酱香型白酒具有酱香突出、优雅细腻、醇厚丰满、空杯留香持久等风味特征，以贵州茅台酒为典型代表，深得消费者青睐[1]。其独特的酒体风格，源于酱香型白酒复杂的酿造工艺和酿造环境所形成的特殊微生物区系[2]。而细菌是其中最重要且研究最多的微生物菌群，能代谢多种酶类并生成多种风味物质及其前体，赋予酱香型白酒独特的酒体风格[3-4]。
“高温制曲”是酱香型白酒酿造工艺的一大特色，也是优化、筛选微生物结构的关键，其制曲温度可高达65 ℃[5]。高温大曲中多为嗜热性细菌，少量为霉菌[6-7]，形成了以嗜热芽孢杆菌为主的特殊细菌群[8-9]。目前，对于酱香风味菌株的筛选多采用高温培养法、热处理产芽孢法、稀释平板涂布法等获得初筛菌株，通过模拟固态发酵闻香，从而获得产酱香风味的菌株。如张小龙等[10]运用稀释平板涂布法并结合模拟固态发酵，从大曲中分离得到2株产酱香浓郁的解淀粉芽孢杆菌；赵兴秀等[11]运用稀释平板涂布法结合固态发酵闻香从大曲中分离得到3株产酱香浓郁的枯草芽孢杆菌；张荣[12]采用高温培养法、热处理产芽孢法和高盐培养法结合固态发酵闻香从大曲中分离得到3株产酱香地衣芽孢杆菌等。纵观上述研究，产酱香的菌株均为芽孢杆菌类菌群，且发酵产物中均含有与产酱香风味相关的物质即乙偶姻[13-14]、四甲基吡嗪[15]和呋喃扭尔等。但此前的研究大多通过模拟固态发酵闻香筛选出产酱香功能菌，极少通过对比固态、液态2种发酵形式而获得目标菌株，因此对产酱香菌株的研究还需考察其液态发酵条件下的产酱香特点，这对于解析酱香风味的形成具有重要意义。
本研究主要以感官风味为导向对初筛菌株进行固态发酵闻香得到产酱香的菌株，对产酱香菌株进一步液态发酵闻香试验，通过对比固、液发酵两种形式从而得到产酱香风味强的菌株。并对其进行液态温度梯度发酵感官闻香剖析，从而获得最优发酵温度条件，为后期解析其风味成分奠定基础，对于提升酱香型白酒酒质提供理论指导。
样品来源：酱香大曲，1～7轮次酿造酱香白酒生产用大曲，采自茅台镇GT、DYT等17个酿酒生产企业。
感官评定参照样：12种香型白酒感官品评标准酒样，中国酒业协会；88种单体纯果蔬、植物花卉闻香单体香标样，法国Aromaster公司；酱香型白酒酿造1～7轮次的堆积酒醅和窖池发酵酒醅、酱香大曲，采自茅台镇GT、DYT等17个酿酒生产企业。
TAE(50×)，北京索莱宝科技有限公司；核酸染料(Gengreen)，上海赛百盛有限公司；DL2000Marker，北京康为世纪生物科技有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。
LB固体培养基：酵母粉5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌30 min。
营养肉汤培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加水至1 000 mL，pH调至7.2，121 ℃灭菌30 min。
麸皮固体培养基：将麸皮与水按质量比1∶1混合，搅拌均匀分装于121 ℃湿热灭菌30 min。
麸皮浸出汁：200 g麸皮，加入800 mL水，蒸煮30 min，3层纱布过滤，分装于121 ℃灭菌30 min，备用。
超净工作台,苏州金净科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅、恒温鼓风干燥箱,Thermo Fisher Scientific；电子天平,上海精密科学仪器有限公司；台式高速冷冻离心机,Thermo Fisher Scientific；PCR仪,美国伯乐公司；DYY-8C型电泳仪,北京六一仪器厂；JS-680C凝胶成像仪,上海培清科技有限公司。SPX-250-II型生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司；THZ-98AB型恒温振荡器,上海一恒科技有限公司。
1.3.1 初筛
采用稀释平板涂布法，将样品用无菌生理盐水进行系列稀释，取合适的稀释度，涂布于LB固体培养基。具体操作步骤如下：
(1)常温稀释平板涂布法
在无菌条件下称取5 g曲样，加入已灭菌的50 mL LB液体培养基中，37 ℃，150 r/min摇床培养1 h，富集培养，制备菌悬液。
稀释涂布：取菌悬液1 mL加入9 mL的无菌生理盐水的试管中，充分振荡，再取稀释液1 mL转入另一支的9 mL无菌生理盐水试管中，充分振荡，逐次稀释到10-2～10-8倍，选取10-4、10-5、10-6浓度梯度，各吸取100 μL直接涂布于LB固体培养基上，每个稀释浓度3个平行，设置3个空白对照。菌悬液被培养基完全吸收后，于37 ℃倒置培养1～2 d。从平板上挑取不同菌落形态的菌株进行逐次划线培养，直至分离纯化得到单菌落，将其编号，4 ℃冰箱保存备用。
(2)高温筛选培养
将上述常温分离得到的菌株，分批制成种子液涂布于LB固体培养基，50 ℃培养1～2 d，观察平板菌落长势。选择生长好的优势菌株作为后续固态发酵试验。4 ℃冰箱保存备用。
1.3.2 感官闻香复筛
1.3.2.1 模拟固态发酵
将培养好的种子液，在无菌条件下，分别按10%的接种量接入麸皮固体发酵培养基中，37 ℃培养2 d，再55 ℃恒温发酵4 d。同时做对照组实验，培养方法相同。
1.3.2.2 模拟液态发酵
将从1.3.2.1中获得的产酱香好的菌株进行液态发酵和感官闻香实验，按5%的接种量接入装有50 mL麸皮浸出汁的150 mL三角瓶中，于150 r/min摇床培养，培养温度为37 ℃培养2 d而后55 ℃发酵6 d，同时做对照组实验，培养方法相同。
1.3.3 感官风味评定标准
构建感官风味评定标准，主要参考酱香型白酒香气特性[16]以及本课题组对酱香型白酒功能微生物发酵特性的研究基础成果。以中国酒业协会12种香型白酒标样为参照酒样、88种单体纯果蔬、植物花卉闻香单体香标样为感官闻香的参照实物样、酱香型白酒酿造1～7轮次的堆积酒醅和窖池发酵酒醅、大曲为参照样，经感官品评小组3次以上的感官闻香后除去发酵醅中明显不存在的冗长特征香气，再结合本研究前期大量发酵预试验发酵产物所表征的香气，从而制定出如图1所示的感官评定模块风味轮，作为后期实验发酵产物的感官闻香标度。每种感官评定的香气模块，均以5分计(0～5分)。应用构建的感官风味结构模块为导向筛选发酵产酱香的细菌，并制定本研究固态发酵感官评分标准(表1)。本研究对每类别发酵样品基质进行3个平行固、液态发酵实验，每个样闻香评定3次。根据文献方法[17]，建立风味感官品评小组，小组由8人组成，年龄在20～45岁。其中有6名研究生，均通过良好的白酒品评专业培训且具有2年以上白酒品评经验，其中1名国家级评委，1名省白酒评委，均具有国家一级品酒师资格。液态发酵评定分数为0～5分，0分为未闻到，5分为闻到的香气最强，取各分值结果的平均值作蜘蛛网图。
图1 微生物发酵基质闻香感官风味模块结构
Fig.1 Microbial fermentation substrate smell sensory flavor module structure
表1 固态发酵感官闻香评定方法
Table 1 Evaluation method of sensory smell of solid fermentation
项目感官评定描述语分值/分黑褐色/深褐色4黄褐色3色泽黄色2淡黄色1+++2++1黏性+1-0酱香纯正、略带酸味4发酵香/异香3香气发酵香、麸皮味、糠味2麸皮味、略带糠味1
注：表中的发酵香、异香以图1中的发酵香和异香为参考；参与闻香评定人员均经过香气识别预先培训;-表示无黏性，+表示有黏性(下同)
1.3.4 菌株的形态学特征
将复筛获得的菌株接种于LB固体培养皿上，于37 ℃倒置培养24 h，待菌落长势好时，直接观察平板上菌落的形态特征。
1.3.5 菌株分子生物学鉴定
将菌株接种于LB 肉汤液体培养基中，于37 ℃、150 r/min 下摇瓶培养24 h，用TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒提取菌株DNA。具体方法参考 TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒的操作说明书。
PCR引物：细菌通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
PCR扩增：在25.0 μL聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)体系中，加上、下游引物1 492r和27f各1.0 μL，Mastermix 12.5 μL，细菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。
PCR反应条件： 94 ℃预变形5 min， 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min， 30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，核酸染料(Gengreen)10 μL，PCR 产物进样量5 μL。
将条带清晰的PCR扩增产物送至上海生物工程有限公司进行测序。所得测序结果输入美国国家生物信息技术中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)数据库中进行BLAST比对，用MEGA 5.0构建目标菌的系统发育树，获得目标菌株的分类学地位或系统发育地位[18-19]。
1.3.6 液态发酵产香优化
为了增强菌株在液态发酵条件下产生的酱香风味，在不改变摇床转速和接种量的情况下优化液态发酵温度条件，具体优化液态发酵温度的设置标准主要依据酱香型大曲制曲温度(曲温达65 ℃)，并参照余婷婷等[20]、张小龙等[10]、张荣[12]的研究方法。发酵温度条件为：55 ℃发酵6 d(条件1)；37 ℃→45 ℃→55 ℃温度梯度发酵，每个温度下发酵2 d(条件2)；37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃温度梯度发酵，每个温度下发酵2 d(条件3)。分别对3个条件下各菌株产生的酱香风味进行感官闻香，选出产酱香风味强的温度条件。
1.3.7 数据处理
将评分数据在Excel 2010中进行整理统计计算，运用Origin 8.6软件完成相关图的绘制。
通过常温稀释平板涂布法共分离得到202株细菌，将初筛细菌通过高温培养，得到23株能在50 ℃生长且生长状态良好的菌株。为得到呈酱香风味的细菌，分别对前述23株菌进行固态发酵，并对发酵结束样品进行感官评定，如表2所示。
表2 23株细菌固态发酵产香风味及其发酵醅感官分析
Table 2 Sensory analysis of flavor and fermented grains produced by solid fermentation of 23 strains of bacteria
菌株编号香气褐变黏性综合评分/分MTQ2麸皮味、糠味淡黄色-2MTQ7酱香、略带麸皮味黄褐色++8MTQ21酱香纯正黑褐色+++10MTQ22奶香味黄色-5MTQ23酱香纯正、微弱酸深褐色+++10MTQ43酱油味、麸皮味黄色+5MTQ45酱香纯正,微弱酸深褐色+++10MTQ47咸菜味深褐色+++9MTQ48咸菜味、麸皮味黄褐色++6MTQ54酸臭味黑褐色+++9MTQ58咸菜味黑褐色+++9MTQ60酱香黄褐色++8MTQ67烂红薯味、麸皮味黄褐色++6MTQ75烂红薯味黄褐色++8MTQ76奶香味、略带麸皮味黄色-4MTQ88酱油味黄色-5MTQ95酸臭味、麸皮味黄褐色++8MTQ105麸皮味、糠味淡黄色-2MTQ112烂红薯味深褐色++9MTQ116烂红薯味黄褐色+++8MTQ122奶香味黄色-5MTQ147酸臭味、麸皮味黄褐色++6MTQ167微弱酱香、酸臭味黄褐色+++8空白组麸皮味淡黄色-2
注：综合评分是3次重复样的综合评分结果
由表2可知，初筛细菌固态发酵产香主要呈酱香、酸臭味、咸菜味、麸皮味、烂红薯味等香气，选择固态发酵产生酱香风味评分高的细菌进行液态发酵，即菌株MTQ7、MTQ21、MTQ23、MTQ45和MTQ60。发酵结果详如图2所示。
a-MTQ21、MTQ7；b-MTQ60、MTQ45、MTQ623
图2 菌株液态发酵感官风味分析
Fig.2 Sensory flavor analysis of liquid fermentation strain
通过对比2种发酵形式下产酱香明显的菌株，最终选定在固、液态发酵条件下均能产生浓郁酱香的3株细菌即MTQ21、MTQ23、MTQ45为目标细菌。以前对于产酱香风味菌株的筛选大多采用逐级温度梯度升温模拟固态发酵，从而筛选出产酱香风味强的菌株，但并没有研究目标菌株在液态发酵条件下产酱香情况，即固、液结合并利用感官风味导向筛选。如李贤柏[21]发现产酱香菌株在小麦固体发酵基质中37 ℃→50 ℃→60 ℃逐级升温发酵6 d酱香较突出；余婷婷等[20]将枯草芽孢杆菌菌株在小麦粒固态发酵中，按照35 ℃→45 ℃→55 ℃→60 ℃温度梯度升温发酵，每个温度下发酵2 d，发酵结束后酱香较突出；张小龙等[10]产酱香功能菌以高粱麦粒模拟固态发酵培养基，发酵温度为35 ℃→40 ℃→45 ℃→50 ℃→55 ℃逐级升温24 h，静止培养5 d，发酵结束后发酵基质酱香纯正。
综上表明，大多聚焦于研究菌株在固态发酵条件下产酱香风味的能力，对于菌株在液态发酵条件下产酱香能力的研究较少。如黄永光等[22]对从酱香型白酒生产制曲、堆积酒醅和发酵期酒醅中分离到的芽孢杆菌于37 ℃液态发酵产香分析中，发现均能产生酱香风味等。
本研究通过模拟固态、液态发酵闻香试验，最终得到3株均在固、液态发酵形式下产酱香浓郁的菌株。但是此液态发酵条件下，所产生的酱香风味相对较弱，且还存在难闻的风味。因此，本研究就此问题对其液态发酵温度条件进行优化，确定其最优发酵温度条件。
对产香菌株MTQ21、MTQ23、MTQ45进行形态学培养分析，具体形态特征如表3所示。
表3 三株产酱香功能菌可培养菌落形态特征
Table 3 The colony morphology of three strains of maotai-producing functional bacteria can be cultivated
菌株编号形态特征MTQ21白色、不规则圆形、边缘丝状、不透明、表面皱褶、质地干燥、不黏稠不易挑MTQ23灰白色、圆形、边缘不整齐、不透明、表面光滑、质地湿润、不黏稠易挑MTQ45浊白色、不规则圆形、边缘不整齐、不透明、表面光滑、质地湿润、不黏稠易挑
以目标菌株的DNA为模板，经PCR扩增出的16S rDNA序列， MTQ21序列大小为1 388 bp；MTQ23序列大小为1 394 bp；MTQ45序列大小为1 388 bp。将MTQ21、MTQ23、MTQ45的DNA序列与NCBI数据库中的序列进行比对，从中获得与目标菌株序列相近种、属的16S rDNA序列，利用 MEGA5.0 软件构建系统发育树分析。从系统树可知，菌株均与地衣芽孢杆菌亲缘关系最近，通过序列比对发现菌株MTQ21与Bacillus licheniformis(NR 074923.1)相似性为99.86%；菌株MTQ23与Bacillus licheniformis(NR 118996.1)相似性为99.93%；菌株MTQ45与Bacillus licheniformis(NR 074923.1)相似性为99.78%。由此可确定3株菌均为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其电泳检测结果与系统发育树详如3～图6所示。
图3 MTQ21、MTQ45、MTQ23菌株PCR产物电泳图
Fig.3 Electrophoresis of PCR products of strains MTQ21, MTQ45 and MTQ23
图4 菌株MTQ21系统发育树分析
Fig.4 Phylogenetic tree analysis of bacterial strain MTQ21
图5 菌株MTQ23系统发育树分析
Fig.5 Phylogenetic tree analysis of bacterial strain MTQ23
图6 菌株MTQ45系统发育树分析
Fig.6 Phylogenetic tree analysis of bacterial strain MTQ45
为增强3株细菌在液态发酵条件下产酱香能力，本研究就发酵温度条件进行探索。如图7、 图8所示。
a-条件1；B-条件2
图7 菌株发酵产物感官风味结构分析
Fig.7 Analysis of sensory flavor structure of fermentation products
图8 条件3菌株发酵结束时感官风味分析
Fig.8 Sensory flavor analysis of strain at the end of fermentation
由图7可知，在发酵温度为55 ℃、150 r/min摇床发酵6 d，结果表明这3株细菌在此条件下产生的酱香风味较弱，且发酵液中伴有青草香、醋酸味、酱油味、生青味、曲香以及麸皮味；在发酵温度条件为37 ℃→45 ℃→55 ℃温度梯度发酵，每个温度发酵2 d 时，逐级跟踪闻香至发酵结束，发现酱香风味依旧较弱，且还伴有青草香、醋酸味、曲香、霉味、生青味、以及微弱酱油味和麸皮味。由图8可知，在发酵温度为37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃逐级升温，每个温度梯度发酵2 d，150 r/min 摇床培养10 d下，通过感官闻香分析，发现发酵结束后发酵液酱香风味突出且空杯留香持久，并伴有曲香、窖底香、生青味、豆豉味以及微弱的麸皮味和青草味，发酵基质呈现深褐色。结合以上实验结果，故选用液态发酵条件为37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃逐级升温，每个温度梯度发酵2 d，150 r/min 摇床培养10 d最宜。
本文通过常温培养法和高温培养法对酱香大曲中的产酱香风味菌株进行初步筛选，得到23株形态差异明显、可在50 ℃条件下生长且长势好的菌株；模拟固、液态发酵，最终得到3株产酱香风味浓郁的菌株，即MTQ21、MTQ23、MTQ45，对这3株菌进行形态观察及分子生物学鉴定确定，该3株菌均为地衣芽孢杆菌。通过优化液态发酵温度条件，最终确定最优液态发酵条件，即以麸皮浸出汁为发酵培养基，在发酵温度为37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃逐级升温，每个温度发酵2 d，150 r/min 摇床培养10 d产酱香最宜。本课题研究只基于感官风味导向层面对产酱香功能菌进行分离筛选，对于其酶学结构及代谢风味特性正在开展进一步的详细研究。
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