养心草，学名景天三七(Sedum aizoon L.)，又称土三七、养心菜、费菜等，为蔷薇目景天科多年生草本植物，分布于我国华北、华东等地区[1-2]。《名贵中药谱》和《现代中药临床手册》等中医论著认为，养心草具有降血压血脂、活血化瘀、宁心平肝、清热凉血功效，并有降低苯丙胺毒性和扩张冠状动脉作用；同时对吐血、失眠、惊悸癔症也有较好的疗效[3-5]。外用还能达到消肿止血的效果，故有养心草、救心菜之称[6]。近年来，作为一种新兴保健蔬菜，养心草逐渐受到重视与推广，包括对其抗氧化物质的分离提取[7]、功效成分的药学及临床应用研究以及食用开发等[8]。
除了已有记载的功效外，养心草还具有高钙的特点。其钙含量每百克高达331 mg，是牛奶钙含量的3倍，普通蔬菜钙含量的10倍以上[9-11]。钙是骨骼的基本组分，但是从日常食物中摄取的钙量还不足人体所需量的50%[12-13]，如何有效补钙一直是消费者关心的问题。在这一市场需求背景下，养心草高钙食品值得深入研究和系统开发。但是植物来源钙易在加工过程中沉淀流失，不易被吸收利用[14]。本研究针对养心草钙含量高、食用效率低的问题，利用过量有机酸对钙的结合与稳定作用，研制出植物源高钙饮料。旨在为养心草功能食品开发提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
养心草干花、干叶,黑龙江红光农场提供；低聚半乳糖,上海源叶生物科技有限公司；去离子水(自制)；对照样品奶粉,市售。
乙二酸二氢钠、NaCl、NaOH、钙指示剂均为分析纯,上海源叶生物科技有限公司；食品级乳酸,广州穗泽环保科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨,上海缘肽生物技术有限公司；蔗糖、低聚半乳糖均为食品级,上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
L3S紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；FA2204B型电子天平(精确至0.000 1 g)，上海越平科学仪器有限公司；PAL-1手持糖量仪，ATAGO U.S.A.,Inc；UP300-E UVF超纯水机，上海和泰仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BCD-221CHC美菱冰箱，合肥美菱股份有限公司；L550离心机，上海跃核仪器有限公司；LHS-250恒温恒湿培养箱，上海培因试验仪器有限公司；BXM-30R高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；CR-400/410色差仪，上海卡罗卡超仪器有限公司；RE-2000E旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 养心草高钙饮料加工工艺流程与操作要点
干制养心草→加去离子水→煮沸(浸提)→冷却→调节酸度→搅拌→过滤→加低聚半乳糖、蔗糖调配→杀菌→灌装→成品
操作要点：
(1)原料选择。挑选无虫害、外观完整、色泽良好的干制养心草花或者叶作为原料。其中，干花中钙的含量明显高于叶部，为最优原料。干花挑选应尽量完整，无异常变色，无虫害。
(2)浸提。按料液比添加去离子水，进行煮沸浸提。本工艺环节用水需为去离子水，以去除水溶液中离子对产品后续酸度调节的干扰。
(3)冷却。将浸提液冷却至室温，以达到不影响酸度稳定性的目的。
(4)调节酸度。在测定浸提液中钙浓度的基础上，核算所需酸的最低用量，以确保浸提液中游离钙被充分结合。加酸过程须配合搅拌与pH监测，保持浸提液呈微酸性，提高钙的结合效率和稳定性。
(5)杀菌、灌装。高压蒸汽灭菌的条件为95 ℃，900 s，静置、冷却至室温[15-17]。
1.3.2 浸出率测定
称取干制养心草1 g，于锥形瓶中加入一定比例的去离子水，在设定时间和温度条件下浸提，趁热用纱布粗过滤并进行减压过滤。经旋转蒸发浓缩后，取浓缩液于质量已知的称量瓶中，置于105 ℃恒温干燥箱内。每隔1 h测定称量瓶质量变化，至恒重后加盖取出称重，按公式(1)计算浸出率[18]。
浸出率
(1)
式中：w1，称量瓶的质量，g；w2，经干燥后与称量瓶的总质量，g；w0，干制养心草的质量，g。
1.3.3 钙离子检测方法
将浸提液装入锥形瓶中，加水稀释至100 mL。加入5 mL 2 mol/L的NaOH溶液、0.1～0.2 g钙指示剂至pH>12.5后，用EDTA-2Na标准溶液滴定至由红色转变至纯蓝色即为终点。滴定时需不断摇荡，将近终点时，缓慢滴定[19](同时做空白试验)，计算如公式(2)所示：
(2)
式中：ρ(Ca)，样品中钙的质量浓度，mg/L；V1，滴定中所消耗EDTA-2Na溶液的体积，mL；V2，空白所消耗EDTA-2Na溶液的体积，mL；c，EDTA-2Na溶液的浓度，mol/L；40.08，与1.00 mL EDTA-2Na标准溶液相当的钙质量，g；V，所取水样的体积，mL。
1.3.4 单因素试验
(1)浸提时间对浸提效果的影响
称取5份1.00 g养心草分别置于5个烧杯中，加入100 mL去离子水，80 ℃恒温水浴浸提，分别在10、20、30、40、50 min后，用绢布过滤后，将滤液定容至100 mL，测定浸提率及钙溶出量。每个实验重复3次。
(2)料液比对浸提效果的影响
称取5份1.00 g干燥养心草分别置于5个烧杯中，依次加入10、20、30、40、50 mL去离子水，于80 ℃恒温水浴浸提30 min。用绢布过滤后，将滤液定容至100 mL，测定浸提率及钙浓度。每个实验重复3次。
(3)水浴温度对浸提效果的影响
称取5份1.00 g干燥养心草分别置于5个烧杯中，加入100 mL去离子水，分别置60、70、80、90、100 ℃水浴中浸提30 min，用绢布过滤后，将滤液定容至100 mL，测定浸提率及钙含量。每个实验重复3次。
1.3.5 正交试验
在单因素实验的基础上，以浸出率和钙浓度为考察指标，对浸提温度、浸提时间和料液比3个因素，采用L9 (33)正交实验设计，确定最佳浸提工艺。正交实验因素水平见表1。
表1 养心草浸提工艺正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for Sedum aizoon L.extraction process
水平因素时间(A)/min温度(B)/℃料液比(C)/(g∶mL)135851∶35240901∶40345951∶45
1.3.6 感官评价标准
特征风味是饮料重要的感官评价对象，特别是滋味对饮料的风味影响较大[20-21]。因此，本研究将滋味的权重设为40%。本产品风味受养心草原料浓度影响明显，浓度过高易导致饮料涩味加重。同时，添加乳酸也能够较大影响饮料的感官品质，因此设定气味占感官评定标准权重的30%；色泽直接影响消费者的视觉，并间接影响消费者的购买欲，设定其占感官评定标准权重的30%。感官评分标准设计如表2所示。
表2 感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standard
指标分数标准色泽(30分)20～30浅黄色10～20淡黄接近无色≤10深黄色气味(30分)20～30具有养心草香气,清香宜人≤20香气过浓或过淡滋味(40分)30～40无涩味,酸甜适中,协调,爽口润滑20～30涩味较轻,略酸或略甜,口感一般≤20苦涩味重,过甜或过酸,口感粗糙
2 结果与分析
2.1 养心草不同部位钙浸提量的比较
养心草主要食用部位包括花和叶。为了对原料进行选择，本研究对比分析了不同部位浸提液中的钙含量,实验结果如图1所示。
图1 养心草花部及叶部的浸提液中钙质量浓度比较
Fig.1 The comparison of calcium concentration in the extracts from Sedum aizoon L.’s flowers and leaves
相同浸提条件下，即温度为80 ℃，料液比为1∶40(g∶mL)时养心草花与叶浸提液中钙的质量浓度，随浸提时间的变化均不明显。但花中浸提出的钙质量浓度始终大于叶部，前者约为后者的1.6～1.9倍。这说明养心草花中钙的含量更丰富，且组织柔软，易于提取，养心草花部更适合作为原料。因此，本研究以养心草干花作为原料，下文所述原料皆为养心草干花。
2.2 浸提工艺优化
为获得有效的浸提工艺，以养心草有效成分包括干物质浸出率和浸提液中钙质量浓度为指标，对料液比、浸提温度和浸提时间进行了单因素实验和正交优化设计。
2.2.1 料液比对养心草有效成分浸出量的影响
随着料液比的增大，浸提液中钙质量浓度和干物质含量均有所增加，表明浸提液中钙质量浓度与干物质的浸出率间呈正相关。当料液比达到1∶40时，二者均达到最大值，即1∶40料液比对有效成分的浸提效果最佳。
图2 物料比对养心草有效成分浸出量的影响
Fig.2 The effect of material ratio on the component amount of Sedum aizoon L.extracting
2.2.2 浸提温度对养心草有效成分浸出量的影响
如图3所示，随着浸提温度升高，养心草浸提液中钙质量浓度和干物质浸出率逐渐增大，二者均在90 ℃达到最大值。但是浸提温度继续升高，特别是超过95 ℃后，有效成分浸出量趋向平缓并开始下降。这可能是由于部分有效成分高温变性，溶解性降低导致,但是高温影响钙浸出量的原因还有待分析。综上，最佳浸提温度为90 ℃。感官分析也表明，最佳浸提温度条件下得到的浸提液色泽鲜亮，呈淡黄色，并具有养心草的清淡香气。
图3 浸提温度对养心草有效成分浸出量的影响
Fig.3 The effect of temperature on the active components amount of Sedum aizoon L.extracting
2.2.3 浸提时间对养心草有效成分浸出量的影响
如图4所示，有效成分浸出量随浸提时间的增加而增大。当浸提时间超过40 min后，浸提液中钙质量浓度和干物质浸出率均开始下降，表明最佳浸提时间为40 min。
图4 浸提时间对养心草有效成分浸出量的影响
Fig.4 The effect of time on the active components amount of Sedum aizoon L.extracting
2.2.4 养心草浸提工艺优化
单因素实验结果显示，料液比、浸提温度和浸提时间对浸提液中的有效成分含量影响显著，且浸提液中钙质量浓度与干物质浸出率呈正相关规律。因此根据单因素实验结果设计正交实验，优化养心草浸提工艺。选择钙质量浓度作为评价指标，实验结果及方差分析如表3和表4所示。
表3 养心草浸提工艺正交试验
Table 3 Orthogonal tests of Sedum aizoon L. extraction process
组别时间(A)/min温度(B)/℃料液比(C)/(g∶mL)钙质量浓度/(mg·L-1)实验1111669.73实验2122676.35实验3133700.43实验4212697.20实验5223701.48实验6231696.60实验7313676.55实验8321652.10实验9332665.73均值1682.17681.16672.81均值2698.43676.64679.76均值3664.79687.58692.82极差33.6310.9420.01
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性浸提温度1734.78215.176.94∗料液比196.8121.726.94浸提时间640.5625.606.94误差228.664
注：*表示影响显著，P<0.05
由表3数据可知，A2B2C3为养心草的最佳浸提工艺，即浸提温度90 ℃，浸提的时间45 min，料液比1∶40(g∶mL)。经最佳工艺浸提，钙质量浓度可达701.48 mg/L。正交实验分析结果显示，各因素对浸提液中钙质量浓度影响作用从大到小依次为，浸提温度>浸提时间>料液比。表4方差分析结果也表明浸提温度对浸提液中钙质量浓度的影响显著。
2.3 乳酸添加量的确定及风味调配
已知经最优工艺所得浸提液中钙离子质量浓度为701.48 mg/L，即17.54 mmol/L。则为了充分结合钙离子使其形成(CH3CHOHCOO)2Ca·5H2O，所需乳酸物质量浓度的理论值为35.07 mmol/L，即3 156.64 mg/L。以此作为最低乳酸添加量，设计单因素实验探讨乳酸的最适用量,实验结果如表5所示。
表5 乳酸添加量对养心草高钙饮料钙结合率及酸味的影响
Table 5 Effect of lactic acid addition on calcium binding rate and acidity of Sedum aizoon L.high calcium beverage
乳酸物浓度/(mmol·L-1)88%乳酸的添加量/(mg·mL-1)钙离子结合率/%pH酸味303.06885.14无酸感353.58925.08微酸404.09924.96弱酸感454.60924.93酸度适中505.11924.89偏酸
当乳酸物浓度达到35 mmol/L，即乳酸(88%)添加量达到3.58 mg/mL时，钙的结合率达到最大(92%)，此后继续增大乳酸添加量，钙离子结合率均保持不变，但饮料pH值可逐渐降低，有利于乳酸钙的稳定。当乳酸添加量为4.60 mg/mL时，pH值为4.93，感官分析结果显示酸味适中。综合以上因素分析，4.60 mg/mL乳酸为最佳添加量。
本研究以低聚半乳糖作为营养强化剂，利用其自身具有甜味搭配蔗糖进行风味调配。以低聚半乳糖的国标限量6.45 mg/mL为基础，设计蔗糖添加量的梯度为50、100、150、200、250 mg/mL。感官评定结果如表6所示，综合色泽、香味和滋味分析，蔗糖最佳添加量为150 mg/mL。
表6 蔗糖添加量对养心草高钙饮料的感官影响
Table 6 Sensory effects of sucrose amounts on Sedum aizoon L.high calcium beverage
感官评分蔗糖添加量/(mg·mL-1)50100150200250色泽(30分)1819201721香气(30分)2022232419滋味(40分)2423272623总分(100分)6264706763
2.4 钙含量比较与评价
本研究通过与3款市售奶粉对比，对养心草高钙饮料的含钙水平进行评价。取与本产品原料(干制养心草)相同质量的奶粉冲调成等体积可饮用奶品作为对照样品，对照样品与本产品中钙含量的对比分析结果如图5所示。养心草高钙饮料中钙含量高达701.48 mg/L，是新西兰安佳奶粉钙含量的6倍，伊利奶粉钙含量的10倍，雀巢奶粉钙含量的21倍。对比结果表明，养心草高钙饮料的钙含量显著高于等质量复原乳，是一款富含植物钙源的优质饮品。
图5 养心草高钙饮料与不同品牌奶粉复原乳中钙含量比较
Fig.5 Comparison of calcium content in high calcium Sedum aizoon L.beverage and different brands of reconstituted milk
3 结论
本研究从原料分析、成分配比和工艺优化角度较系统的完成了养心草高钙饮料的研制。得到最优工艺条件为，以料液比1∶40(g∶mL)，在90 ℃条件下浸提45 min后冷却过滤，添加4.60 mg/mL乳酸、6.45 mg/mL低聚半乳糖和150 mg/mL蔗糖进行调配。在此工艺条件下，所得优化产品中钙含量高达701.48 mg/L，是相同质量下新西兰安佳复原乳钙含量的6倍，伊利复原乳钙含量的10倍，雀巢复原乳钙含量的21倍。除了具有高钙含量的特点，养心草高钙饮料还具有养心草风味特征、色泽明亮、滋味酸甜。本研究结果表明，养心草作为优良的植物钙源，其高钙功能食品的开发值得深入探讨和系统开发。
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