山核桃(Carya cathayensis Sarg.) 又名核桃，是胡桃科山核桃属植物，国家3级保护濒危植物[1]。核桃在国际市场上与扁桃、腰果、榛子并称“四大坚果”[2]，原产于古波斯，由中国汉朝张骞出使西域后带回[3]。我国山核桃资源丰富，品种繁多，广泛分布于辽宁、天津、安徽、广西、云南等22个省份，栽培面积和产量均居世界首位[4]。山核桃油中富含多不饱和脂肪酸以及生育酚、黄酮、植物甾醇等活性成分，具有预防心脑血管疾病、促进婴儿大脑发育和视网膜发育的功效[5]。因此山核桃油作为一种功能性的植物油脂，正受到国内外的广泛关注。
ARRANZ等[6]研究发现，核桃油的综合抗氧化能力要优于花生油和杏仁油，但核桃油的氧化诱导时间(4.7 h)明显短于花生油(14.6 h)、杏仁油(21.8 h)、开心果油(44.6 h)以及榛子油(52.7 h)，这是由于核桃油中不饱和脂肪酸占88.38%～95.78%，核桃油在贮藏过程中极易发生氧化。不同贮藏条件如温度、氧气、光照和湿度等都会影响油脂的氧化稳定性。张良等[7]研究发现，随着氧气压力的增大，油脂的氧化速率也随之增大；MATE等[8]研究发现，高氧与低氧条件下贮存的核桃仁的过氧化值有显著性差异；王炜等[9]研究了不同贮藏温度对核桃油氧化稳定性的影响，结果表明低温能有效抑制脂肪酸氧化。但系统性地研究3个因素对山核桃油氧化稳定性的综合影响还未见报道。
食用油氧化稳定性的评价方法有很多，有活性氧法、schaal烘箱法、热重法、氧弹法[10]、化学发光法[11]、Rancimat法以及差示扫描量热法等[12]。这些方法都存在样品用量大、实验时间长、操作繁琐、实验误差大等缺点。高压差示扫描量热法(pressure differential scanning calorimetry,PDSC) 是指在程序控温下，仪器测量输入到被测样品和参比物的功率差和温度(或时间)的关系。具有用样少、快速检测、重复性好等优点。PDSC法可用于测定油脂氧化诱导温度和氧化诱导时间，其原理是油脂样品在程序温度的控制下发生氧化反应放出热量，测定输入到被测样品和参比物两端产生的热流速率差对温度(或时间)的关系，由放热峰起始端引出的最大斜率切线与外推基线的交点即为油脂的氧化诱导温度(或时间)[13]。目前PDSC法主要应用于工业油的研究当中，用于评价食用油氧化稳定性的研究相对较少。CIEMNIEWSKA-ZYTKIEWICZ等[14]使用PDSC法与Rancimat法研究了橄榄油、榛子油和菜籽油的氧化稳定性；LOPEZ-BECEIRO等[15]用PDSC法评价了橄榄油、玉米油、大豆油以及葵花籽油的氧化稳定性；RATUSZ等[16-17]用PDSC法和Ranciamt法研究了亚麻籽油和亚麻荠油的氧化稳定性；ADHVAYUA等[18]使用PDSC法和核磁共振光谱法研究了不同油脂的氧化动力学；张奥君等[19]使用PDSC法对南瓜籽油的氧化稳定性以及氧化动力学进行了研究。目前还没有使用PDSC法评价山核桃油氧化稳定性的研究报道。
本文使用PDSC法研究了环境压力、氧气含量以及温度对山核桃油氧化诱导时间的影响，从而为改善山核桃油的加工条件、包装方式以及贮存条件以延长货架期提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山核桃油自制，选用产自吉林长白山的野生山核桃经低温压榨得原油，精炼后置于棕色瓶冷藏保存，样品未添加任何抗氧化剂。
101-2A型电热恒温鼓风干燥箱，上海慧泰仪器制造有限公司；韩皇全自动榨油机，韩皇电器科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，邦西仪器科技有限公司；电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；DSC 8500型高压差示扫描量热仪，铂金埃尔默PerkinElmer公司。
1.2 实验方法
本实验利用PDSC法测定山核桃油的氧化稳定性。PDSC有程序升温法和恒温法2种，本实验采用恒温法。称取(2.5±0.5) mg山核桃油样于直径为6 mm开口铝皿中，置于实验炉中。通入一定压力的高纯氧，初始温度为50 ℃，在氧气氛围下以40 ℃/min的升温速率升温至实验温度，恒温至样品完全氧化。实验指标取的是氧化诱导时间(tonset)。实验前对仪器进行校正。
1.2.1 单因素实验
1.2.1.1 压力对山核桃油氧化稳定性的影响
实验氧气体积分数为60.5%、温度为120 ℃，控制压力分别为15、52.5、107.5、162.5、200和217.5 psi，分别测定山核桃油的tonset。
1.2.1.2 氧气浓度对山核桃油氧化稳定性的影响
实验温度为120 ℃、压力为107.5 psi，在氧气体积分数分别为21%、37%、60.5%、84%和100%的条件下测定山核桃油的tonset。
1.2.1.3 温度对山核桃油氧化稳定性的影响
实验压力为107.5 psi、氧气体积分数为60.5%的条件下，温度分别控制为100、110、120、130和140 ℃，测定山核桃油的tonset。
1.2.2 响应面实验
通过单因素实验，发现3个因素对山核桃油氧化诱导时间都有极显著影响。为了研究3个因素之间的交互作用对山核桃油氧化诱导时间的影响，使用Design-Expert.8.0软件设计3因素5水平中心设计(central composite design,CCD)响应面实验，以tonset为响应值进行响应面优化实验。
1.3 数据分析
所得PDSC放热曲线使用Pyris Manager软件进行处理得到实验结果。响应面实验设计和结果分析使用Design-Expert.8.0软件来完成。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 压力对山核桃油氧化稳定性的影响
如图1所示，压力对山核桃油氧化诱导时间有极显著影响(P<0.01)，随着压力的增大，山核桃油的氧化诱导时间缩短。在压力低的范围内，改变压力，氧化诱导时间显著缩短；而162.5 psi以上，增大压力对山核桃油氧化诱导时间没有显著的影响。这可能是因为在压力增大到一定程度时，压力对反式脂肪酸和饱和脂肪酸的增加有抑制作用，即有助于油脂氧化反应的逆向进行[20]。
图1 压力对山核桃油氧化诱导时间的影响
Fig.1 The effect of pressure on oxidation induction time of walnut oil
注：图中不同小写字母代表有显著性差异。下同。
2.1.2 氧气浓度对山核桃油氧化稳定性的影响
如图2所示，氧气浓度对山核桃油氧化诱导时间有极显著的影响(P<0.01)，且组间都有显著性差异，在21%～100%氧气体积分数范围内，提高氧气体积分数，山核桃油氧化诱导时间逐渐缩短，氧化反应速率逐渐加快。
图2 氧气浓度对山核桃油氧化诱导时间的影响
Fig.2 The effect of oxygen concentration on oxidation induction time of walnut oil
2.1.3 温度对山核桃油氧化诱导时间的影响
如图3所示，温度对油脂的氧化诱导时间有极显著的影响(P<0.01)，组间均有显著性差异，随着温度的升高，山核桃油的氧化诱导时间在逐渐缩短。
图3 温度对山核桃油氧化诱导时间的影响
Fig.3 The effect of temperature on oxidation induction time of walnut oil
2.2 响应面实验
2.2.1 建立模型与显著性检验
根据单因素实验结果，即3个因素对山核桃油氧化诱导时间均有极显著影响，设计3因素5水平CCD实验。具体因素水平见表1，响应面实验设计和结果见表2。
表1 响应面分析因素水平表
Table 1 Factors and levels table of response surface method
水平因素压力(A)/psi氧气浓度(B)/%温度(C)/℃-1.681521105-152.5371110107.560.51201162.5841291.68200100135
表2 响应面实验设计和结果
Table 2 Design and results of response surface method
试验号压力(A)/psi氧气浓度(B)/%温度(C)/℃tonset/min100-1.68107.789211120.499300039.3364-1-1125.9925-1-1-190.2026-1.680053.67671.680035.4948001.6815.224900038.2321011-162.29611-11-176.11412-11123.017131-1-176.9541400038.054151-1121.401160-1.68046.9171700038.9531801.68033.684
以tonset作为响应值，对实验数据进行处理分析，经过二元多次回归拟合，得到响应面回归分析见表3。由表3可知，模型的概率值P<0.01，说明山核桃油的回归方程模型极显著；失拟项P=0.116 0>0.05不显著，说明该模型的可信度高，在被研究的整个回归区域内拟合较好；多元相关系数R2=0.998 9，表明该模型可以解释99.89%的响应值的变化，并且调整决定系数
与相关系数接近，表明该模型与实验的真实数据拟合很好；调整决定系数与预测决定系数的差值
为0.002 6，说明模型的实验值与预测值相关性很高，所建模型准确。回归分析得到山核桃油的氧化诱导时间(tonset)对压力(A)、氧气浓度(B)、温度(C)的二次多项回归方程如公式(1)所示：
tonset=2 019.496-0.833A-1.935B-28.105C+5.040×10-3AC+1.470×10-2BC+6.621×10-4×A2+9.859×10-2×C2
(1)
A、B、C、AC、BC、A2、C2 对山核桃油tonset均有极显著影响(P<0.01)。由回归方程可知，随着压力升高、氧气体积分数增大和温度升高，山核桃油tonset均缩短。3个因素对山核桃油tonset的影响程度排序为:温度(C) >氧气浓度(A) >压力(B)。MEXIS等[21]研究发现温度对核桃仁贮藏氧化稳定性的影响大于包装透氧性即氧气浓度对其的影响，这与本文研究结果一致。
表3 回归方程模型方差分析
Table 3 Variance analysis for the regression mode
方差来源平方和自由度均方F值Pr>F显著性模型11545.7871649.401265.72<0.0001∗∗A307.031307.03235.61<0.0001∗∗B220.521220.52169.22<0.0001∗∗C10042.28110042.287706.29<0.0001∗∗AC49.79149.7938.200.0001∗∗BC77.31177.3159.33<0.0001∗∗A253.07153.0740.73<0.0001∗∗C2843.621843.62647.38<0.0001∗∗残差13.03101.30失拟项11.9471.714.680.1160纯误差1.0930.36总和11558.8217R2=0.9989R2adj=0.9981R2pred=0.9955
注:*表示显著(P<0.05)；**表示极显著(P<0.01)。
随着温度升高，tonset缩短，是因为温度升高，氧分子运动性增强，氧化速率加快导致。朱冉等[22]研究发现，在60～180 ℃范围内，随着温度的升高，核桃油氧化逐渐加快；陆浩等[1]使用Rancimat法测定核桃油氧化稳定性，结果表明在100、110、120、130、140 ℃条件下，氧化反应速率随温度升高而加速，这些研究结论都与本文实验结果一致。由公式(1)计算可知温度每升高10 ℃，tonset缩短约一倍，符合温度与油脂氧化酸败的规律，孙曙庆等[23]的研究结果也与该结果一致；Arrhenius方程也表明反应速率随温度升高呈指数型增长，与本实验结论相一致。因此在山核桃油的保存和贮藏期间，应严格控制食用油存放的温度，这有利于延缓油脂的氧化变质，延长保质期。
氧气浓度增大，山核桃油氧化反应速率加快，从而缩短tonset。脂肪酸的自动氧化是由于核桃油中的游离基吸收了环境中的O2从而发生了一系列的反应，在其他条件一定时，高氧条件会加速游离基对O2的吸收，因此核桃油氧化变质的速率随氧气浓度增大而加快，杨春燕等[24]的研究得到同样的结论；MATE等[8]发现低氧储藏可以有效减缓核桃仁氧化；杨媛媛等[5]研究发现真空和充氮贮藏有利于减缓核桃油氧化；王炜等[25]的研究证明，对核桃油进行低氧贮藏可以减少环境中的可吸收基态氧，从而减弱了游离基对O2的吸收，可有效抑制油脂的氧化酸败。这些研究结论都表明氧浓度变化会影响油脂氧化反应速率，从而改变氧化诱导时间。这为食用油及含油量高的食品的气调包装和贮藏提供理论依据。
增大压力会使氧化反应速率加快，tonset缩短。这是由于在有气体参加反应的体系中，当其他条件不变时，增大压力，气体浓度增大，单位体积内总分子数增加，分子间的有效碰撞次数增加，故反应速率加快。陈发庆等[26]研究证明压力会诱导油脂氧化；WANG[27]和MA等[28]研究证明高压会加速不饱和脂肪酸的氧化分解，也有研究证明，增大压力会导致反应物的活化能降低，从而加速反应[29]。
2.2.2 山核桃油货架期的预测
山核桃油的回归方程模型可用于不同压力、氧气体积分数、温度的条件下山核桃油氧化诱导时间的预测。根据模型(1)，预测在常压常氧(即压力为15 psi，氧气含量为21%)条件下不同温度所对应的氧化诱导时间如表4所示，温度从105 ℃升高到135 ℃,山核桃油tonset从142.796 min缩短到21.023 min。通过对lg tonset与温度(T)的关系作图，发现lg tonset与T呈线性相关(图4)，回归分析后得到二者之间的关系如公式(2)所示:
lg tonset=-0.027 9T+5.102
(2)
相关系数r=0.998，表明此方程拟合程度好，两者之间线性关系很强。由公式(2)可推导出山核桃油在常压、常氧、20 ℃条件下货架期为24 d。为验证此方程对山核桃油货架期预测的准确性，将山核桃油贮存在常压、常氧、20 ℃条件下，测定其过氧化值，得到山核桃油的货架期为18～30 d，这与公式(2)的预测结果一致。卢付清等[30]的研究结果(16～32 d)也与本文结果一致。由公式(2)可知，山核桃油氧化诱导时间随温度升高呈指数型缩短，因此建议山核桃油在加工、运输、贮藏过程中应避免高温。
表4 不同温度下山核桃油的氧化诱导时间(常压、常氧)
Table 4 Oxidation induction time of walnut oil at different temperatures(at ordinary pressure and normoxia)
温度/℃tonset/min105142.79611582.48712541.89613521.023
图4 不同温度下山核桃油的lg tonset变化
Fig.4 Changes in lg tonset of walnut oil at different temperatures
2.2.3 压力、氧气浓度、温度交互作用分析
由表3回归模型方差分析结果可知，压力与温度、氧气浓度与温度之间都有交互性，其中氧气体积分数和温度的交互作用对山核桃油氧化稳定性的影响更大，压力和温度次之。这可能是由于温度变化会改变氧分子活跃程度，从而交互影响了氧化反应速率，压力在某种程度上体现了氧分压，从而也会产生交互作用，压力和氧气浓度的交互影响则不显著。因此建议尽量避免油脂在处于高温、多氧、高压条件下处理。
3 结论
本文使用PDSC法研究了压力、氧气浓度和温度对山核桃油氧化稳定性的影响。单因素实验结果表明，压力、氧气浓度和温度对山核桃油的氧化诱导时间都有极显著性影响，随着压力升高、氧气浓度的增大和温度升高，山核桃油的氧化诱导时间缩短，油脂的氧化稳定性下降。通过响应面实验得到回归方程模型：tonset=2 019.496-0.833A-1.935B-28.105C+5.040×10-3AC+1.470×10-2BC+6.621×10-4×A2+9.859×10-2×C2。该模型极显著,置信度高,拟合性好。实验结果表明氧气浓度与温度、温度与压力之间的交互作用对山核桃油氧化诱导时间都有极显著性影响，这为山核桃油的保藏提供有效依据，同时也根据响应面模型和推算公式预测出在常压、常氧、20 ℃条件下山核桃油的货架期是24 d，因此建议山核桃油在低温、密封条件下贮藏。
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