水产品中富含n-3系列不饱和脂肪酸,每周食用1~2次水产品可降低充血性心力衰竭、冠心病、缺血性中风和心脏猝死的风险[1]。同时,随着经济的快速发展和人民消费水平、消费能力的急速提高,人们对水产品要求也越来越高,消费者的购买意愿极大程度受水产品的产地和生产条件的影响[2-4]。消费者普遍认为人工养殖的水产品使用了抗生素和生长促进剂[5],而野生水产品则更加健康、美味和营养[6]。为了保证消费者权益,欧盟关于渔业产品第1379/2013号条例规定,水产品标签中应正确标明鱼种、地理来源、养殖方式的信息[7]。但事实上,由于利益的关系,水产品标签中时常存在很多错误信息来诱导消费。在FASOLATO等[3]的研究报告中指出,在市场中采集的29份野生鲈鱼中,有22份为人工养殖。国际海洋保护组织2015年在大西洋进行的一项试验结果表明,超过1/3的受检水产品的标签存在信息错误的问题[8]。同时,在美国的超市和餐饮消费中的养殖鲑鱼有超过一半被贴上了野生鲑鱼的标签[9]。由于水产品的生命周期、膳食来源、膳食结构相比较葡萄酒、茶、咖啡等比较复杂,所以,利用传统溯源方法进行水产品溯源具有一定的局限性[10]。在DNA溯源技术中,养殖和野生的水产品往往是同一种水产品,其在基因水平的差异较小,导致其识别较为困难或者溯源成本较高[11-12]。脂肪酸谱溯源技术是水产品中常用的掺假鉴别技术,其利用不同生产方式的水产品摄入的脂肪酸组成不同以及不同产地来源的水产品的膳食结构不同加以区分[13-16]。但随着经济水平的提高,有机水产养殖得到了快速发展,野生水产品与有机水产品在脂肪酸方面的差异越来越小,单一的脂肪酸谱溯源技术变得越来越困难[2]。此外,随着饲料产业的全球化发展,单一的元素分析在水产品中的溯源也变得越来越困难[17]。不同生长环境的水产品其群落结构、食物来源与组成、代谢水平不同,导致其同位素分馏差异显著,为稳定同位素法在水产品溯源中的应用奠定了基础[10]。稳定同位素技术已成功地应用于水产品的产地溯源以及生产方式鉴别等方面[2-3]。同时,特异性化合物同位素分析(compound-stable isotope analysis,CSIA)已成为水产品产地溯源和掺假鉴别的一种新的工具[2,10]。通过对脂肪酸的δ13C分析对中国沿海地区的海参进行了产地溯源[10],通过对氨基酸的δ13C分析让野生鲑鱼和有机养殖、传统养殖的鲑鱼得到辨别[9]。通过对单糖的δ13C分析成功实现扇贝的产地溯源[18]。其次,当单一稳定同位素技术的溯源效果不够理想时,结合其他溯源技术在水产品的产地溯源和掺假识别等方面能显著提升溯源正确率[19-21]。
质子数相同,中子数不同的同一元素的不同核素被称为同位素,常用于水产品溯源的同位素有δ13C/δ12C、δ2H/1H、δ15N/14N、δ18O/16O[19]。一般而言,水产品体内的C、H、O、N等元素主要依靠食物链摄取[22],但水产品体内某元素的“轻”同位素与“重”同位素的比值受同位素分馏效应的影响[23]。同位素分馏效应是指由于同位素质量不同,在物理、化学及生物化学作用过程中,同位素比值不同的2种物质或同种物质的2种相态间发生的同位素的自然分配效应[24]。对水产品而言,同位素分馏效应受地理来源、生产方式气候条件以及其种间差异等因素的影响,即可利用同位素分馏效应对水产品的产地来源与生产方式进行鉴别[10,19-20]。
通常而言,在水蒸发过程中,随着温度的升高,气相中的δ2H含量降低,而液相中的δ2H会升高,以至于低纬度地区的δ2H含量要高于高纬度地区[25]。生物体内的氢同位素主要与其生活地域的水源状况有关,即生物体内的δ2H具有维度效应[19,26]。对不同产地的罗非鱼的δ2H的研究中发现,δ2H含量具有随纬度升高而减小的趋势[21]。氧同位素与氢同位素的变化趋势相似,表层水中的δ18O受到温度、季节、降雨量、地理位置等因素的影响[19,26-27]。例如,TURCHINI[2]对不同产地的鱼类的水环境的δ18O分析表明,不同产地的水环境间的δ18O差异显著,而且,鱼的肌肉组织中的δ18O与水环境中的δ18O显著正相关,表明δ18O是鱼类产地识别的一个非常有效的指标。同时,由于海洋植物的碳源主要来源于海水中溶解的无机碳,而鱼类饲料中的碳源来源于陆地植物光合作用,即野生鱼类的δ13C高于养殖鱼类[2]。此外,由于野生鱼类与养殖鱼类的营养水平不同,其δ15N值也存在显著差异[28]。所以,稳定同位素分析技术可用于水产品溯源。
2.1.1 产地溯源
由于不同环境中,同种元素的同位素比值不同,即通过检测水产品中的稳定同位素的比值可对水产品进行产地溯源[2,10,19]。马冬红等对不同来源的罗非鱼的δ2H进行测定,结果表明,不同地理来源的罗非鱼的δ2H具有显著差异,以此为溯源指标进行产地溯源,其产地判别初始正确率为85%,交叉判别正确率为80%。KIM[29]对不同来源的鲭鱼、黄鱼、鳕鱼的研究结果表明,不同来源的鲭鱼和黄鱼的δ13C、δ15N散点图中边界清晰,而不同来源的鳕鱼样品在δ13C、δ15N散点图中重合严重[29]。在ZHANG等[30]对我国沿海地区(大连、秦皇岛、青岛、上海、湛江、海口、珠海河口、惠来)的29种野生鱼类样品的研究中发现,珠江河口的鱼类样品的δ13C与大连、青岛和海口地区差异显著,除青岛地区外,上海的鱼类样品中的δ15N与其他地区存在显著差异。在CARRERA等[7]对鳕鱼的产地溯源研究中,6个地区的鳕鱼样品在δ13C和δ15N的散点图中界限明确,表明不同地理来源和的鳕鱼的δ13C和δ15N的组成具有显著差异。对δ13C、δ15N、δ13C vs δ15N分别进行主成分分析(principal component analysis, PCA),根据各自的2D、3D因子载荷图可以明确反映样品的地理来源。CARTER等[31]对澳大利亚对虾和亚洲其他地方的对虾的稳定同位素进行分析发现,在δ13C和δ2H的散点图中,在90%的置信区间上可以明确区分澳大利亚对虾和其他亚洲对虾。ZHANG[32]对来自全国7个地点的3种扇贝的575份样品的δ13C、δ15N进行分析,并对另外150份样品进行线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA),结果表明,不同来源、不同季节、不同种类的扇贝的δ13C和δ15N组成均具有显著差异,LDA结果显示,以δ13C、δ15N为溯源指标进行产地溯源的正确率为92%。周永亮[33]对大连瓦房店市下辖的红沿河镇、谢屯镇、永宁镇、李官镇、三台乡的刺参研究发现,不同来源的刺参中的δ13C和δ15N差异显著,以δ13C和δ15N散点图进行产地溯源得到其产地判别率为71.5%。
2.1.2 生产方式鉴别
在水产品的生产消费中还存在许多掺假等问题,例如将养殖水产作为野生水产进行销售,以低经济价值的同属鱼类来代替高经济价值的同属鱼类,以达到获取更高收益的目的。稳定同位素技术是利用不同养殖方式和同属不同种水产品的稳定同位素组成不同来对水产品的种类和生产方式进行鉴别,从而达到对水产品的掺假鉴别。周永亮[33]对刺参不同生长环境的稳定同位素变化的研究中表明,在自然条件下,成参的δ13C比人工养殖条件下的幼参高0.025%,δ15N值低0.025%,表明生长环境改变,刺参的δ13C和δ15N都将改变,即自然环境下的成参同人工养殖条件下幼参的δ13C和δ15N存在显著差异。TURCHINI等[2]对不同养殖方式默里鳕鱼的稳定同位素研究中发现,鱼体的δ13C和δ15N与其所对应的饲料中的δ13C和δ15N显著相关,表明δ13C和δ15N的来源主要与膳食情况有关,所以可利用δ13C和δ15N来对鱼类进行生产方式的鉴别。FASOLATO等[3]的研究表明,野生欧洲鲈鱼的δ13C和δ15N同养殖欧洲鲈鱼存在显著差异。在郭婕敏等[34]对拟穴青蟹的研究中发现,不同生长阶段的拟穴青蟹的δ13C无显著差异,但野生拟穴青蟹同养殖的拟穴青蟹的δ13C的差异显著,但与模拟野生环境的养殖拟穴青蟹的δ13C差异不显著,表明单一的稳定同位素技术在野生和有机养殖水产品中进行溯源是比较困难的。CARRERA等[7]对13种鳕鱼的δ13C、δ15N进行了测定并绘制了δ13C、δ15N散点图,由散点图可知,除M. polli 和M. sene存在部分重叠外,其余种类分隔明显。同时,ZHANG等[32]对3种扇贝的150份样品的δ15N、δ13C进行LDA判别分析,结果表明,物种预测正确率为98.3%。
2.1.3 溯源正确率影响因素分析
通过对应用稳定同位素技术进行水产品溯源的中英文文献进行分析,仅选取提及了溯源正确率和存在分辨图的对同属水产品进行溯源的文献进行分析。对分辨图进行量化,若分辨图中无重复则代表溯源正确率为100%,若分辨图中存在重复时,溯源正确率=正确归属样品/样本总量。分析结果如表1所示。在水产品的产地溯源中,产地来源数对溯源正确率有极大的影响,在LIU和张旭峰[35]、CARTER[31]和ORTEA[36]对刺参和对虾的产地溯源中,产地来源数的增加使得溯源正确率下降,而在LUO和骆仁军[37-38]对中华绒螯蟹的产地溯源中,产地溯源正确率随着来源数的增加而增加,这种差异可能是由水产品种类不同和样本量不同导致的。通过比较ANDERSON等[12]和WANG等[9]对鲑鱼生产方式的鉴别中发现,样本量对溯源正确率有一定影响。同时,在WANG等[9]对鲑鱼生产方式的研究中表明,单一的稳定同位素技术在有机养殖高速发展的今天适用性将会逐渐降低。
2.2.1 产地溯源
CSIA溯源技术指的是通过测定生物体内某种特异性化合物的稳定同位素,并根据不同产地间该化合物的稳定同位素丰度的差异来进行产地溯源,生产方式鉴别,物种识别等。目前常用的CSIA溯源指标有单糖的δ13C、氨基酸的δ13C、脂肪酸的δ13C等。方志强对不同来源的虾夷扇贝的δ13C和δ15N研究中发强发现[18],在δ13C和δ15N的散点图中,部分地区的虾夷扇贝样品重叠,但对虾夷扇贝的多糖中的各个单糖(鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)的δ13C进行测定并结合PCA分析,结果表明,不同产地来源的虾夷扇贝样品无任何重叠。刘瑀等[39]发现山东和辽宁两地的刺参中的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的δ13C存在显著差异,以色氨酸和酪氨酸为溯源指标能明确区分刺参来源,溯源效果明显优于单一的氨基酸谱溯源[35]。刘瑀等[40]还对大连市辖区下的瓦房店、普兰店、长海县的刺参的氨基酸的δ13C进行测定后发现,不同来源的刺参中的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸的δ13C存在显著差异,同时,以非必须氨基酸的δ13C作为溯源指标进行产地溯源的效果优于以必需氨基酸[36]。在张旭峰[35]对海洋底栖动物的地域性差异研究中,分别对不同来源的刺参、虾夷扇贝和栉孔扇贝的脂肪酸的δ13C进行测定,结果表明,莱州、担子岛、牟平、瓦房店、皮口、长海、獐子岛、乳山/霞浦等地的刺参的大部分脂肪酸的δ13C具有显著差异,秦皇岛、蓬莱、青岛、獐子岛、连云港等地的虾夷扇贝的14∶0、15∶0、16∶1n-7、18∶1n-9、18∶0和20∶4n-6中的δ13C具有显著差异,蓬莱、乳山、青岛、旅顺、连云港等地的栉孔扇贝的14∶0、16∶0、18∶1n-9、18∶3n-6、20∶4n-4、20∶5n-3、20∶3n-6、20∶1n-9和20∶3n-3中的δ13C具有显著差异。LIU等[10]在对莱州、瓦房店、乳山、长海、獐子岛、担子岛、皮口、牟山等地的刺参产地溯源中发现,在刺参脂肪酸的碳稳定同位素的PCA分析中,22∶6n-3、16∶1n-7、20∶5n-3、18∶0和23∶1n-9脂肪酸中的δ13C贡献最高。在WANG等[9]对野生鲑鱼和养殖鲑鱼的鉴别中,通过对氨基酸的δ13C进行LDA分析能分辨出有机养殖鲑鱼和野生鲑鱼的产地。
表1 同属水产品的产地溯源正确率比较
Table 1 Comparison of traceability accuracy of the origin of the same aquatic products
参考文献种类溯源类别来源样本量溯源方法溯源正确率[31]对虾产地溯源澳大利亚、其他地区7.5同位素90.0%[36]对虾产地溯源AOarea71、Argentina、NorthAtlantic、FarmA、FarmB、FarmC、Mozambique、NigeriaSenegal5.6同位素66.7%[37]绒螯蟹产地溯源太湖、高邮湖、洪泽湖、长荡湖、阳澄湖、东滩、巴城、honggao160同位素82.3%[38]绒螯蟹产地溯源东营、盘锦、营口60同位素65.0%[35]刺参产地溯源莱州、担子岛、獐子岛、长海、皮口、瓦房店、牟平、乳山160同位素☆[10]刺参产地溯源莱州、担子岛、獐子岛、长海、皮口、瓦房店、乳山133同位素☆☆[12]鲑鱼生产方式野生、养殖145同位素90.0%[9]鲑鱼生产方式野生,养殖39同位素100.0%[9]鲑鱼生产方式野生,有机39同位素33.0%∗
*注:表示估算溯源正确率;☆越多表示溯源正确率越高
2.2.2 生产方式鉴别
CSIA溯源技术在水产品的掺假识别中也有很多应用。WANG等[9]对野生鲑鱼和养殖鲑鱼的δ13C和δ15N的研究中发现,野生鲑鱼和有机养殖鲑鱼的δ13C和δ15N无显著差异,但通过测定鲑鱼氨基酸中的δ13C并结合PCA和LDA分析发现,以鲑鱼氨基酸的δ13C为指标能完全鉴别野生鲑鱼、有机养殖鲑鱼和传统养殖鲑鱼,其主成分分析中贡献最高的氨基酸为苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丝氨酸。在BELL等[41]对野生和养殖鲈鱼的鉴别中发现,养殖鲈鱼与野生鲈鱼总脂肪酸的δ13C和肌肉组织的δ15N都存在显著差异,同时,养殖鲈鱼和与野生鲈鱼的16∶0、18∶0、16∶1n-7、18∶1n-9、18∶1n-7、20∶1n-9和20∶4n-6等游离脂肪酸的δ13C存在显著差异。
2.2.3 CSIA溯源效果比较分析
通过对应用CSIA进行水产品溯源的国内外文献进行分析,仅选取提及了溯源正确率和存在分辨图的水产品的文献进行分析,在表2中列出了同种水产品的CSIA溯源和其他溯源技术的溯源效果比较。由表2张旭峰[35]的研究可知,虾夷扇贝在不同季节时不同溯源方法的溯源效果比较稳定,而刺参在不同季节时不同方法的溯源效果不同。CSIA溯源在虾夷扇贝和栉孔扇贝中的溯源效果比较稳定,而在刺参中的溯源效果受到了样品季节的影响。其次,在对刺参和扇贝的产地溯源中发现,不同溯源方法的溯源效果还受到了样品的种类的影响。同时,通过对张旭峰[35]和方志强[18]的研究结果进行比较可知,溯源方法的溯源效果还与样品来源的数量有关。
表2 CSIA与其他溯源方法的溯源效果比较
Table 2 Comparison between CSIA and other traceability methods
参考文献溯源类型来源种类时间溯源方法效果[39]产地溯源山东、辽宁刺参秋氨基酸谱☆CSIA☆☆莱州、担子岛、牟平、同位素☆瓦房店、皮口、长海、刺参秋脂肪酸☆☆獐子岛、乳山/霞浦CSIA☆☆☆秦皇岛、蓬莱、青岛、同位素☆☆☆獐子岛、连云港虾夷扇贝脂肪酸☆☆CSIA☆蓬莱、乳山、青岛、同位素☆☆[35]产地溯源旅顺、连云港栉孔扇贝脂肪酸☆☆☆CSIA☆莱州、担子岛、牟平、刺参春同位素☆☆☆瓦房店、皮口、长海、脂肪酸☆獐子岛、乳山/霞浦CSIA☆☆蓬莱、乳山、青岛、栉孔扇贝同位素☆旅顺、连云港脂肪酸☆☆☆CSIA☆☆秦皇岛、蓬莱、青岛、同位素☆☆☆獐子岛、连云港虾夷扇贝脂肪酸☆☆CSIA☆糖谱☆☆秋同位素☆[18]产地溯源秦皇岛、大连、蓬莱、虾夷扇贝CSIA☆☆☆烟台、青岛、连云港糖谱☆☆春同位素☆CSIA☆☆☆[9]生产方式野生、养殖鲑鱼--同位素☆CSIA☆☆
注:--表示未知;☆越多溯源效果越好
2.3.1 产地溯源
单一的稳定同位素技术在水产品溯源中的难度越来越大,同时,大量的研究表明,多种溯源技术相结合的溯源方式对溯源正确率有显著的提高,所以,稳定同位素结合脂肪酸谱、元素组成、理化指标、形态学分析等在水产品溯源中得到大量研究。在ZHANG等[42]对莱州、担子岛、乳山、瓦房店、皮口、长海、獐子岛的刺参的δ13C、δ15N和脂肪酸谱的研究中发现,担子岛和长海地区,瓦房店和皮口地区在δ13C、δ15N散点图中明显重复,但利用样品的δ13C和14∶1n-5的散点图和δ13C和16∶0的散点图依次能将担子岛和长海地区以及瓦房店与皮口地区完全区分。黄丽英等[40]在网销带鱼的产地研究中发现,在4个渔场间的δ13C和δ15N无显著差异的情况下,对稳定同位素结合元素组成进行PCA分析后,4个渔场的带鱼被完美区分[43]。GONG等[16]研究表明,在太平洋中部,秘鲁海岸和智利海岸的鱿鱼的产地溯源中,秘鲁海岸与太平洋中部的鱿鱼样品的δ13C、δ15N散点图中有部分重叠,但当稳定同位素结合脂肪酸谱进行PCA分析后,3个地区的样品被完美区分,其交叉判定准确率率高达100%。骆仁军等[38]在利用δ13C、δ15N为溯源指标对来自8个不同地方的164份中华绒螯蟹样品的产地预测中,其初始正确率仅为83.5%,交叉判别正确率为82.3%,而δ13C、δ15N结合元素组成进行多元分析后,其产地预测原始正确率为99.4%,交叉判别正确率为98.2%。同时,在对东营、盘绵、营口3个地区的中华鳌绒蟹的产地鉴别中发现,以δ13C和δ15N为溯源指标进行产地鉴别,其原始正确率仅为66.7%,交叉判定正确率为65%,而利用多元分析方法结合稳定同位素和元素组成时,其产地溯源初始正确率高达96.7%,交叉判定正确率为91.7%[38]。ORTEA等[36]利用δ13C和δ15N的散点图对45个对虾样品进行产地溯源的正确率仅为75.6%,当稳定同位素结合元素组成后的产地溯源初始正确率为100%,交叉验证正确率高达82.8%。才让卓玛[44]对来自汕头、惠东、钦州、珠海、台山、阳江、湛江的香港牡蛎的稳定同位素和元素组成的研究中发现,以无机元素为溯源指标对香港牡蛎进行产地鉴定时发现,春夏秋冬四季牡蛎的交叉判别正确率分别为66.7%、71.4%、35.7%、80%,当稳定同位素结合元素分析后, 春夏秋冬四季牡蛎的交叉判别正确率分别为83.3%、85.7%、100%、87.7%[44]。
2.3.2 生产方式鉴别
稳定同位素结合元素组成、脂肪酸谱、理化指标、形态学分析在水产品的掺假辨别得到了广泛应用,ORTEA等[36]测定了7个种类的野生对虾和养殖对虾中的δ13C、δ15N,发现养殖对虾和野生对虾的δ13C和δ15N的组成存在显著差异,但利用δ13C、δ15N散点图对45个对虾样品的野生养殖判别分析的初始正确率为77.8%,交叉判别正确率为75.6%,对对虾种类的判别分析的原始正确率为71.1%,交叉判别正确率为66.7%,而当稳定同位素结合元素组成对野生对虾和养殖对虾的判别分析的初始正确率为100%,交叉判别正确率为96.9%,对对虾种类的判别分析的原始正确率为93.5%,交叉判别正确率为80%,溯源正确率得到了显著提高[43]。MORRISON等[45]在对金头鲷鱼的研究中发现,养殖金头鲷鱼和野生金头鲷鱼的δ13C、δ15N、δ18O和16∶0、18∶0、16∶1n-7、18∶1n-9和18∶1n-7等脂肪酸中的δ13C均具有显著差异,将稳定同位素、脂肪酸谱、理化指标等数据进行PCA分析后,在主成分得分图中,野生金头鲷鱼和养殖金头鲷鱼被完全区分。BELL等[41]利用脂肪酸谱、理化指标和CSIA进行PCA分析后实现了对不同来源的养殖鲈鱼和野生鲈鱼的辨别。
采用稳定同位素法鉴定水产品的种类、产地来源,生产方式是可行之策,但随着饲料工业的全球化进程加快,有机养殖的飞速发展,使得同一养殖条件下的不同鱼类,不同养殖地域的同种鱼类的稳定同位素差异越来越小。同时,有机养殖和野生鱼类的稳定同位素差异也逐渐降低。所以,单一的稳定同位素法在水产品溯源方面受到的限制越来越多。
由于其生长环境相似或相同,水产品在稳定同位素、脂肪酸谱、元素组成、氨基酸谱上的差异不够显著,其产地溯源上效果教差。对水产品中的特异性化合物的稳定同位素进行测定,以其中具有显著性差异的CSIA为溯源指标能更有效地进行产地溯源。目前常用的CSIA溯源指标为脂肪酸的δ13C,氨基酸的δ13C,单糖中的δ13C。
CSIA溯源技术在水产品溯源中也受到了捕捞季节、物种类别的影响,以CSIA溯源技术结合脂肪酸谱、元素组成、氨基酸谱进行产地溯源、物种识别、生产方式鉴别越来越流行,其产地溯源准确性越来越高,物种识别越来越精确。
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