腐乳(sufu)是以大豆为主要原料，经加工磨浆、制坯、培菌、发酵而制成的调味、佐餐制品[1]。云南牟定腐乳深受云贵川等地区消费者喜爱，然而其生产仍沿用传统工艺，开放的自然条件下微生物种类十分复杂，使腐乳终产品质量极不稳定。
食盐在腐乳的生产中主要具有以下作用：提供咸味；与谷氨酸结合，使腐乳产生鲜味；降低水分含量，增加盐坯硬度；抑制和防止杂菌污染；抑制发酵过程中酶的活性，使其不至过度分解[2]。腐乳中盐含量过低会导致腐乳质地松散或腐败变质，引发食品安全问题[3]；而盐含量过高则会使产品生产周期变长[4]，增加消费者患病风险，使产品的消费受限制[5]。本文分离纯化了云南自然发酵腐乳中的霉菌，并用于制备低盐腐乳，同时分析其理化性质、微观结构、挥发性风味物质及感官特性，以期为低盐腐乳的实际生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 实验材料
大豆，购自安徽省；菜籽油、辣椒、花椒、食用盐，购自云南当地；马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)，北京陆桥技术股份有限公司；2-苯基乙酸乙酯(色谱纯)，阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.2 仪器与设备
YJ-VS-1单人垂直超净工作台，无锡一净净化设备有限公司；G154DWS立式自动压力蒸汽灭菌锅，致微(厦门)仪器有限公司；SHP-15生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；DM2000生物显微镜，徕卡显微系统有限公司；C1000 TouchTM基因扩增仪，美国Bio-Rad公司；Heraeus Multifuge XIR冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；Agilent 1100氨基酸分析仪，美国安捷伦科技有限公司；S220 Seven Compact pH计，梅特勒-托利多公司；X08A自动硝化装置，上海晟声自动化分析仪器有限公司；K1302自动定氮分析仪，上海晟声自动化分析仪器有限公司；Trace 1300 GC-MS色谱仪，赛默飞世尔科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 腐乳发酵菌种的分离纯化
从腐乳厂随机采集自然发酵3 d后的毛坯，将毛坯分别以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七个梯度稀释，每个梯度取100 μL涂布到PDA平板中，28 ℃培养观察。
取平板上单个菌落，以点接法接种在PDA平板上，28 ℃培养观察，直至菌落形态稳定且单一。用生物显微镜对分离菌株的形态进行观察。
1.2.2 低盐腐乳的制备
腐乳的制备工艺参考地标DB53/T 713—2015[6]，大豆经浸泡后磨浆、煮浆、点浆、压榨成坯，然后切成小块，制得豆腐；在豆腐上均匀地喷洒霉菌孢子悬浮液，培养3 d，制得毛坯；将毛坯进行晾晒、盐渍(10 kg毛坯中含500 g盐)，得到盐坯；盐坯与辣椒、花椒、姜片、不同比例的盐(10 kg盐坯中分别含1 000、700、400 g盐，分别相对于传统牟定腐乳100%、70%和40%的盐添加量)混匀后装瓶，加入汤汁(含体积分数为3%乙醇)后发酵90 d制得低盐腐乳。
1.2.3 低盐腐乳理化指标的测定
水分含量[7]：按照国家标准GB 5009.3—2016中规定的“直接干燥法”进行检测。
NaCl含量[8]：按照国家标准GB 5009.44—2016中规定的“佛尔哈德法(间接沉淀滴定法)”进行检测；
总酸含量[9]：按照国家标准GB/T 12456—2008中规定的“酸碱滴定法”进行检测；
氨基酸态氮含量[10]：按照国家标准GB/T 5009.235—2016中规定的“酸度计法”进行检测；
水溶性蛋白含量[11]：按照农业部推荐标准NY/T 1205—2006进行检测；
粗蛋白含量[12]：按照国家标准GB 5009.5—2016中规定的“凯式定氮法”进行检测；
蛋白质水解程度：以氨基酸态氮(amini acid nitrogen,AAN)/总氮(total nitrogen,TN)结合水溶性蛋白(water-soluble protein,WP)/粗蛋白(crude protein,CP)的百分比表示蛋白的水解程度。
1.2.4 菌种的鉴定
所分离菌株的全基因利用CTAB法提取。PCR扩增引物采用真菌通用引物NS1:5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和NS8:5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’。PCR反应体系见表1，PCR反应采用Taq PCR Master Mix试剂盒。PCR的循环步骤：94 ℃预变性4 min，34次循环，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物送至北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司测序。
表1 PCR反应体系
Table 1 The reaction system of PCR
试剂加入体积/μLTaqPCRMasterMix12.5PrimerF0.5PrimerR0.5ddH2O11.5DNAtemplate1
根据其所测的序列在NCBI网站中进行比对，找出与所测序列最相似的菌株，并采用Mega 7.0软件构建系统发育树。
1.2.5 低盐腐乳游离氨基酸含量的测定
采用氨基酸分析仪进行测定，具体方法参考文献[13]。
1.2.6 低盐腐乳微观结构的观察
采用扫描电子显微镜对低盐腐乳微观结构进行观察，具体方法参考文献[14]。
1.2.7 低盐腐乳挥发性风味物质的测定
样品前处理：将5 g腐乳、1 g NaCl和5 g H2O充分混匀后，取5 g混合物于顶空瓶中，上机分析前加入20 μL 2-苯基乙酸乙酯甲醇溶液作为内标物(内标物质量浓度为320.5 μg/mL)。
采用色谱仪进行测定，具体方法参考文献[15]。
1.2.8 低盐腐乳的感官评价
低盐腐乳的感官评价参考地方标准DB53/T 713—2015[6]、沈子林[16]、张晓鸣等[17]的方法，并结合实际样品进行了一定修改：10名感评人员(5男5女)分别按照表2对腐乳的色泽、香气、质地、滋味进行评分，按照表3对腐乳进行接受度检验。
表2 腐乳感官评价标准
Table 2 The table of sufu sensory evaluation
项目标准得分/分色泽表面呈淡黄色,断面呈杏黄色7～9颜色偏白或偏暗4～6颜色不正,发黑1～3香气香气纯正,浓郁,具有腐乳特有的香气7～9香气淡薄4～6有不良气味1～3滋味滋味鲜美,咸淡适口,具有腐乳所特有的滋味7～9滋味较好,口味过咸或过淡4～6有异味1～3质地软硬适中,剖面平滑,细腻软糯7～9太硬或太软,不易挑起或涂抹均匀4～6口感粗糙,有颗粒感1～3
表3 九点评分刻度
Table 3 9-point scoring scale
评价打分/分非常喜爱9很喜爱8一般喜爱7轻微喜爱6无好恶5轻微厌恶4一般厌恶3很厌恶2非常厌恶1
1.2.9 数据分析
实验数据用SPSS 23.0软件进行分析，结果以“平均值±标准差”表示，以P<0.05作为差异具有统计学意义的判断标准；用SPSS 23.0软件对盐含量和理化指标数据进行皮尔逊相关性(Pearson correlation,PC)分析。
2 结果与分析
2.1 菌种的形态学观察
经分离纯化后获得了纯种菌株M2，其形态学观察结果如图1所示。M2菌落中心为浅黄色，边缘为白色，呈薄棉絮状，菌丝茂密，有分生孢子和孢子囊，孢子囊顶生，内含大量孢囊孢子，孢囊梗不分支，根据《真菌学》[18]初步判断为毛霉属真菌。
1-1菌落形态;1-2分生孢子;1-3孢子囊
图1 M2的菌落形态和显微特征
Fig.1 Colony morphology and microscopic characteristics of M2
2.2 分子生物学鉴定
通过NCBI对菌株M2的基因测序结果进行Blast比对分析，结果显示M2与总状毛霉(Mucor racemosus)同源性最高。利用Mega 7.0软件构建菌株M2与毛霉属部分模式种的基因序列系统发育树如图2所示，菌株M2与Mucor racemosus(JF723681.2)处同一进化分支，亲缘关系最近。
图2 M2的系统发育树
Fig.2 The phylogenetic tree of M2
综合对菌种的形态学观察结果以及基因序列的系统发育分析结果，将菌株M2初步鉴定为总状毛霉，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.15264。
2.3 低盐腐乳理化性质分析
低盐腐乳中的盐含量、总酸、氨基酸态氮、水溶性蛋白及粗蛋白含量结果见表4。相对于传统云南牟定腐乳100%、70%和40%(质量分数)盐添加量制备的腐乳(M2-100%、M2-70%和M2-40%)，盐含量分别为8.15、6.83和5.03 g/100 g；水分含量均为69%左右；腐乳的总酸随着盐含量的降低而升高，主要是由于降低盐含量使得其对酶的抑制作用减小，腐乳蛋白水解程度增大造成的；从AAN/TN和WP/CP的结果可看出，腐乳的蛋白水解程度随着盐含量的降低而增大，这与氨基酸态氮和水溶性蛋白的变化趋势相一致。M2-100%、M2-70%和M2-40%理化指标的检测结果均符合云南省地方标准DB53/T 713—2015《地理标志产品 牟定腐乳》[6]中腐乳成熟的理化要求。
表4 低盐腐乳基本理化性质
Table 4 Physicochemical properties of low-salt sufu
样品盐含量/%水分/%总酸/%AAN/%WP/%CP/%AAN/TNWP/CPM2-100%8.15±0.19a68.1±2.5a0.89±0.04b0.55±0.01b3.53±0.21b12.5±0.5a25.1228.22M2-70%6.83±0.20b69.0±0.5a0.92±0.04b0.66±0.03a4.63±0.21a13.3±0.2a28.4134.90M2-40%5.03±0.08c69.7±1.0a1.24±0.11a0.70±0.00a4.97±0.32a12.7±0.3a31.4439.10标准[6]≤15.0≤75≤2.0≥0.45≥3.5
注：同一列中标记有不同字母(a，b，c)的数据间有显著性差异(P<0.05);TN=CP/5.71表示总氮含量
采用SPSS 23.0对各理化指标与盐含量进行皮尔逊相关性分析，结果如表5所示。腐乳中的盐含量与总酸、水溶性蛋白含量呈较显著的负相关，与氨基酸态氮含量、蛋白质水解程度呈显著的负相关，这与文献报道[4]的相似。
表5 皮尔逊相关系数
Table 5 Pearson correlation
项目盐含量水分0.078总酸-0.901∗氨基酸态氮-0.918∗∗水溶性蛋白-0.892∗粗蛋白-0.179AAN/TN-0.989∗∗WP/CP-0.972∗∗
注：**表示在0.01水平(双侧)上显著相关；*表示在0.05水平(双侧)上显著相关
2.4 低盐腐乳游离氨基酸含量分析
低盐腐乳中的游离氨基酸含量结果见表6。M2-100%、M2-70%和M2-40%的总氨基酸含量分别为22.62、26.98、30.59 g/100 g。腐乳中含量最高的游离氨基酸为呈鲜味的谷氨酸，其次为天冬氨酸，随着盐含量的降低，游离氨基酸含量逐渐升高，这与HAN等[19]的研究结果相一致，且与腐乳理化性质的变化趋势相一致。
表6 低盐腐乳中游离氨基酸含量 单位：g/100 g
Table 6 Freee amino acids in low-salt sufu
游离氨基酸M2-100%M2-70%M2-40%呈味谷氨酸4.80±0.105.87±0.476.60±0.05鲜味天冬氨酸2.36±0.042.89±0.353.08±0.02鲜味赖氨酸1.67±0.172.01±0.032.03±0.07甜味脯氨酸1.46±0.111.84±0.252.09±0.08甜味缬氨酸1.38±0.041.73±0.121.84±0.07甜味丙氨酸1.24±0.081.51±0.061.61±0.03甜味苏氨酸1.29±0.051.34±0.101.46±0.16甜味甘氨酸1.12±0.500.90±0.131.38±0.50甜味丝氨酸0.67±0.190.84±0.041.00±0.19甜味亮氨酸2.02±0.072.48±0.162.64±0.03苦味苯丙氨酸1.56±0.121.92±0.042.01±0.07苦味异亮氨酸1.30±0.031.59±0.131.77±0.02苦味酪氨酸0.66±0.060.74±0.010.94±0.07苦味组氨酸0.48±0.050.60±0.100.69±0.01苦味蛋氨酸0.34±0.000.41±0.030.44±0.01苦味精氨酸0.21±0.080.27±0.120.07±0.00苦味半胱氨酸0.05±0.020.06±0.020.07±0.00苦味总量22.62±1.0226.98±2.0130.59±1.14-
注：“-”表示未检测出
2.5 低盐腐乳微观结构分析
采用扫描电镜对低盐腐乳微观结构的观察结果如图3所示。
3-1-M2-100%;3-2-M2-70%;3-3-M2-40%
图3 低盐腐乳的SEM(×1 500)图
Fig.3 The SEM(×1 500) photograph of low-salt sufu
随着盐含量的降低，凝胶结构的孔径逐渐缩小，且更加致密均一。M2-100%内部呈网络结构，存在较多的大孔径，可能是因为蛋白质的水解程度较低，蛋白质胶粒较大，蛋白凝胶结构受到的破坏程度有限；M2-70%的微观结构与M2-100%相似，但M2-70%的凝胶孔径略小；M2-40%的孔径最小，致密均一，说明其蛋白质水解程度最高，这与汪建明等[20]、张媛媛等[21]的结果相一致。
2.6 低盐腐乳的挥发性风味物质分析
低盐腐乳中的挥发性风味物质结果见表7。M2-100%、M2-70%、M2-40%中均检测出了45种挥发性物质，包括15种酯类、12种醇类、5种酸类、4种醛类、4种烯类、2种酮类和3种杂环类物质。3种盐含量的腐乳挥发性物质种类相近，但含量具有显著的差异。M2-100%、M2-70%、M2-40%中挥发性风味化合物含量分别为17 964.42、29 090.05、19 644.56 μg/kg，其中酯类、醇类、烯类含量所占比例较大。腐乳中挥发性风味物质可由蛋白质及脂肪酸等大分子物质的分解代谢及其他酶催化反应(尤其是酯化反应)途径产生；由于不同含量的盐对酶类的抑制作用不同，故含不同盐含量的腐乳中挥发性物质含量不同。
表7 低盐腐乳中的挥发性风味物质
Table 7 Volatile flavor compounds in low-salt sufu
CAS物质名称香气描述挥发性风味物质质量浓度/(μg·kg-1)M2-100%M2-70%M2-40%酯类(15种)106-32-1辛酸乙酯果香940.49±173.27a1501.90±7.69a1042.24±319.40a628-97-7棕榈酸乙酯果香、奶香1630.88±799.26a3110.28±119.39a1544.87±465.60a7619-08-1亚油酸乙酯奶香、花香1906.10±986.40a3488.02±353.58a1418.25±442.90a141-78-6乙酸乙酯果香142.37±8.29b245.07±41.09b661.96±197.61a122-70-3丙酸-2-苯乙酯玫瑰香620.84±6.70b806.53±78.17a673.17±46.35ab56554-60-014,17-十八碳二烯酸甲酯1130.34±490.95ab2114.35±41.95a765.74±280.41b97-64-3乳酸乙酯朗姆酒、奶香113.19±2.11a163.48±46.00a174.32±84.22a7361-30-09,12,15-十八碳三烯酸甲酯171.04±93.55a323.80±11.96a170.90±6.28a93-89-0苯甲酸乙酯冬青油香94.79±19.02a122.58±27.38a124.14±43.23a124-06-1十四酸乙酯椰子香98.24±46.00b220.47±33.24a98.59±15.71b115-95-7乙酸芳樟酯甜果香54.84±20.77a128.75±24.55a59.16±29.98a104-61-0丙位壬内酯椰子香36.78±6.03b61.38±8.50a53.84±0.68ab101-97-3苯乙酸乙酯玫瑰花香40.73±0.20a54.22±2.47a43.17±8.14a123-92-2乙酸异戊酯香蕉香味38.00±53.74a72.40±102.39a31.27±6.15a119-36-8水杨酸甲酯冬青油香19.74±5.45a32.51±6.08a27.19±1.43a小计7038.39±2642.01b12445.73±475.96a6888.80±569.03b醇类(12种)78-70-6芳樟醇铃兰香气3693.66±399.55a5649.54±967.23a4439.94±1193.06a64-17-5乙醇酒味、刺激性辛辣味2894.92±216.20a3861.82±1290.65a3260.59±890.55a123-51-3异戊醇白兰地香、辛辣味694.73±38.45b1110.51±145.77a730.02±75.35b562-74-34-萜烯醇胡椒香、泥土香243.92±26.93a370.47±116.96a340.51±65.87a71-41-01-戊醇杂醇油气味204.16±11.11a319.93±51.86a246.45±147.70a8000-41-7松油醇丁香香气115.40±13.51a192.56±5.04a118.71±47.71a628-99-92-壬基醇73.82±10.38a107.47±61.49a103.13±41.59a32811-40-8反式-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯-1-醇30.97±1.60b31.68±3.61b78.23±20.66a5989-33-3顺-Α,Α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇42.62±10.87a54.86±11.83a45.81±10.02a106-25-2橙花醇玫瑰香、柠檬香70.63±76.99a54.37±22.77a69.06±26.44a
续表7
CAS物质名称香气描述挥发性风味物质质量浓度/(μg·kg-1)M2-100%M2-70%M2-40%14507-02-92,4-癸二烯-1-醇48.96±12.16a65.45±53.56a51.84±7.14a100-51-6苯甲醇花香24.38±2.15a21.70±3.03a27.32±6.25a小计8138.16±535.44a11840.37±2733.80a9511.62±2411.36a酸类(5种)57-11-4硬脂酸246.94±19.65b445.66±40.09a306.06±36.76b57-10-3棕榈酸177.89±12.80a281.11±99.92a201.78±13.94a124-07-2辛酸酸臭味40.41±0.51a44.63±7.42a45.79±18.69a142-62-1己酸汗臭味32.01±8.61a35.21±2.93a38.62±10.65a646-07-14-甲基戊酸酸的刺鼻味27.55±3.26a33.87±10.16a32.86±13.30a小计524.80±1.01b840.48±154.67a625.11±8.07ab醛类(4种)100-52-7苯甲醛苦杏仁香味238.65±29.56a244.30±20.00a151.25±3.60b162376-82-1(9ci)-2,6,6-三甲基-1,4-环己二烯-1-羧醛64.11±3.77a137.31±37.68a96.01±44.65a122-78-1苯乙醛风信子香味46.81±1.96a67.69±5.84a69.17±11.84a2400-66-0二十烷醛20.45±8.44a29.29±6.50a46.87±33.73a小计370.02±26.86a478.59±57.02a363.31±86.62a烯类(4种)5989-27-5(+)-柠檬烯新鲜橙子香气316.25±44.93a921.41±72.66a429.06±391.65a13877-91-3罗勒烯300.83±37.29a530.39±46.53a430.67±210.37a123-35-3月桂烯甜橘味和香脂气348.13±138.94a597.18±248.02a387.95±138.23a3387-41-5桧烯16.06±22.72a41.75±59.05a31.88±45.09a小计981.27±198.45a2090.74±162.84a1279.55±785.34a酮类(2种)546-80-5侧柏酮357.36±59.29a542.59±88.57a501.33±174.19a821-55-62-壬酮果香、花香197.32±116.11a326.03±72.34a154.00±43.36a小计554.69±175.40a868.62±16.24a655.33±217.55a杂环类(3种)96-37-7甲基环戊烷85.88±1.28a148.86±37.20a94.66±31.91a93-51-62-甲氧基-4-甲基苯酚香辛料、丁香、烟熏香气132.10±19.23a165.89±22.15a151.24±55.96a496-16-22,3-二氢苯并呋喃139.12±27.40ab210.77±25.78a74.94±30.59b小计357.10±6.88b525.52±85.13a320.84±6.54b总计17964.42±3584.04b29090.05±3685.66a19644.56±2946.45ab
注：同一行不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)
酯类大多具有特殊香气，可赋予腐乳香甜气味。其中辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸-2-苯乙酯、苯乙酸乙酯赋予了腐乳果香、奶香和花香[22]，苯甲酸乙酯、水杨酸甲酯赋予了腐乳冬青油香，十四酸乙酯、丙位壬内酯赋予了腐乳椰子香。腐乳的挥发性风味物质中，乙酯类物质含量较高，可能是腐乳中脂质水解产生的脂肪酸与所加入的乙醇发生酯化反应生成的；另外，LI等[23]认为酯类的增加主要发生在加入酒精的腌制期，且产生的酯类含量与加入的酒精含量呈正相关。
醇类具有较强烈的香味，腐乳中醇的种类和含量与外界添加有关，腌制时由于添加乙醇，腐乳中醇的种类和含量增加，且醇能与脂肪酸等酸类物质通过酯化反应生成酯类物质。此外，香辛料的加入也大大丰富了腐乳醇类成分，花椒中含有大量的香气成分，其中主要含有芳樟醇、4-萜烯醇、松油醇等[24-25]，因此腐乳中含量最为丰富的芳樟醇、4-萜烯醇和松油醇等，可能来自于配料中的花椒。
腐乳中另一大类挥发性物质是醛类，醛类物质中苯甲醛含量最高，可由游离的苯丙氨酸转化而来[26]，能够赋予腐乳苦杏仁香味。
2.7 低盐腐乳的感官评价
低盐腐乳的感官评定结果如图4所示。M2-100%、M2-70%、M2-40%的色泽和香气无显著性差异，且得分均在7～9分之间，符合腐乳的要求[15]。M2-100%滋味得分为7.20分，M2-70%(8.28分)和M2-40%(7.90分)的滋味得分均高于M2-100%；且M2-70%(8.10分)和M2-40%(7.74分)的质地得分也高于M2-100%(7.00分)。结合低盐腐乳的理化性质来看，可能是由于M2-70%和M2-40%的水解程度比M2-100%高，所以呈味的小分子含量更高，滋味更好，且质地更细腻软糯；而M2-40%的滋味和质地得分相对于M2-70%较低，则可能是M2-40%过度水解导致质地过软，且盐含量过低，滋味相对寡淡。低盐腐乳的喜好度得分顺序为M2-70%>M2-40%>M2-100%，这与滋味和质地的感评结果相一致。
图4 低盐腐乳的感官评定
Fig.4 Sensory evaluation of low-salt sufu
3 结论
通过对分离纯化菌种的形态学观察和分子生物学鉴定，所分离出来的菌种为总状毛霉。将该菌种应用于低盐腐乳的制备，确定降低盐含量可提高蛋白质的水解程度和游离氨基酸含量，使得微观结构更加致密均一；低盐腐乳中共检测出了45种挥发性风味物质，酯类、醇类和烯类含量所占比例较大，且盐含量对挥发性风味物质含量有较大影响；M2-100%、M2-70%、M2-40%腐乳接受度皆较好，但M2-70%的接受度最高。这为M2的实际应用、传统腐乳发酵工艺的改进及低盐腐乳的开放提供了理论指导。
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