表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallo-catechin gallate，EGCG)是儿茶素中最有效的抗氧化成分，在绿茶中大约占9%～13%[1-2]。儿茶素具有较强的清除体内自由基、抗氧化、抗菌等功能[3]，被广泛应用于肉制品加工或添加于动物日粮中[4-5]。儿茶素对肉制品的色泽、保水性等品质都有明显的作用，如将儿茶素添加到猪肉糜中，可以抑制猪肉糜中肌红蛋白和脂肪氧化的速度，改善肉色，且效果优于抗坏血酸，但降低了猪肉糜的保水性和嫩度[6-7]。儿茶素还可以添加于动物饲料中以增强肉的抗氧化能力[8-9]，改善肉的品质[10-12]。将茶多酚添加于羊饲料中可以抑制羊肉的脂肪氧化程度，降低肉的滴水损失并提高羊肉的颜色稳定性[12]。氧化反应影响了肉的品质，但在动物活体时就已经存在，在动物日粮中添加抗氧化剂可以提高机体及肉的抗氧化能力，如在猪日粮中添加茶多酚，能显著提高肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性及总抗氧化能力，降低猪肝脏中GSH-Px、过氧化氢酶等基因表达量[13]。将EGCG添加在鹌鹑的日粮中，能降低其肝脏中的脂肪氧化程度，增加抗氧化酶和解毒酶的活性[14]。日粮添加儿茶素可以提高动物机体的抗氧化酶活性已被证实，但其对动物的非酶抗氧化能力还不明确。将甘草提取物添加到滩羊饲料中可以显著地降低活性氧自由基含量及硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)[15]；向猪日粮中补充过江藤可显著增加猪肉中的维生素E(vitamin E，VE)含量并增强猪肉的脂肪氧化稳定性[16]。将儿茶素添加于羊的日粮中，可以增加羊血浆和肉中还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量[17]，保护羊骨骼肌免受氧化胁迫。VE和GSH是非酶类抗氧化体系的重要组成部分，但添加EGCG对肉中VE、GSH含量及清除自由基的能力还鲜有报道。
本实验研究日粮中添加EGCG对鸡肉中VE和GSH含量、抗氧化能力、保水性和肉色的影响，以期揭示EGCG对动物的非酶抗氧化体系的影响，为畜牧业和肉品加工中控制氧化、提高肉的品质提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白羽鸡：选择150只14日龄白羽肉鸡，先饲养1周，以适应环境，再将其随机分成5组，每组10只，饲喂于山东绿都生物科技有限公司。从第21～42天，分别向鸡日粮中添加氧化油脂和EGCG，并将其分组。第1组为氧化油脂组，饲料中混合质量分数5%的花生油(花生油在100℃氧化大约3 d，其POV值在30±3 mmol/kg)；第2组为氧化油脂+EGCG组，在饲料中混合5%的花生油并添加100 mg/kg EGCG；第3组为VE组，在饲料中添加200 mg/kg VE醋酸酯(纯度98%)作为阳性对照组；第4组饲料中仅添加EGCG，为EGCG组；第5组只饲喂饲料，不添加抗氧化剂，作为空白对照。第43天将肉鸡宰杀后取鸡胸肉和鸡肝，真空包装后用保温箱加冰运回实验室；24 h开始制样。
EGCG、VE醋酸酯、α-生育酚标准品,南京道斯夫生物科技有限公司；谷胱甘肽(GSH)试剂盒,南京建成生物工程研究所。邻苯三酚、二氯甲烷等试剂均为分析纯，滨州泰达仪器试剂公司。
1.2 仪器与设备
LC-20A型液相色谱仪，日本岛津公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发仪，上海爱明仪器有限公司；T25型高速分散器，德国IKA；TG18型高速台式离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；HZQ-X300G型恒温振荡器，上海-恒科学仪器有限公司；N-1001型旋转蒸发仪，东京理化器械公司。
1.3 试验方法
1.3.1 鸡肉样品处理
取氧化油脂组、氧化油脂+EGCG组、VE组、EGCG组和空白组的鸡胸肉，待其解僵后使用绞肉机绞碎，粒度直径为 5.6 mm，混匀后装袋，每组样品50 g，共18袋，真空包装于4 ℃冰箱中冷藏。在0、1、3、7、14、21 d每组样品中取3袋，检测其TBARS、羰基值、保水性和高铁肌红蛋白值。
1.3.2 TBARS和羰基含量的测定
TBARS的测定参照SINNHUBER等[18]的方法，羰基含量的测定参照XIA等的[19]的方法。
1.3.3 鸡肉持水性的测定
根据LIU等的方法并稍作修改[20]。取绞碎的鸡肉5 g在4 ℃下2 000×g离心20 min，并在105 ℃下干燥至恒重。持水性被定义为损失的汁液，计算如公式(1)所示，
(1)
式中:W0，W1和W2分别表示肉馅离心前的质量(g)，离心后的质量(g)和干燥后的质量(g)。
1.3.4 高铁肌红蛋白含量的测定
参照PREDESCU等[7]的方法并略作修改，取2.0 g肉糜放入离心管中，加入20 mL 40 mmol/L pH为6.8的冷磷酸盐缓冲溶液，混合物均质后,在4 ℃下4 500 r/min离心30 min，取上清液在400～700 nm之间比色，高铁肌红蛋白含量的计算如公式(2)所示。
高铁肌红蛋白含量/%=(-2.514R1+0.777R2+
0.800R3+1.098)×100
(2)
式中，R1=A572/A525，R2=A565/A525，R3=A545/A525
1.3.5 鸡胸肉及细胞膜中VE含量的测定
样品中VE含量的检测参见GB/T 9695.30—2008 肉与肉制品VE含量测定。鸡肉中细胞膜提取：取鸡胸肉组织匀浆液(100 g/L)3 000 r/min离心10 min，取沉淀加生理盐水，4 850 r/min离心15 min得细胞膜。分析条件：色谱柱：C18柱(4.6 m×250 mm)；流动相：V(甲醇)∶V(水)=96∶4；柱温：室温；流速0.8 mL/min；检测波长294 nm；进样量20 μL。
1.3.6 谷胱甘肽含量的测定
准确称取鸡胸肉和鸡肝，打碎，加入9倍或5倍体积的0.9% 的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，取100 g/L的鸡胸肉匀浆液和鸡肝匀浆液各1 mL，2 500～3 000 r/min,离心10 min,取上清液严格按照试剂盒说明书操作测定样品的谷胱甘肽含量。
1.3.7 鸡肉提取液及其抗氧化能力检测
鸡肉中提取多酚参考MO
INO等[21]的方法，称取20 g鸡胸肉，将其真空冻干得冻干样品。准确称量冻干样品4.5 g，加50 mL石油醚，在气浴恒温振荡器振摇30 min后，用索氏提取器在水浴锅温度60 ℃条件下抽提约3 h并充氮气做保护，旋蒸20 min，收集浓缩液约5 mL，置于-80 ℃条件下保存，使用前定容至10 mL。鸡肉提取液的抗氧化能力检测包括DPPH·清除能力、亚铁离子还原能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力，参照佀凤为的方法[22]。
1.4 数据统计分析
每个试验重复3次，结果表示为平均数±标准差。数据统计分析采用Statistix 8.1 (分析软件，St Paul,MN) 软件包中Linear Models程序进行，差异显著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用sigmaplot 9.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 EGCG对鸡肉脂肪氧化和蛋白氧化的影响
脂肪氧化的次级产物可通过TBARS值表征，TBARS值与肉类脂肪氧化程度呈正相关性。如图1-a所示，随着冷藏时间的延长，各组鸡肉的TBARS均呈显著增加趋势(P<0.05)，但增加程度不同。氧化油脂组TBARS增加速度最快，经过21 d贮藏，TBARS从0.10 增加到0.65 mg MDA/kg，而VE组增加速度最慢，从0.09增加到0.45 mg MDA/kg。与空白组相比较，VE组和EGCG组的TBARS分别降低了17.9%和11.8%；与氧化油脂组相比较，VE组和EGCG组的TBARS分别降低了31.1%和25.9%，说明随着冷藏时间延长，鸡肉的脂肪氧化程度不断加深，EGCG与VE一样抑制鸡肉的脂肪氧化程度，减少脂肪氧化产物的生成。TANG等也证实饲喂肉鸡茶多酚可以提高鸡肉在冻藏过程中的氧化稳定性[23]。肉在加工或贮藏过程中，由于光线、金属离子等作用，会诱导脂肪氧化，EGCG可以抑制脂肪氧化产物的生成，可能与其结构富含OH·基团有关，可以清除脂肪氧化过程中产生的自由基并清除金属离子[24]。
蛋白羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白质发生氧化后一个显著变化，因此羰基被广泛地用于测量蛋白质的氧化程度。从图1-b可以看出，随着冷藏时间的延长，蛋白中羰基含量显著增加(P<0.05)。羰基含量与TBARS呈现相似的增加趋势。贮藏0 d的样品中肌原纤维蛋白中羰基含量为1.47～1.78 nmol/mg蛋白，这个结果与MORZEL从新鲜的猪背部最长肌中提取的肌原纤维蛋白(1.70 nmol/mg蛋白)的羰基含量相接近[25]。与0 d相比较，当贮藏到21 d时，氧化油脂组、氧化油脂组+EGCG组、VE组、EGCG组和空白组样品中羰基含量分别是冷藏0 d时的2.02、1.71、1.70、1.66、1.83倍，在相同的冻藏时间内，EGCG组和VE组的所有样品中羰基含量均显著低于氧化油脂组和空白组(P<0.05)。TBARS与羰基之间具有相关性，脂肪氧化产物会引发蛋白氧化产生更多的羰基[26]，随着冷藏时间的延长，鸡肉中脂肪氧化产物增加，因此羰基的含量迅速增加。
a-TBARS含量；b-羰基含量
图1 EGCG对鸡肉在冷藏过程中脂肪氧化和蛋白氧化的影响
Fig.1 Effect of EGCG on lipid and protein oxidation in chicken during cold storage
注：大写字母A-F为不同处理组之间比较，小写字母a-d为同一处理组的不同冷藏时间之间比较，不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。下同。
2.2 EGCG对鸡肉在冷藏过程中保水性的影响
肉的保水性是指当肌肉受外力作用时保持其原有水分与添加水分的能力，是肌肉食品品质评定的重要指标之一。如图2所示，随着冷藏时间的延长，鸡肉的保水性呈现先增加再下降的趋势，VE组和EGCG组的保水性明显高于氧化油脂组和空白组(P<0.05)。冷藏0 d时，各组样品的保水性值为89.6%、88.8%、91.7%、91.3%和90.5%，冷藏1 d，保水值略有增加，贮藏至21 d时，与贮藏0 d相比较，保水性分别下降了28.7%、22.9%、18.5%、20.5%和23.5%，说明EGCG有利于改善鸡肉的保水性。抗氧化剂可以间接地影响肌肉的保水性，保水性的高低取决于肉的pH值和脂质的氧化程度[27]。脂肪氧化可以导致蛋白质氧化，蛋白质氧化会导致肌肉纤维收缩、降低肌肉的保水性，如猪肉在Fe2+/H2O2体系中氧化后，肌球蛋白和肌动蛋白会同时收缩并伴有肌浆蛋白的变性，这种蛋白质之间的相互作用是导致肌肉保水性下降的根本原因[21]。
图2 EGCG对鸡肉在冷藏过程中保水性的影响
Fig.2 Effect of EGCG on water holding capacity of chicken during cold storage
2.3 EGCG对鸡肉在冷藏过程中高铁肌红蛋白含量的影响
氧化会导致肌肉颜色的改变，通过肉色的改变可以判断肌肉食用品质的变化。肌红蛋白是宰后肌肉的主要呈色物质，肌红蛋白氧化后会生成高铁肌红蛋白，使肉褪色。如图3所示，随着冷藏时间的延长，各组高铁肌红蛋白的相对含量呈上升趋势。当贮藏0 d时，氧化油脂组、氧化油脂+EGCG组、VE组、EGCG组和空白组中高铁肌红蛋白相对含量分别为17.3%、16.4%、14.8%、15.3%和15.9%，当贮藏21 d时，高铁肌红蛋白相对含量分别增加至53.4%、45.7%、40.4%、43.1%和50.3%，VE组的高铁肌红蛋白含量增幅最小，EGCG组次之，说明VE和EGCG能有效地抑制高铁肌红蛋白的生成，抑制肉的褐变。
图3 EGCG对鸡肉在冷藏过程中高铁肌红蛋白含量的影响
Fig.3 Effect of EGCG on the content of myoglobin in chicken during cold storage
脂肪氧化与肌红蛋白氧化密切相关，脂肪氧化过程中产生的脂质过氧化物自由基可以诱导氧合肌红蛋白的氧化，脂肪氧化是一个耗氧的过程，氧分压的降低有利于高铁肌红蛋白的生成[28]。一般情况下，当高铁肌红蛋白含量低于20%时，肉呈现鲜红色；达到30%时肉色变暗；当含量超过50%时肉色呈现红褐色。由于鸡肉属于“白肉”，颜色浅红，所以贮藏至21 d时，随着高铁肌红蛋白含量升高，鸡肉的颜色呈黄色。
2.4 EGCG对鸡肉及细胞膜中VE含量的影响
动物机体抵御各种活性氧自由基的抗氧化防御体系包括抗氧化酶体系和非酶类抗氧化防御体系，前者包括超氧化物歧化酶、过氧化物酶和GSH-Px；后者包括脂溶性、水溶性的抗氧化剂，如VE、GSH以及微量元素(硒、锌等)。VE是机体非酶抗氧化体系的重要组成之一。因此，检测鸡肉中VE含量有助于分析EGCG对鸡肉非酶抗氧化体系的影响。向动物日粮中添加抗氧化物质可以增加肉中的VE含量[17]，进而提高肉在加工及贮藏过程中的抗氧化能力。如图4所示，氧化油脂组、氧化油脂+EGCG组、VE组、EGCG组和空白组鸡肉中VE含量分别为2.24、2.43、5.46、3.91、2.75 μg/g肉，相应地，各组细胞膜中VE含量分别为0.565、0.703、1.235、0.774、0.677 μg/g肉。由此可以看出，氧化油脂组中VE含量最低，而VE组中VE含量最高，其次是EGCG组，空白组的VE含量高于氧化油脂组。细胞膜中的VE含量与肉中的VE呈现相似的趋势，各组之间差异显著(P<0.05)。VE主要存在生物膜中，能有效阻断自由基链式反应，抑制生物膜脂质过氧化。VE和抗氧化剂能维持肌肉细胞膜的完整性，避免氧化物造成的损伤。VE组和EGCG组VE含量显著高于其他组别(P<0.05)，这可能是因为日粮中添加VE或抗氧化剂可以降低动物机体对VE的利用；氧化油脂组和氧化油脂+EGCG组中VE含量低，可能是由于机体中VE因清除氧化油脂带入的活性氧自由基而导致其含量下降。
图4 EGCG对鸡肉中VE含量的影响
Fig.4 Effect of EGCG on the vitamin E content of chicken
EGCG具有较强的自由基清除能力和螯合金属离子的能力，将其直接添加在食品中，清除脂质过氧化物的能力优于VE[29]，所以日粮中添加EGCG可以清除脂肪氧化产生的自由基，抵减促氧化剂的作用，保护VE免受氧化损失[30]，VE也可在体内蓄积导致其在肉中含量增加，这个结果也有助于解释VE组和EGCG组鸡肉在冷藏过程中具有较好的氧化稳定性。刘旭升等也证实在鸡日粮中添加绿茶粉可以有效地提高鸡肉中VE的含量[31]。
2.5 EGCG对鸡肉中GSH含量的影响
谷胱甘肽(GSH)是动物机体中非酶抗氧化防御体系的一个重要指标，其生理作用是能够清除动物机体的自由基，有助于抵御氧化应激。因此，动物体内的GSH含量越高，说明机体的抗氧化能力越强。如图5所示，氧化油脂组、氧化油脂+EGCG组、VE组、EGCG组和空白组鸡肉中GSH含量分别为3.31、3.73、5.14、4.84、4.43mg/g蛋白质，差异显著(P<0.05)；而在肝脏中，各组的GSH含量依次分别为17.4、20.5、25.7、21.2和18.6 mg/g蛋白质，与肉中GSH含量具有相似的趋势，且VE组和EGCG组GSH含量较高。唐雪莲等证实添加维生素E可以增加罗非鱼肉中GSH含量[32]。在猪日粮中添加绿原酸，也可增加肉中GSH的含量。本研究结果说明EGCG与VE均可以增加肉中GSH的含量。
图5 EGCG对鸡肉中GSH含量的影响
Fig.5 Effect of EGCG on the GSH content of chicken
2.6 鸡肉提取液的自由基清除能力
自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力，可以与蛋白质、脂肪等分子作用发生氧化反应，导致肉制品品质下降。利用石油醚抽提氧化油脂组、氧化油脂+EGCG组、VE组、EGCG组和空白组样品所获得的提取液，其对DPPH·、超氧阴离子、羟基自由基的清除能力和亚铁离子还原能力如表1所示。由表1数据可知，VE组和EGCG组清除DPPH·、超氧阴离子、和羟基自由基的能力显著高于氧化油脂组、氧化油脂+EGCG组和空白组(P<0.05)，EGCG组的亚铁离子还原能力显著高于氧化油脂组合空白组(P<0.05)。样品提取液之所以具有抗氧化作用，可能是因为提取液中含有多酚或其代谢产物，或脂溶性的维生素E或其他抗氧化物质。多酚在动物体内可能会分解成具有抗氧化作用的产物，或者像VE一样以原物质形式存在于肉中，或者影响其他具有抗氧化物质的含量等，但这些作用还不明确。ORTUO等发现羊日粮中添加迷迭香二萜类化合物(鼠尾草酸和卡诺醇)，鼠尾草酸可以其代谢产物C19H22O3蓄积，使羊肉表现出良好的自由基清除能力和亚铁还原能力[33]。EGCG是水溶性植物多酚，经过新陈代谢会以哪种形式存在，提取液中究竟含有哪些物质还需进一步研究。
表1 鸡肉提取液对自由基清除能力及亚铁离子还原能力
Table 1 Free radical scavenging ability and ferrous ion reducing ability of chicken extract
组别抗氧化能力DPPH·/%超氧阴离子/%羟基自由基/%亚铁离子还原能力/(mmol·L-1)氧化油脂21.66±0.60D29.38±0.38E10.08±0.17D0.59±0.03C氧化油脂+EGCG30.24±0.80C36.47±0.51D23.42±0.88C1.08±0.05AVE38.46±0.45A42.00±0.56A35.29±0.84A1.15±0.24AEGCG35.47±0.67B40.63±0.74B31.70±0.95B1.26±0.13A空白22.17±0.70D31.57±0.91D8.45±0.35D0.81±0.02B
注：大写字母A-D为同一处理组之间的比较。
3 结论
EGCG是茶多酚中水溶性的、抗氧化活性最强的成分。日粮添加EGCG可以提高鸡肉在冷藏过程中的氧化稳定性、鸡肉的保水性，并改善肉色。EGCG可以保护肉中的VE并增加其在肉中的含量、增加肉中GSH含量，添加EGCG的鸡肉的提取液具有较强的清除DPPH·、超氧阴离子、羟基自由基能力和亚铁离子还原能力。因此，日粮中添加EGCG，可以提高鸡肉的非酶抗氧化能力，对提高鸡肉在加工及贮藏过程中的品质具有重要作用。
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