酸、丁酸、辛酸、庚酸、己酸己酯和己酸乙酯的含量普遍高于第一类。
图3 主要香气成分的空间分布规律
Fig.3 Spatial distribution of key aroma compounds in pit mud
特别是己酸、丁酸、己酸乙酯是浓香型白酒的主要的有机酸和乙酯成分[13]，分别具有典型的“酸味、臭脚丫味”和“菠萝、类似香蕉”等复合香气特征[14]。本研究中，除120 cm窖泥以外，这3种成分的含量随窖池深度的增加而增加，尤其是窖池底部(240 cm)，含量达到最大值，分别为168.38、220.33和133.98 μg/g(图3)，与过去研究结果相吻合[15]。这可能是因为：一方面，乙酸、己酸和丁酸等浓香型白酒中占优势的有机酸是由窖泥中梭菌属(Clostridium)[16]细菌代谢产生；另一方面，窖池内的厌氧程度也是随着窖池深度而增加，为Clostridium细菌等厌氧菌群的增殖代谢提供了较为理想的环境，因而深度越深，己酸和丁酸的含量越高。
本研究中，不同空间窖泥中己酸、丁酸和乙酸的含量排序为己酸>丁酸>乙酸，这与过去关于不同质量等级窖泥的研究结果类似[15]，这可能是由于本研究中窖池窖龄在15年左右，属于新窖向老窖老熟转化的过程期，不同类型有机酸的含量随窖池使用时间的增加而逐步调整。
此外，本研究中，醇类成分(除乙醇外)虽然不是窖泥中的优势香气成分，值得注意的是正己醇是醇类成分中含量最高的成分，含量范围从0 cm处16.83 μg/g到240 cm处31.28 μg/g，但无显著的增减规律。正己醇具有典型的“割青草”香气，又具有一定的甜味，是浓香型白酒的重要醇类物质。
2.3 基于香气成分的窖泥PLS-DA分析
为了进一步考察随着窖池深度的变化，不同窖泥中香气成分的差异以及样品之间的关联性。根据图3的聚类分析结果，将不同空间的窖泥设置为不同的组别建立PLS-DA模型，观察组间差异情况，并试图探索与之关联的关键香气成分。PLS-DA模型R2值与Q2值越大,表明PLS-DA模型的预测能力越准确与真实[17]。本研究中，将0 cm与30～90 cm构建PLS-DA模型，以及将120 cm与150～240 cm所涉及的样品建立PLS-DA模型，结果如图4所示。图4-a和图4-b的R2Xcum与Q2cum分别为(0.951、0.994)和(0.905、0.877)，表明PLS-DA模型能真实反应窖泥样品各组之间的分组情况。图4-a和4-b中，基于t[1]和t[2]轴上的载荷值，不同空间位置窖泥能够很好的分开，例如图4-a中，30和60 cm处窖泥分别位于t[1]负半轴，而0和90 cm则分别位于t[1]正半轴。
图4 窖泥PLS-DA分析
Fig.4 PLS-DA plots of pit mud based on volatile compounds
通过PLS-DA的载荷图寻找与各样品关联的差异性关键香气成分(图4-b和图4-d)。图4-b中，组别1(0 cm)窖泥与苯酚正相关，组别2(30和60 cm)窖泥与肉豆蔻酸乙酯、13-甲基肉豆蔻酸乙酯和辛酸己酯正相关，组别3(90 cm)窖泥与2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、乙酸和壬酸正相关；图4-d中，组别1(240 cm)窖泥与2-乙基苯酚、癸酸丙酯、己酸己酯和异戊醇等正相关，组别2(210 cm)窖泥与(R)-(-)-2-戊醇、十三酸乙酯和乙酸正相关，组别3(120 cm)窖泥与己酸甲酯正相关，组别4(150和180 cm)窖泥与辛酸己酯、3-甲基丁酸辛酯和壬酸正相关。根据筛选的主要关联香气成分含量绘制热图，图5-a中，0 cm窖泥中苯酚含量较高；肉豆蔻酸乙酯、13-甲基肉豆蔻酸乙酯和辛酸己酯在30和60 cm窖泥中含量较高；2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、乙酸(图3)和壬酸在90 cm窖泥中的含量较高。图5-b中，2-乙基苯酚和异戊醇在240 cm窖泥中含量最低，己酸己酯(图3)和癸酸丙酯在240 cm窖泥中的含量较高；(R)-(-)-2-戊醇在210 cm窖泥中含量最低，十三酸乙酯和乙酸在210 cm窖泥中的含量较高；己酸甲酯在120 cm窖泥中的含量较高；辛酸己酯、3-甲基丁酸辛酯和壬酸在150和180 cm窖泥中含量较高。
图5 PLS-DA筛选出的关键香气成分热图
Fig.5 Heatmap plots of key volatile compounds been screened from PLS-DA
3 结论
浓香型白酒发酵过程中，窖泥中不仅栖息了数以亿计(109个/g)的特殊微生物，而且在糟醅与窖泥相接触的界面，不断地发生微生物、香气物质等相互交换。本文探讨了窖泥中香气成分的空间分布规律，结果表明，窖泥中蕴含较高含量的有机酸，尤其是己酸、丁酸和庚酸，且窖池深度是决定有机酸含量的重要因素，深度越深，有机酸含量越高；同时，己酸己酯可能是窖泥中己醇和己酸在酯化酶作用下产生。因此，进一步利用基因组学技术与代谢组学技术研究窖泥微生物群落与窖泥特征香气成分的关联性研究将为优质窖泥的筛选及质量控制提供较强的理论及实践基础。
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