发酵乳因其具有丰富的营养和良好的保健功能[1-2]，越来越受到消费者的青睐，市场需求量的快速增长也要求相应发酵剂的稳定和丰富化[3]。发酵剂的发酵特性包括迅速产酸、产黏和产香等特性[4]，但单一菌株难以达到以上特性，为此需通过添加增稠剂、稳定剂及食用香精等添加剂提高产品质量，但这会增加了生产成本，加大食品的安全风险[5]。因此，对菌种的选择、菌株的优化搭配和发酵剂的制备提出了更高的要求，将不同发酵特性的优良菌株进行组合有利于提升发酵剂的整体性能，也是生产优质发酵乳的关键环节。
弓耀忠[6]将产乳酸菌胞外多糖菌株Lvan04、产Nisin菌株LA02、嗜热链球菌1和保加利亚乳杆菌2组成复合发酵剂，提高了发酵乳的黏度、稳定性及口感；REZA等[7]研究发现嗜热链球菌、德氏乳杆菌和瑞士乳杆菌复合发酵剂发酵的酸奶具有良好外观和令人愉快的酸性香气，且发酵乳中胞外多糖较少；穆明道等[8]研究发现球杆菌1∶1(体积比)复合菌的产酸能力、凝乳效果比单菌株高，后酸化偏弱且趋于稳定。有鉴于此，本研究以前期从云南特色发酵食品中分离鉴定的12株乳酸菌为出发菌株，从中筛选出多种具有较强产黏和产香特性的菌株进行互配制备直投式发酵剂(directed vat set,DVS)，以pH、黏度、持水率、活菌数、产香成分为评价指标，确定最佳的菌株组合并综合评价其发酵性能，旨在为开发出一种产黏性、产香性好和后酸化现象平缓的DVS提供科学依据，进一步提高发酵乳产品的稳定性和风味。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料乳
鲜牛乳,云南昆明奶牛牧场。
1.1.2 菌种
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、德式保加利亚乳杆菌亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，均从云南特色发酵食品乳饼、乳扇、酸水中分离鉴定，于云南农业大学食品科学技术学院保藏。菌株使用前进行活化，4 ℃冰箱储存备用。商业直投式酸奶发酵剂1、2、3，科汉森(北京)贸易有限公司。
1.1.3 试剂
MRS肉汤培养基、MRS固体培养基，广州环凯微生物科技有限公司；双乙酰标准溶液,上海源叶生物科技有限公司；NaOH、TCA、C6H4(NH2)2、NaHCO3、NaHSO3、HCl，均为分析纯，天津市凤船化学试剂科技有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-6100S型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；TGL20M型高速冷冻离心机，长沙迈佳森仪器设备有限公司；SVJ-358型智能商用酸奶机，北京世纪阳光有限公司；NDJ-4型旋转黏度计，武汉格莱莫检测设备有限公司；雷磁PHSJ-4A型pH计，上海精密科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 直投式发酵剂菌种筛选
以pH、酸度、黏度、持水率、活菌数、组织状态、凝乳时间为指标，从云南特色发酵食品中分离鉴定的12株乳酸菌中筛选出具有较强发酵性能的乳酸菌制备DVS。
1.3.2 DVS菌种复配
经筛选，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、类干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、德式保加利亚乳杆菌亚种5株菌具有良好的发酵特性，其中罗伊氏乳杆菌具有良好的产黏特性，嗜酸乳杆菌具有良好的产乙醛能力。故以罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌为核心菌株，进行复合菌种组合试验，根据发酵性能确定最佳的发酵乳菌种组合。菌种组合设计如下表1所示。
表1 直投式发酵剂菌种组合列表
Table 1 List of strains combination for directed vat set
菌种组合ABCD嗜酸乳杆菌1111嗜热链球菌1122类干酪乳杆菌1111罗伊氏乳菌1212德式保加利亚乳杆菌亚种1111
1.3.3 直投式发酵剂的制备
本研究采取真空冷冻干燥技术(1.5～3 MPa，-50 ℃)对发酵剂进行冷冻干燥，为降低真空冷冻干燥过程对菌种的影响，实验用2%(体积分数)的甘油、8 g/L的葡萄糖和20 g/L的抗坏血酸添加到牛乳培养基中进行冷冻干燥。
1.3.4 发酵乳加工工艺流程
原料乳(验收，冷贮)→配料→预热(50～60 ℃)→均质(8～10 MPa均质)→灭菌(巴氏杀菌85 ℃,15 min)→冷却(30～45 ℃)→接种(接种量0.2%，体积分数)→发酵(38～42 ℃，10 h)→冷藏后熟(2～4 ℃)
1.3.5 DVS发酵性能分析
1.3.5.1 发酵剂产酸能力测定
pH值的测定，采用pH计直接测定。
1.3.5.2 发酵乳后酸化程度测定
酸度测定，参照《食品安全国家标准 食品酸度的测定》(GB/T 5009.239—2016)提供的酸碱滴定法进行测定。
1.3.5.3 发酵剂产黏能力测定
黏度测定，采用NDJ-4型旋转黏度计直接测定；持水力测定，参照HASSAN的方法测定。
1.3.5.4 发酵剂活菌数测定
参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》(GB 4789.35—2016)进行测定。
1.3.5.5 发酵剂产香能力测定
(1)产乙醛能力测定
参照刘宁宁等[9]的方法进行测定。取8%(质量浓度)的三氯乙酸(trichloroacetic,TCA)溶液与样品以1∶1(体积比)的比例混匀，充分摇匀，以4 500 r/min离心10 min(4 ℃)，上清液通过滤纸过滤，取5 mL加入1.00 mL NaHSO3溶液中混匀，室温下静置1 h，反应完成后加入0.5 mL 1%(质量浓度)淀粉溶液，滴入0.1 mol/L碘液，快到终点时换用0.01 mol/L碘液，到溶液刚好为浅蓝色，静置30 s不变色，就是初滴定终点，不进行读数。随后加10 mL 1 mol/L NaHCO3，振荡使溶液蓝色完全褪去，最后用0.01 mol/L碘标准溶液滴定至刚好呈蓝色且30 s不变色，记录消耗标准碘液的体积，同时做对比实验。
(2)产双乙酰能力测定
参照吕嘉枥等[10]的方法进行测定。取8%(质量浓度)的TCA溶液与样品1∶1(体积比)混合，充分摇匀，于4 500 r/min离心10 min(4 ℃)，将上层液体用滤纸过滤量取10 mL，加入0.5 mL 1%(质量浓度)邻苯二胺溶液，摇匀后放于黑暗处放置30 min。待反应完全后，标准溶液中加入2 mL 4.0 mol/L HCl结束反应。以双乙酰为标准品，绘制标准曲线回归方程为：y=0.082 4x-0.031 9(R2=0.999)；y为吸光度，x为双乙酰浓度。以纯牛奶作为空白对照，于335 nm波长下测定其吸光度。
1.3.6 发酵乳感官评价
待乳发酵结束后取出，于4 ℃条件下贮藏24 h后由受过专业训练的8位品评员进行品评，他们完全理解感官特性，熟知发酵乳的评价标准。分别对样品的组织状态、色泽、黏稠度、酸甜比、奶香味与发酵乳风味6个方面对酸奶进行感官评价，各感官评价指标和相应的标准如下表2所示。
表2 感官评分表
Table 2 Sensory score table
等级色泽黏稠度发酵乳风味组织状态奶香味酸甜比1色泽明亮,均匀一致(12～16)乳香协调(13～17)甜酸适口,口感细腻,滋味柔和,滑润爽口(13～17)均匀不分层,无或少量沉淀(12～16)有发酵乳的浓郁独特香味,无异味(13～17)酸甜比适中(13～17)2色泽较暗,均匀较好(7～11)乳香淡,气味较协调(8～12)甜酸比例不佳,滋味不柔和,口感粗糙(8～12)较均匀,较黏稠,少沉淀(7～11)有淡淡的发酵乳的独特香味,无异味(8～12)酸味过量或不足(8～12)3色泽暗,不均匀(0～6)有涩味,气味不协调(0～7)甜酸比例差,过酸或过甜,难以接受(0～7)不均匀,黏性差,沉淀多(0～6)有淡淡的发酵乳独特的气味,有异味(0～7)酸味太重或者是没有酸味(0～7)
1.4 数据统计分析
每个样品至少3次重复数据，结果以平均值(AV)±标准差(SD)表示，通过SPSS 17.0软件进行方差显著性分析，P<0.05时表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 DVS菌株的筛选
乳酸菌的产酸、产黏及产香能力是选择发酵剂的主要指标，产酸能力强、发酵时间短[11]，产黏性强，形成的酸奶质构指标相对比较高[12]，产香能力强则能赋予发酵乳浓郁的香味。从表2可以看出，嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、类干酪乳杆菌、德式保加利亚乳杆菌亚种、嗜热链球菌5株菌的发酵乳酸度值均在 65～100 °T之间，pH值在4.2～4.35之间，均具有良好的发酵产酸性能；发酵乳持水率和黏度值显著高于其余菌株(P<0.05)，其中罗伊斯乳杆菌的发酵产黏性最好；其中嗜酸乳杆菌产乙醛能力最强，发酵乳乙醛含量较高。5株乳酸菌具有良好的发酵特性和产黏产香性，且发酵乳中乳酸菌活菌都符合标准，可用于DVS的制备。
表3 单菌株发酵性能测定
Table 3 Determination of fermentation performance of single strain
菌种酸度/°TpH值持水率/%黏度/(mPa·s)组织状态乙醛含量/(μg·mL-1)活菌数/(CFU·mL-1)嗜热链球菌86.32a4.23d81.1b5908b均匀细腻、无沉淀7.03a4.7×107a婴儿双歧杆菌68.28d4.96a29.9f1504f凝乳松散、无沉淀2.65e0.3×107e副干酪乳杆菌90.43d4.28c31.3f2252f凝乳松散、无沉淀6.88a2.8×107c类干酪乳杆菌85.32c4.29c72.5c4802b均匀细腻、无沉淀6.54b4.5×107a嗜酸乳杆菌98.44a4.05e80.7b5104b均匀细腻、无沉淀6.20b4.8×107a发酵乳杆菌68.52d4.79a38.7f3001ef凝乳松散、无沉淀5.73c3.2×107bc约氏乳杆菌70.96d4.77a34.6f2852e凝乳松散、无沉淀5.27c0.6×107e罗伊氏乳杆菌81.83d4.33c89.5a8800a均匀细腻、无沉淀5.93bc3.8×107b鼠李糖乳杆菌69.97d4.89a32.8f3709ef凝乳松散、无沉淀3.41d1.8×107d唾液乳杆菌68.37d4.74a79.6b5004b有乳清析出、无沉淀2.93e0.2×107e德式保加利82.50b4.26c62.2d4496b均匀细腻、无沉淀6.74a3.7×107b亚乳杆菌亚种植物乳杆菌70.29d4.58b41.8e4203cd凝乳松散、无沉淀3.64d1.2×107bc
注：同一行上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
2.2 不同菌种组合发酵性能的比较分析
2.2.1 不同菌种组合发酵产酸能力测定
pH值和发酵乳的风味和组织结构密切相关，是决定发酵乳产品最终质量好坏的主要因素，pH值的变化能反应出菌株产酸能力，所以测定菌种组合发酵过程中pH值变化显得尤为重要。从图1中可以看出，4组菌种组合的pH值从最初的6.78降到了4.2～4.6之间，其主要原因是乳酸菌在发酵过程中将乳糖代谢成乳酸，pH值降低[13]。其中，D组合的pH下降最快，产酸能力最强，发酵8 h后的pH值为4.21，其次是组合B、C、A，不同菌种组合所含的乳酸菌菌株不同或菌种混合比例不同，引起其产酸能力的不同，导致发酵乳pH的变化具有一定的差异[14-15]。
图1 不同菌种组合发酵过程pH值变化
Fig.1 pH value change of fermentation process of different strains
注：V(嗜酸乳杆菌)∶V(嗜热乳杆菌)∶V(类干酪乳杆菌)∶V(罗伊氏乳菌)∶V(德式保加利亚乳杆菌亚种)=1∶1∶1∶1∶1(A);1∶1∶1∶2∶1(B);1∶2∶1∶1∶1(C);1∶2∶1∶2∶1(D)。下同。
2.2.2 不同菌种组合发酵过程中活菌数变化
发酵乳发酵过程中，乳酸菌的生长繁殖产生的代谢产物会引起发酵乳发生一系列变化，乳酸菌活菌数直接影响着发酵乳的风味[16]。由图2可以看出，在发酵0～4 h时乳酸菌数量迅速增多，原因是发酵阶段的温度在40 ℃左右，为乳酸菌最适生长温度，在发酵后期乳酸菌数量缓慢增长，说明4个菌种组合的发酵剂中乳酸菌相互促进了生长。当发酵8 h时，对比4个菌种组合在发酵乳中的乳酸菌数量，D组合的乳酸菌数量最高，发酵至8 h时达到了8.2×107 CFU/mL，其次是C、B、A组合。D组合的活菌数总体在发酵期间平稳增长，菌株之间的相互协调作用能力更强。
图2 不同菌种组合发酵过程中活菌数变化
Fig.2 Variation of viable bacteria number during fermentation with different combinations of strains
2.2.3 不同菌种组合发酵乳后酸化现象测定
酸度与发酵乳的风味和品质密切相关，如果发酵乳酸度过高，在贮藏过程中会造成发酵乳乳清析出，导致其风味、感官质量下降[16]。根据图3显示，随着冷藏时间的延长，发酵乳酸度越来越高，原因是乳酸菌的生长繁殖消耗剩余的乳糖产生乳酸，产生后酸化现象。在冷藏5 d内，4种菌种组合生产的发酵乳滴定酸度快速增长，冷藏10～15 d时增长比较缓慢，原因是冷藏初期乳酸菌数量较高，消耗乳糖产酸量也越高，随着冷藏时间的延长乳酸菌数量开始下降，后酸化现象也开始减弱[17]。在15～20 d时A组合和B组合发酵乳的酸度迅速增长，出现严重后酸化现象，酸度过高，影响酸奶的品质与风味。C组合和D组合发酵乳的酸度变化趋势平缓，冷藏20 d内发酵乳的酸度值保持在90～100 °T之间。
图3 不同菌种组合发酵的发酵乳后酸化现象
Fig.3 Acidification of fermented milk after fermentation of different strains
2.2.4 不同菌种组合发酵乳在冷藏过程中乙醛、双乙酰含量变化
发酵乳中乙醛和双乙酰一直被认为是风味的主要成分。其中，乙醛是发酵乳中最具代表性的芳香物质，高浓度的乙醛是形成发酵乳良好风味的重要前提；双乙酰是发酵乳中重要的产香物质，能赋予发酵乳良好的奶油香味，微量存在就会使发酵乳的风味得到很大的提高[18-19]。发酵剂中菌种种类、菌株比例和活力对发酵乳中风味物质含量起着关键性的作用[20]。
由图4可以看出，4种菌种组合在发酵终点时发酵乳中乙醛含量最高的是A组合，为7.98 μg/mL，其次为C、D、B组合。在冷藏0～5 d内，不同菌种组合发酵乳中乙醛含量有不同程度的增加，其中B组合增加的幅度最大，其次是D组合，第5天时D组合的乙醛含量最高，为9.34 μg/mL。在5～20 d之间乙醛含量开始不断降低，下降最快的为B组合，原因是在贮藏期乙醛具有挥发性，当贮藏条件不当时会有损失，同时生产的乙醛有可能作为中间产物在乙醛还原酶的催化作用下被还原成乙醇，从而降低发酵乳中风味物质的含量[21]。
图4 不同菌种组合发酵乳冷藏过程中乙醛含量的变化
Fig.4 Changes of acetaldehyde content in fermented milk of different strains during cold storage
由图5可以看出，4种菌种组合在发酵终点时发酵乳中双乙酰含量最高的是D组合，含量为9.36 μg/mL，其次为C、A、B组合。在冷藏0～5 d时，A、B、C和D组合的双乙酰含量均呈现上升趋势，可能的原因是乳酸菌继续利用乳糖、柠檬酸生成丙酮酸，再合成双乙酰，导致双乙酰含量增加[18]；在第5天时双乙酰含量最高为D组合，达到11.63 μg/mL。在冷藏5～20 d时，4个组合发酵乳的双乙酰含量总体呈下降的趋势，直到冷藏20 d时，D组合的双乙酰含量是最高的，达到6.67 μg/mL，其次是C、A、B组合。总体来说，D组合菌株具有很好的产香特性，发酵的发酵乳在贮藏0～20 d内乙醛和双乙酰含量较高，能赋予发酵乳良好的奶油香味，使发酵乳风味得到提高。
图5 不同菌种组合发酵乳冷藏过程中双乙酰含量的变化
Fig.5 Changes of diacetyl content in fermented milk with different combinations of strains during cold storage
2.3 发酵剂发酵性能综合评价
实验以产黏、产香、贮藏期后酸化平缓为指标，筛选出最佳菌种组合D，即嗜酸链球菌、嗜热乳杆菌、类干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、德式保加利亚乳杆菌，菌种互配比例为1∶2∶1∶2∶1(体积比)。为进一步证明D组合的良好发酵性能，把D组合DVS与3种商业直投式酸奶发酵剂进行发酵性能及感官评价比较。
2.3.1 发酵性能对比
由表4可以看出，菌种组合D发酵的发酵乳中活菌数为8.2×107 CFU/mL，黏度值为8 800 mPa·s，持水率为86.35%，均高于3种商业直投式酸奶发酵剂发酵的酸奶(P<0.05)，提高了发酵乳的黏性。此外，发酵乳pH和酸度适中，乙醛含量达到7.51 μg/mL，高于2号商业直投式酸奶发酵剂生产的发酵乳。
表4 商业DVS与组合D发酵性能对比
Table 4 Comparison of commercial direct-injection starter and combined D fermentation performance
发酵剂pH值酸度/(°T)黏度/(mPa·s)持水率/%活菌数/(CFU·mL-1)乙醛含量/(μg·mL-1)菌种组合DDVS4.21b98.12c8800a86.35a8.2×107a7.51c商业直投式酸奶发酵剂14.03d103.2a7450d76.85c8.0×107b9.42b商业直投式酸奶发酵剂24.31a89.23d7550c77.08c7.5×107d6.88c商业直投式酸奶发酵剂34.15c100.08b7600b78.51b7.9×107c10.63a
2.3.2 感官评价
分别从组织状态、色泽、黏稠度、酸甜比、奶香味与酸奶风味6个方面对发酵乳进行感官评价，结果如图6所示。4种发酵乳的综合感官评分中以本实验研究得到的发酵剂生产的发酵乳综合评价最高，特别是奶香味和黏度值评分均高于其他3种发酵剂生产的酸奶，酸甜比、色泽、酸奶风味与商业直投式酸奶没有太大的差别。发酵乳中的双乙酰赋予了发酵乳独特的奶香味，较高的黏度值赋予了发酵乳较好的组织状态和良好的口感。
图6 四种发酵剂研制的发酵乳感官评分图
Fig.6 Fermented milk sensory score map developed by four starters
3 结论
为提高发酵乳的黏度和风味，改善发酵乳口感及后酸化现象，本试验以酸度、pH、持水率、黏度、组织状态及凝乳时间、活菌数为评价指标，从12株云南特色发酵食品分离鉴定的乳酸菌中筛选出5株具有较强发酵性能、食用安全的菌种，即嗜酸链球菌、嗜热乳杆菌、类干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、德式保加利亚乳杆菌亚种；当其按1∶2∶1∶2∶1(体积比)的菌株配比制成DVS时表现出良好的发酵性能，此时发酵乳中酸度、黏度、活菌数以及乙醛和双乙酰含量分别为98.12 °T、8 800 mPa·s、8.2×107 CFU/mL、7.51 μg/mL和9.36 μg/mL；与3种商业直投式酸奶发酵剂相比，该发酵剂生产的发酵乳酸度适宜、产黏性更好、产香能力适中且后酸化现象不明显，总体感官评分值高，有望成为一种新的DVS应用于发酵乳生产，后续将进一步对该发酵剂进行发酵乳的中试化生产。
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