核桃(Juglans regia L.)具有很高的经济价值，是中国主要核桃区当地农民的主要收入来源[1]。其中核桃油(walnut oil)含有丰富的脂肪酸(饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸)和天然生物活性成分(维生素E、多酚和甾醇)，日常饮食可预防癌症和降低患心血管疾病的风险[2-3]。核桃油不饱和脂肪酸含量在85 %以上，在储藏过程中极易氧化，导致核桃油不同程度的酸败，营养价值下降，显著影响了核桃油的品质与保质期[4]。因此，在保证核桃油稳定和高品质的前提下，寻找一种方法来提高核桃油的抗氧化能力就显得特别重要。
为了保证食用油的安全性和有效性，抑制脂质氧化十分必要[5]。添加适量抗氧化剂可延缓脂质氧化，延长食用油的货架期，人工合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)和没食子酸丙酯(propyl gallate,PG)广泛用于食品添加剂，但其有潜在的毒性积累，安全性一直受到质疑，因此寻找安全、无毒或低毒的天然抗氧化剂是预防脂质过氧化的新趋势[6]。
美藤果(Plukenetia volubilis L.)是大戟科的一种产油植物，其种子富含油脂(35%～60%)和蛋白质(27%)[7]。美藤果油(Sacha Inchi oil)含有大量的亚麻酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸，对人体有益，能够降低肥胖、糖尿病、过敏、老年痴呆症、冠心病和神经退行性等疾病的发生率，还具有护肤功效[8-10]。其维生素E、多酚等天然抗氧化剂的丰富性，让美藤果油具有较强的氧化稳定性[11-12]。添加人工抗氧化剂是增加核桃油氧化稳定性的一种常用方法，其中特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ)对核桃油的抗氧化作用较明显[13-14]。
鉴于目前还未有用美藤果油来提高核桃油的氧化稳定性和品质，及其用TBHQ联合美藤果油延长核桃油货架期的相关研究报道。本研究以核桃油为对象，以添加质量分数0.02% BHT的核桃油为对照组，采用Schaal烘箱法，在不同温度(25、35、45、55 ℃)避光条件下，筛选最佳的美藤果油比例，来提升核桃油的品质和氧化稳定性。并在60 ℃避光条件下，预测核桃油在添加TBHQ和美藤果油后的货架期，为核桃油保存提供一种新策略。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核桃油,迪庆香格里拉舒达有机食品有限公司；美藤果油,西双版纳印奇生物资源开发有限公司。
硫代硫酸钠、三氯甲烷、冰醋酸、KI、淀粉、无水乙醚、无水乙醇、KOH、重铬酸钾、H2SO4等，分析纯，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；特丁基对苯二酚(TBHQ)，上海麦克林生化科技有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，生工生物工程(上海)股份有限公司；19烷基磺酸甲酯，北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器设备
DHG-9053A 真空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司；高效液相色谱，Water USA；FA2004N分析天平,上海箐海仪器有限公司；HHw-D6水浴锅,金坛双捷实验仪器厂；DS.85 10DTH超声波微波组合体系,上海生析超声仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 核桃油氧化稳定性测定
本研究采用超声混合的方法，在核桃油里添加质量分数0、1%、5%、10%、15%和20%的美藤果油，同时添加质量分数0.02% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的核桃油作为空白对照。将油样分别储藏在25、35、45和55 ℃温度下，根据GB 5009.227—2016和GB 5009.229—2016定期测定核桃油的过氧化值(peroxide value,POV)和酸价(aeid value,AV)，以此来表示温度和不同比例美藤果油对核桃油氧化稳定性的影响。
1.3.2 核桃油脂肪酸组成测定
核桃油脂肪酸组成采用气相质谱联用(GC-MS)法测定。将油脂加入2 mL体积分数3%硫酸甲醇，70 ℃水浴甲酯化4 h，再加入100 μL 19烷基磺酸钠和2 mL正己烷，萃取4 h，取正己烷相进行分析[15]。GC-MS条件[16]：HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，高纯氦气为载气，流速1 mL/min。进样口温度250 ℃，不分流；柱温50 ℃保持5 min，以3 ℃/min的速度升至210 ℃保持3 min。质谱条件：EI离子源，电离能70 eV，离子源温度230 ℃。
1.3.3 核桃油多酚含量测定
多酚提取[17]：10 g油脂溶于50 mL正己烷中，用20 mL体积分数60%的甲醇溶液提取3次；提取液真空干燥，残余物用一定体积甲醇进行溶解；然后用福林酚试剂测定油样中的多酚含量，并以没食子酸当量表示，标准曲线的绘制如下：
(1)没食子酸标准储备液(1 mg/mL)：称取(0.100±0.001)g没食子酸标准品，加入少量甲醇溶解后，转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。
(2)没食子酸工作液：用移液管分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL没食子酸标准储备液于100 mL容量瓶中，分别用水定容至刻度，摇匀，浓度分别为10、20、30、40、50 μg/mL。
(3)用移液管移取没食子酸工作液1 mL于刻度试管中，加入0.5 mL福林酚试剂、2 mL质量浓度75 g/L Na2CO3溶液和6.5 mL水，涡旋振荡1 min，70 ℃水浴中反应30 min，用10 mm比色皿，在750 nm波长下测定吸光度。根据没食子酸工作液的吸光度与各工作溶液的没食子酸浓度，绘制标准曲线。
核桃油多酚含量测定[18]：用移液管分别移取水(空白)及样品待测液各1 mL于刻度试管中，加入0.5 mL福林酚试剂、2 mL质量浓度75 g/L Na2CO3溶液和6.5 mL水，涡旋振荡1 min，70 ℃水浴中反应30 min，用10 mm比色皿，在750 nm波长下测定吸光度。若吸光度不在0.3～0.8之间，应适当调整待测样品的称样量或稀释待测溶液，再重新进行测定。多酚含量如公式(1)所示:
(1)
式中：X，核桃油中多酚的含量，mg/kg；C，由标准曲线查得多酚浓度，μg/mL；D，样品定容后的稀释倍数，如未进行稀释，则D=1；E，取液定容体积，mL；m，试样质量，g。
1.3.4 核桃油其它理化指标测定
维生素E含量根据GB 5009.82—2016第一法测定。水分含量根据GB 5009.236—2016测定。皂化值根据GB/T 5534—2008测定。碘值根据GB/T 5532—2008测定。
1.3.5 核桃油货架期预测
采用SCAAL烘箱法[19]，将分别添加20%美藤果油和0.02% TBHQ的核桃油及同时添加20%美藤果油和0.02% TBHQ的核桃油样品放在60 ℃恒温烘箱加速氧化，定期测定其POV和AV。按照GB/T 2716—2018规定，油脂的POV上限为10 mmol/kg，AV上限为3 mg/g。
2 结果与分析
2.1 温度和美藤果油对核桃油过氧化值和酸价的影响
油脂酸价(AV)即中和1 g油脂中游离脂肪酸所需KOH或NaOH的毫克数，过氧化值(POV)即1 kg油脂中活性氧的含量，这2项指标反映了油脂质量及贮藏品质的变化，是评价食用油脂品质的重要指标[20-21]。不同比例美藤果油和温度条件下，核桃油的过氧化值和酸价测定结果见图1、图2。
a-核桃油+美藤果油(25 ℃)；b-核桃油+美藤果油(35 ℃);c-核桃油+美藤果油(45 ℃);d-核桃油+美藤果油(55 ℃)
图1 不同比例美藤果油和温度对核桃油过氧化值(POV)的影响
Fig.1 Effects of different proportions of Sacha Inchi oil and temperature on peroxidation value (POV) of walnut oil
在25、35、45和55 ℃避光条件下检测比例0、1%、5%、10%、15%、20%美藤果油及0.02% BHT(对照)对核桃油POV的影响。如图1-a，25 ℃时20%美藤果油组的POV显著低于0%美藤果油组和0.02% BHT组，也低于1%、5%、10%和15%美藤果油组但无显著性。图1-b、c，35和45 ℃时对照组的POV值显著低于所有的美藤果油组，而20%美藤果油组的POV值比其他美藤果油组低，但无显著性差异。如图1-d所示，55 ℃时20%美藤果油组POV显著低于其他比例的美藤果油组。结果表明，20%美藤果油的添加降低了核桃油的POV值，显著提高了核桃油的氧化稳定性。这可能与美藤果油本身具有较低的POV值(0.57～3.05 mmol/kg)和富含维生素E(177.99～208.12 mg/100 g)、多酚(6.46～8 mg/kg)等天然抗氧化剂有关[22-24]。
GB/T 2716—2018规定食用植物油的POV国家标准为<10 mmol/kg，图1显示，氧化稳定性最好的20%美藤果油组在温度25、35、45和55 ℃条件下，核桃油的保质期分别为>43、>20、>10、>5 d，说明温度的提高会降低油脂的保质期，且温度越低(≤25 ℃)，越有利于油脂的长期保存，这与文献报道的纯美藤果油[12]及铁核桃油[25]的结果一致。
在25、35、45和55 ℃避光条件下检测不同质量分数0、1%、5%、10%、15%、20%美藤果油及0.02% BHT(对照)对核桃油AV的影响。由图2看出，核桃油的AV随着储藏时间的增加而增加，但不同比例美藤果油和温度条件下，核桃油AV无显著性变化，但添加20%的美藤果油的核桃油AV值较其他比例的美藤果油组略低，说明美藤果油对核桃油酸值增长具有一定的抑制作用。
a-核桃油+美藤果油(25 ℃)；b-核桃油+美藤果油(35 ℃);c-核桃油+美藤果油(45 ℃);d-核桃油+美藤果油(55 ℃)
图2 不同比例美藤果油和温度对核桃油酸价(AV)的影响
Fig.2 Effects of different proportions of Sacha Inchi oil and temperature on acid value (AV) of walnut oil
2.2 添加20%美藤果油对核桃油理化指标的影响
如表1所示，添加20%美藤果油后，核桃油的各项理化指标均符合国家标准，其碘值增加，天然生物活性成分如多酚和维生素E的含量也均有显著性提高，分别比未添加前提高了46.25%和32.89%，皂化值、水分及挥发物显著降低。油脂含有越多的天然活性成分，其氧化稳定性和品质越好[26]。研究表明δ-生育酚具有很强的抗氧化能力，γ-生育酚次之，由此可知富含δ-生育酚和γ-生育酚的美藤果油具有较强的抗氧化能力[23]。由于其抗氧化性能，美藤果油的多酚含量(6.46～8 mg/kg)和生育酚的丰富性保证了多不饱和脂肪酸的氧化稳定性，赋予了油脂特有的风味[24]。因此美藤果油的添加可显著提高核桃油的氧化稳定性及品质。
表1 核桃油添加20%美藤果油前后的理化指标
Table 1 Physical and chemical indicators of walnut oil before and after adding of 20% Sacha Inchi oil
项目添加前添加后碘值(以I计)/[g·(100g)-1]142.00±4150.00±4皂化值(以NaOH计)/(mg·g-1)155.02±4.32131.65±4.24∗水分及挥发物/%0.42±0.010.34±0.01∗∗气味、滋味正常无异味正常无异味透明度澄清透明澄清透明多酚含量/(mg·kg-1)4.229±0.546.185±0.31∗∗VE/[mg·(100g)-1]3.01±0.054.00±0.05∗∗
注：*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。下同。
2.3 添加20%美藤果油对核桃油脂肪酸组成的影响
不饱和脂肪酸暴露在氧气、光照、水分和温度下，容易氧化变质，导致核桃油营养价值下降[4]。如表2所示，其中添加前核桃油的饱和脂肪酸为9.32%，不饱和脂肪酸达到89.44%，而添加后的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分别为6.661%和85.32%。结果表明，添加20%美藤果油后，核桃油的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量降低，但必需脂肪酸如亚麻酸含量显著升高。多不饱和脂肪酸包括亚麻酸和亚油酸是人类必需脂肪酸，亚麻酸的增加对人类健康有好处，可预防癌症、冠心病和高血压等疾病，还可降低胆固醇[27]。而美藤果油是亚油酸和亚麻酸的良好来源，具有含量较高的亚麻酸(占总脂肪酸44.28%～46.45%)和亚油酸(占37.88%～40.19%)，是一种优质的天然不饱和植物油[24]。因此添加20%美藤果油后，核桃油的亚麻酸含量显著提高了87.04%，并在一定程度上提高了核桃油的品质。
表2 核桃油添加20%美藤果油前后的脂肪酸组成
Table 2 Fatty acid composition of walnut oil before and after adding 20% Sacha Inchi oil
脂肪酸名称添加前/%添加后/%棕榈酸6.56±0.044.56±0.20硬脂酸2.60±0.171.981±0.50花生酸0.16±0.070.12±0.03棕榈油酸0.08±0.030.05±0.02油酸18.46±1.0511.22±4.36顺-11-二十烯酸0.13±0.130.19±0.06亚麻酸8.09±0.3216.36±0.63∗∗亚油酸62.68±0.9057.50±0.40∗饱和脂肪酸9.326.661不饱和脂肪酸89.4485.32
2.4 0.02% TBHQ和20%美藤果油对核桃油货架期的影响
据Arrhenius公式，油脂在60 ℃存放1 d相当于10 ℃存放1个月(32 d)[28-29]。在温度60 ℃避光条件下，预测分别添加20%美藤果油和0.02%TBHQ的核桃油及同时添加20%美藤果油和0.02%TBHQ的核桃油的货架期。如图3所示，60 ℃避光条件下，核桃油货架期预测为<3个月，而添加20%美藤果油后，其货架期预测为5个月左右，这可能是由于美藤果油的添加增加了核桃油中多酚和维生素E等天然活性成分的含量，从而提升了核桃油的抗氧化性。研究表明，TBHQ是最有效的抗氧化剂，其次是BHT和BHA[30-31]，且TBHQ与天然抗氧化剂(如：迷迭香提取物、茶多酚和维生素E等)复配使用，对提高棉籽油的氧化稳定性具有良好的协同增效作用[32]。本研究添加TBHQ后，核桃油和添加20%美藤果油的核桃油的货架期预测为>29、>33个月，结果显示0.02% TBHQ+20%美藤果油组的核桃油的货架期比0.02% TBHQ组延长了4个月，说明TBHQ与复合油脂中富含的VE和多酚等天然抗氧化剂具有协同增效作用，从而显著延长核桃油的货架期，且在货架期间各组核桃油的AV均未超出国家标准范围值。
图3 60 ℃避光条件下0.02% TBHQ和20%美藤果油对核桃油货架期的影响
Fig.3 Effects of 0.02% TBHQ and 20% Sacha Inchi oil on shelf life of walnut oil in 60 ℃ dark conditions
3 结论
添加20%美藤果油后，核桃油的各项理化指标均在国家标准范围内，天然抗氧化成分包括多酚和维生素E的含量比添加前提高了46.25%和32.89%，饱和脂肪酸含量略有降低，而多不饱和脂肪酸如亚麻酸的含量增加了87.04%。在0.02% TBHQ和20%美藤果油的协同作用下，60 ℃核桃油的货架期预测为>33个月。
本研究结果表明,20%美藤果油的添加量能够显著提高核桃油的氧化稳定性和品质，同时添加0.02% TBHQ和20%美藤果油可为延长核桃油的货架期提供一种新策略。
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