以葡萄糖为底物合成2-吡咯烷酮重组谷氨酸棒杆菌的构建及发酵研究

马振锋,徐美娟,杨套伟,张显,邵明龙,中西秀树*,饶志明*

(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏 无锡,214122)

摘 要 2-吡咯烷酮(2-pyrrolidone)因在纺织和制药行业的广泛应用而受到越来越多的关注。通过对合成2-吡咯烷酮途径的关键酶CoA转移酶的挖掘及功能的研究,首次探索了从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中建立2-吡咯烷酮合成途径,为未来可持续合成2-吡咯烷酮工业指明了方向。首先通过敲除N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)阻断L-精氨酸合成途径,促使更多葡萄糖流向L-谷氨酸。其次,通过表达将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的谷氨酸脱羧酶(Gad)突变体,获得合成GABA的重组菌。同时,异源表达经N-端RBS优化的丙酸厌氧菌(Anaerotignum propionicum)来源的CoA转移酶,实现了GABA向2-吡咯烷酮的转化。最终,构建的C. glutamicum EAGAN2重组菌株在5 L发酵罐补料分批发酵72 h时,积累了(8±0.3) g/L的 2-吡咯烷酮。该研究首次在谷氨酸棒杆菌中建立了2-吡咯烷酮合成途径,实现了以廉价原料葡萄糖为底物一步法合成2-吡咯烷酮。

关键词 谷氨酸棒杆菌;2-吡咯烷酮;CoA转移酶;γ-氨基丁酸;谷氨酸脱羧酶

2-吡咯烷酮(2-pyrrolidone)又称丁内酰胺、α-吡咯烷酮,是一种无色结晶,可用作溶剂及有机合成中间体,以及用来制造尼纶4和乙烯基吡咯烷酮等多种化合物的前体,在工业上具有许多重要的应用[1-4]

目前,工业上常通过化学法生产2-吡咯烷酮,先将1,4-丁二醇脱氢得到γ-丁内酯,然后将γ-丁内酯水溶液与氨反应得到2-吡咯烷酮[5]。但这种方法的反应条件苛刻,需要高温高压及催化剂。随着石油资源的减少以及人们对环境恶化的担忧,从可再生资源中利用微生物生产化学品和材料对于可持续化学工业变得越来越重要[6-7]。最近,利用合成生物学策略在大肠杆菌中建立2-吡咯烷酮合成途径的研究已有报道, ZHANG等[8]在大肠杆菌中异源表达来源链霉菌(Streptomyces aizunensis)中的ORF27基因,以L-谷氨酸为底物温和发酵获得1.1 g/L 2-吡咯烷酮。然而,2-吡咯烷酮的产量低,CHAE等[9]进一步挖掘来源于丙酸梭菌(Clostridium propionicum)β-丙氨酸CoA转移酶(Act)催化的ω-氨基酸的活化,然后自发环化,成功在大肠杆菌中建立合成2-吡咯烷酮途径。

本实验室前期以C.glutamicum ATCC13032菌株诱变获得1株Corynebacterium glutamicum E01生产L-谷氨酸为出发菌株,可利用葡萄糖发酵产生25.6 g/L的谷氨酸。首次探索在谷氨酸棒杆菌C.glutamicum E01中建立2-吡咯烷酮合成途径。通过对β-丙氨酸CoA转移酶进化系统分析筛选来源于丙酸厌氧菌(Anaerotignum propionicum)的CoA转移酶(CoA transferase,Act)基因催化γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA),发生环化合成2-吡咯烷酮。敲除L-谷氨酸分支途径L-精氨酸合成中的关键基因argB, 当合成2-吡咯烷酮时,消除精氨酸的竞争,使更多的葡萄糖碳流量流向2-吡咯烷酮合成途径中。完成体外和体内验证设计途径的功能性后,采用N-端RBS优化act基因,平衡谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,Gad)与CoA转移酶表达量来解除中间产物γ-氨基丁酸过多积累问题。最终,培养工程菌株实现了以可再生碳源葡萄糖为底物生产2-吡咯烷酮。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)、Corynebacterium glutamicum E01及质粒pK18mobsacB、pET-28a、pXMJ 19,均由本实验室保藏。

1.1.2 主要实验试剂

限制性内切酶(EcoR I、Hind III)、DL10000 DNA Marker、蛋白Marker,大连宝生物公司;高保真酶、同源重组酶克隆试剂盒,南京诺维赞生物科技有限公司;2-吡咯烷酮标准品,东京化成工业株式会社;γ-氨基丁酸标准品、乙酰CoA、ATP,阿拉丁公司;分析纯甲醇,麦克林公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 PCR引物设计

本研究中PCR扩增所用引物由苏州金唯智生物有限公司合成,引物见表1。

表1 本研究中所用引物
Table 1 Primers used for PCR in this study

引物名称引物DNA序列(5’-3’)gad-FGAAACAGAATTAATTAAGCTTAAAGGAGGGAAATCATGGACCAGAAGCTGTTAAC(Hind III)gad-M-RGGCTGCGGATTGCGGATACTGgad-Del-FCAGTATCCGCAATCCGCAGCCgad-Del-RCAAAACAGCCAAGCTGAATTCTCAGTGATCGCTGAGATATTT(EcoR I)gad-Act-RGATTTCCCTCCTTTTCAGTGATCGCTGAGATATTTact-gad-FAAAGGAGGGAAATCATGAAGCGTCCTCTTGAAGGAAact-RCAAAACAGCCAAGCTGAATTCTTAGATTACGTTTTTCTCTTCAAGG(EcoR I)gad-N2-act-RGGCCCTACTCCTTTTCAGTGATCGCTGAGATATTTact-N2-gad-FAAAGGAGTAGGGCCATGAAGCGTCCTCTTGAAGGAAargB-L-FCTATGACATGATTACGAATTCACCAGAGAAGATTTCTGTGTT(EcoR I)argB-L-RCCCATCCACTAAACTTAAACAGGAGACCCACACGGTTTAGargB-R-FTGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCACCGAGCTGGAGGCCATargB-R-RACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCGACCTCGACGACGGGCC(Hind III)28a-act-FTGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAGCGTCCTCTTGAAGGAA(EcoR I)28a-act-RTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGATTACGTTTTTCTCTTCAAGG(Hind III)

注:碱基加粗为质粒的酶切位点,碱基斜体为基因N-端前的RBS序列

1.1.4 培养基及培养条件

LB培养基(g/L):胰蛋白胨10;酵母粉5;NaCl 10;pH 7.0,固体培养基则加15~20 g/L的琼脂粉,1×105 Pa灭菌20 min。根据实际需要添加适量的抗生素。

LBG培养基(g/L):LB培养基+葡萄糖5,固体培养基则加15~20 g/L的琼脂粉,根据需要加入相应浓度抗生素,用于谷氨酸棒杆菌平板活化和诱导表达。

谷氨酸棒杆菌电转感受态培养基(g/L):脑心浸液(BHI) 37.5、吐温-80 0.1%、甘氨酸30、异烟肼4。根据实际需要添加适量的抗生素。

种子培养基(g/L):葡萄糖25,K2HPO4 1.5,MgSO4 0.6,玉米浆30,FeSO4·7H2O 0.005,MnSO4·H2O 0.005,尿素2.5(与其他组分分开灭菌),用200 g/L NaOH溶液调节pH至7.0,115 ℃灭菌20 min;用于谷氨酸棒杆菌上罐发酵培养种子。

发酵培养基(g/L):葡萄糖140,K2HPO4 1.0,MgSO4 0.6,玉米浆5.0,FeSO4.7H2O 0.005,MnSO4·H2O 0.005,尿素7.0(与其他组分分开灭菌),用200 g/L NaOH调pH至7.0,115 ℃灭菌20 min;用于谷氨酸棒杆菌发酵。

大肠杆菌培养温度37 ℃,旋转式摇床180 r/min。谷氨酸棒杆菌培养温度30 ℃,旋转式摇床180 r/min。

1.2 重组菌株的构建与表达

1.2.1 C.glutamicum E01-ΔargB菌株的构建

根据文献报道,敲除argB基因,可阻断L-谷氨酸流向L-精氨酸的合成[10]。根据GenBank中C. glutamicum ATCC13032的 argB基因序列设计敲除引物。分别以C.glutamicum E01基因组为模板,分别以argB-L-F、argB-L-R和argB-R-F、argB-R-R引物PCR扩增的2个片段,经过重叠延伸PCR获得缺失型片段ΔargB,回收后连接至pK18mobsacB线性化载体,连接产物化转至E. coli BL21 (DE3)。筛选后,提取重组质粒进行PCR验证及测序分析。验证正确的pK18-ΔargB重组质粒电转C.glutamicum E01,涂布含有30 μg/mL卡那霉素的固体LBG平板,于30 ℃培养36 h,经过卡那霉素初次筛选获得一次重组菌。再分别将目标转化子在含100 g/L蔗糖的培养基中进行胁迫二次重组筛选,30 ℃培养24 h后获得二次同源重组菌。提取重组子染色体为模板,以argB基因设计上下游引物进行PCR验证,进行回复野生型/重组型的鉴定,将PCR鉴定为重组型的菌株命名为C.glutamicum E01-ΔargB(C.glutamicum EA)。

1.2.2 2-吡咯烷酮合成途径相关基因的克隆

根据文献报道,通过点突变及C-末端切除改造大肠杆菌gad基因,获得大肠杆菌gad突变体(Glu89Gln /Δ452-466),使得谷氨酸脱羧酶在pH 7下仍具有催化活性[11-12],扩宽了Gad的pH范围。分别以BL21基因组为模板,以相应引物PCR扩增的2个片段,经过重叠延伸PCR获得目的基因片段gad-M,回收后连接至pXMJ 19线性化载体,连接产物化转至E. coli BL21 (DE3)。筛选后,提取重组质粒进行PCR验证及测序分析。验证正确的重组质粒电转C.glutamicum EA,涂布氯霉素平板进行筛选,将验证正确的重组菌株命名为C.glutamicum E01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M(C.glutamicum EAG)。

通过对β-丙氨酸CoA转移酶进化系统分析,筛选来自丙酸厌氧菌的CoA转移酶(CoA transferase,NCBI: WP_066047836.1)的氨基酸序列,由苏州金唯智有限公司进行act基因的合成。分别以重组质粒pXMJ 19-gad-M、act基因合成片段为模板,分别以gad-F、gad-act-R和act-gad-F、act-R为引物PCR扩增的2个片段,经过重叠延伸PCR获得目的基因片段,回收后连接至pXMJ 19线性化载体,连接产物化转至E. coli BL21(DE3)。筛选后,提取重组质粒进行PCR验证及测序分析。验证正确的重组质粒电转C.glutamicum EA,涂布氯霉素平板进行筛选,验证正确的重组菌株命名为C.glutamicum E01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M-act(C.glutamicum EAGA)。

1.2.3 重组菌表达

将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum EAGA、C.glutamicum EAGAN2及含有空载pXMJ 19质粒的C.glutamicum E01对照菌株在LBG固体平板上分别划线活化后,挑取单菌落接入10 mL BHI液体小瓶,30 ℃、180 r/min培养16~24 h后按1%接种量转接至50 mL BHI液体培养基,培养4~5 h后,添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L,继续于30 ℃、180 r/min诱导表达8~12 h后,4 ℃下离心收集菌体细胞后分别用0.1 mol/L pH 7.4 的PBS缓冲液洗涤2次后,重新悬浮于PBS缓冲液中,用超声破碎仪破碎,破碎液在4 ℃下离心20 min,收集上清液,进行SDS-PAGE分析,粗酶液用于后续的酶活力测定。

1.3 酶纯化

为了获得N-末端his标记的act,以act基因合成片段为模板,以28a-act-F 与28a-act-R为引物PCR扩增得到的产物胶回收,胶回收的产物与线性化的pET-28a载体连接,然后将重组质粒化转大肠杆菌E. coli BL21(DE3),即获得E. coli BL21/pET-28a-act菌株。将此重组菌株接种于50 mL LB液体培养基,培养基中加入终质量浓度为50 μg/mL的卡那霉素抗性,37 ℃、180 r/min振荡培养至OD600为0.5时,加入终浓度为1 mmol/L IPTG诱导。采用25 ℃、180 r/min诱导表达8~12 h后,4 ℃下离心收集菌体细胞后分别用0.1 mol/L pH 7.4 的PBS缓冲液洗涤2次,用超声破碎仪破碎,破碎液于4 ℃下离心20 min,收集上清液,进行SDS-PAGE分析。将上清液粗酶液用0.45 μm滤膜过滤后,利用装有Ni-NTA蛋白纯化柱的AKTA Prime蛋白纯化设备来去除杂蛋白,重组酶Act的N-末端带有His标签能与纯化柱上的Ni+进行鳌合,采用咪唑缓冲液进行梯度洗脱,达到纯化酶的目的。然后粗酶液和纯化蛋白进行SDS-PAGE分析验证大小和纯度,利用Bradford试剂盒测定蛋白浓度,以牛血清蛋白作为标准品。

1.4 相关酶的酶活力测定

N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)酶活力检测:具体操作见参考文献[10],1个酶活力单位(U)定义为:在上述反应条件下,每分钟生成1 μmol N-乙酰谷氨酸氧肟酸所需的酶量。

谷氨酸脱羧酶(Gad)酶活力检测:采用Berthlot比色法[13]。1个酶活力单位(U)定义为:在测定条件下每分钟产生1 μmol GABA所需的酶量。

CoA转移酶酶活力检测方法:详细操作参考文献[9],1个酶活力单位(U)定义为:在上述反应条件下,每分钟将1 μmol底物转化为产物的酶量。

1.5 2-吡咯烷酮质谱分析

LS-MS质谱分析采用WATERS QUATTRO PREMIER XE仪器。电喷雾电离(ESI +)ESI在阳离子模式下用于洗脱质谱条件,如下所述:Desolvation Gas Flow 12 L/min; 离子源温度100 ℃; 脱溶剂气温度400 ℃; 毛细管电压3.5 kV。使用扫描模式,扫描质量范围为m/z 50~2 000 kDa。使用MassLynx V4.1进行数据采集和处理。

1.6 重组菌株发酵合成2-吡咯烷酮

菌株经平板活化后,挑取单菌落分别接入种子培养基中,于30 ℃、180 r/min的条件下摇床培养24 h,得到种子液;将种子液以体积分数为10%的接种量接种至200 mL发酵培养基中,摇床培养18 h,获得培养液;将培养液全部转接到含有2.5 L发酵培养基的5 L发酵罐中,30 ℃条件下发酵8 h。8 h后,添加终浓度为0.2 mmol/L的IPTG,于30 ℃条件下继续诱导发酵84 h,获得发酵液;整个发酵过程中,控制通气量维持在40%,控制转速维持在600~800 r/min,控制pH维持在7.0(补加50% NH3·H2O自动控制),流加浓度为800 g/L的葡萄糖溶液控制发酵培养基中葡萄糖量。

1.7 发酵过程中相关参数分析

发酵液菌体浓度适当稀释后,测定OD600,葡萄糖和谷氨酸含量采用生物传感分析仪SBA-40E进行测定。GABA采用HPLC检测,发酵液通过邻苯二甲醛(OPA FMOC) 柱前衍生化测定[14],其色谱条件为:C18色谱柱,柱温控制在 40 ℃,流速 1.0 m L/min,波长338 nm紫外检测器下检测。2-吡咯烷酮采用HPLC检测[15],其色谱条件为:C18色谱柱,流动相:KH2PO4溶液(KH2PO4 10.0 g与己烷磺酸钠1.1 g, 加水溶解并稀释至1 L, 用H3PO4调节pH至2.1)与甲醇体积比为9∶1;流速 1.0 mL/min,波长210 nm紫外检测器下检测;柱温30 ℃。

2 结果与分析

2.1 C.glutamicum E01-ΔargB构建与相关参数测定

根据NCBI数据库GenBank中C.glutamicum ATCC13032的 argB基因,此基因长度为954 bp。采用pK18mobsacB敲除系统,经2轮同源重组筛选,PCR鉴定与测序结果显示,ΔargB缺失碱基为454 bp,与理论值相一致(图1-a)。结果表明C.glutamicum E01菌株中argB基因敲除成功,获得C.glutamicum E01-ΔargB菌株(C.glutamicum EA)。为了更加深入理解敲除argB基因后对菌株的影响,测定生长曲线显示敲除argB基因后不影响C.glutamicum EA菌株生长(图1-b)。测定敲除argB基因前后C.glutamicum E01菌株N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)酶活力情况,敲除argB基因后酶活力几乎为零(图1-c)。摇瓶发酵C.glutamicum E01-ΔargB菌株后,发酵液中几乎检测不到精氨酸,L-谷氨酸的积累量由25.6 g/L提高到28.4 g/L(图1-d)。

2.2 CoA转移酶进化系统分析

为了筛选催化γ-氨基丁酸合成2-吡咯烷酮的酶。通过对β-丙氨酸CoA转移酶进化树系统分析,采用β-丙氨酸CoA转移酶的氨基酸序列在数据库NCBI中进行氨基酸BLAST比对,然后采用MEGA 5.1软件按照Neighbor-joining方法进行系统发育树构建,最后采用在线软件iTOL 5.5进行进化树美化。结果表明,来源于丙酸梭菌的β-丙氨酸CoA转移酶与丙酸厌氧菌、梭状芽孢杆菌(Clostridia bacterium)、新厌氧厌氧菌(Anaerotignum neopropionicum)、厌氧厌氧杆菌(Anaerotignum lactatifermentans)来源的的CoA转移酶蛋白序列相识度分别达到100%、90.93%、90.43%、83.12%(图2)。为了能成功在谷氨酸棒杆菌中建立2-吡咯烷酮合成途径,选择来源于丙酸厌氧菌的CoA转移酶催化γ-氨基丁酸合成2-吡咯烷酮。将CoA转移酶氨基酸序列由苏州金唯智公司进行act基因的合成,大小为1 194 bp。

a-C.glutamicum E01菌株敲除argB基因的PCR扩增鉴定;M-DL20000 DNA marker; 1-argB基因;2-ΔargB缺失;b-C.glutamicum E01菌株敲除
argB基因前后生长曲线;c-C.glutamicum E01菌株敲除argB基因前后NAGK粗酶活力比较;d-C.glutamicum E01与C.g E01-ΔargB菌株发酵参数
图1 C.glutamicum E01-ΔargB的PCR扩增鉴定及相关参数
Fig.1 C.glutamicum E01-ΔargB PCR amplification identification and related parameters

图2 β-丙氨酸CoA转移酶进化树系统分析
Fig.2 Phylogenetic tree analysis of β-alanine CoA transferase

2.3 2-吡咯烷酮合成途径体外验证

E.coli BL21/pET-28a-act菌株诱导表达,细胞破碎液上清纯化采用Ni-NTA蛋白纯化柱的AKTA Prime蛋白纯化设备去除杂蛋白,将纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳分析,结果如图3-a所示,CoA转移酶在E.coli BL21中成功表达,Ni-NTA蛋白纯化柱可以对CoA转移酶纯化,分子质量为43.8 kDa左右。为了检测CoA转移酶催化γ-氨基丁酸合成2-吡咯烷酮的能力,采用比色法体外测定法,体外酶活力测定结果显示Act对γ-氨基丁酸催化活性为20 U/mg,2-吡咯烷酮检测为(56±3) mg/L,而在阴性对照测定中未检测到2-吡咯烷酮。为了确定CoA转移酶转化GABA为2-吡咯烷酮,对2-吡咯烷酮标准液及上述反应液进行LS-MS质谱分析,结果如图3-b所示。

2-吡咯烷酮预期的m/z值为86.07,与理论值一致。以上验证表明,Act对γ-氨基丁酸具有催化合成2-吡咯烷酮的能力。

a-CoA转移酶在E.coli BL21(DE3)中表达与纯化;
b-2-吡咯烷酮LS-MS质谱分析;c-反应样品LS-MS质谱分析;
M-Protein Marker;1- E.coliBL21/pET-28a-Act上清液;
2~5-不同时间收集纯化的Act酶
图3 2-吡咯烷酮合成途径体外验证
Fig.3 In vitro validation of 2-pyrrolidone synthesis pathway

2.4 谷氨酸棒杆菌C.glutamicum E01-ΔargB菌株中建立2-吡咯烷酮合成途径

从可再生的碳源葡萄糖生产2-吡咯烷酮是可持续发展化学工业的方向。首先,选择可以利用葡萄糖的底盘细胞C.glutamicum E01生产L-谷氨酸,然而C. glutamicum E01中不存在天然2-吡咯烷酮代谢途径,为了将2-吡咯烷酮途径引入到谷氨酸棒杆菌中。根据文献报道[11-12]gad突变体(Glu89Gln /Δ452-466)在细胞生长最佳pH 7下仍具有催化活性,在C.glutamicum E01-ΔargB菌株中异源过量表达编码L-谷氨酸脱羧酶的突变体gad-M得到C.glutamicum E01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M(C.glutamicum EAG),将L-谷氨酸转化为GABA,增加细胞内GABA的含量。在摇瓶发酵中,获得(1.3±0.05) g/L GABA(图4)。为了生产2-吡咯烷酮,将pXMJ 19-gad-M-act电转到C.glutamicum E01-ΔargB菌株获得重组菌C.glutamicum E01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M-act(C.glutamicum EAGA),摇瓶发酵中,GABA的含量减少到(593±6) mg/L,2-吡咯烷酮含量为(124±8) mg/L(图4)。

图4 重组菌合成GABA与2-吡咯烷酮的发酵参数
Fig.4 Fermentation parameters of GABA and 2-
pyrrolidone by recombinant bacteria

2.5 限速步骤中间产物GABA的解除

为了使更多GABA合成2-吡咯烷酮,采用提高act基因的表达量。根据文献报道[16] N-端序列可以明显提高基因在谷氨酸棒杆菌中的表达量。将编号为N2的RBS序列添加在act基因N-端前面,获得重组质粒pXMJ 19-gad-M-N2-act电转到C.glutamicum E01-ΔargB菌株获得重组菌C.glutamicum E01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M-N2-act (C.glutamicum EAGAN2), 按照方法1.2.3重组菌诱导表达,破碎细胞后上清液SDS-PAGE电泳分析,重组菌C.glutamicum EAGAN2比C.glutamicum EAGA菌株中Act蛋白表达量明显提高,分子质量为43.8 kDa左右(图5-a)。

重组菌C.glutamicum EAGAN2与C.glutamicum EAGA菌株中Gad与Act酶活力测定结果显示, 2株重组菌中Gad酶活力保持为(0.64±0.05) U/mg, C.glutamicum EAGAN2中Act的酶活为(6.4±0.3) U/mg相对于C.glutamicum EAGA菌株中Act的酶活力(2.5±0.2) U/mg提高了1.56倍(图5-b)。即基因N-端前面添加RBS策略可以提高Act的酶活力。为了测试重组菌C.glutamicum EAGAN2中GABA的积累量,摇瓶发酵测定,发酵结束时发酵液中γ-氨基丁酸的积累量为(30±3) mg/L,较重组菌C.glutamicum EAGA降低了18.7倍,发酵液中2-吡咯烷酮的积累量达(180±7) mg/L,较重组菌C.glutamicum EAGA提高了45.2%。可见,在act基因N-端前面添加RBS序列可提高减弱其γ-氨基丁酸积累,增强其2-吡咯烷酮积累(图5-c)。

2.6 发酵罐发酵重组菌C.glutamicum EAGAN2合成2-吡咯烷酮的研究

为了进一步研究C.glutamicum EAGAN2菌株合成2-吡咯烷酮的能力,将C.g EAGAN2菌株进行5 L罐发酵测试,在发酵期间,每隔一段时间对发酵液进行取样,检测发酵液中葡萄糖、L-谷氨酸、γ-氨基丁酸、2-吡咯烷酮的含量以及发酵液的OD600值(图6)。在C.glutamicum EAGAN2菌株48 h时,OD600达到最高,此时GABA含量积累到最高点。发酵72 h时,发酵液中2-吡咯烷酮的含量达到最高,高达(8±0.3) g/L。可见,C.glutamicum EAGAN2菌株可以实现以廉价碳源葡萄糖为底物合成2-吡咯烷酮,但还存在2-吡咯烷酮的含量低、CoA转移酶催化合成2-吡咯烷酮效率低问题,无法满足工业上利用微生物大规模合成2-吡咯烷酮。

a-重组菌C.glutamicum EAGAN2与C.glutamicum EAGA菌株中Gad与Act表达情况; M-Protein Marker; 1-C.glutamicum E01-ΔargB/
pXMJ 19空对照上清液;2-C.glutamicum EAGA 上清液;C.glutamicum EAGAN2上清液; b-重组菌C.glutamicum EAGAN2与
C.glutamicum EAGA菌株中Gad与Act粗酶活力测定分析;c-重组菌C.glutamicum EAGAN2摇瓶发酵合成GABA与2-吡咯烷酮的含量
图5 不同N-端序列对重组菌Act酶表达量、酶活力及2-吡咯烷酮合成的影响
Fig.5 Effects of different N-terminal sequence on the expression, activity and 2-pyrrolidone synthesis of
Act enzyme in recombinant bacteria

图6 5 L发酵罐发酵重组菌C.glutamicum EAGAN2合成
2-吡咯烷酮发酵过程
Fig.6 Fermentation of 2-pyrrolidone by C.glutamicum
EAGAN2 in 5 L fermentor

3 讨论

在过去十几年内,通过对系统生物学、代谢工程和合成生物学的策略对谷氨酸棒杆菌进行工程设计,将谷氨酸棒杆菌作为传统生产各种氨基酸菌株,改造为生产化学品的现代化工平台[17-18]。仅在过去的5年中,利用谷氨酸棒杆菌合成的产品数量由35种增加到70多种[19-21]。随着合成生物学的进步,越来越多的化学品通过设计谷氨酸棒杆菌来生产传统上采用石化工艺生产的化学药品。

2-吡咯烷酮是一种有价值的大宗化学品。迄今为止,由于缺乏天然生物合成途径,仅最近在大肠杆菌中建立起2-吡咯烷酮合成途径[8-9]。本研究首次探索了在谷氨酸棒杆菌中建立2-吡咯烷酮合成途径。首先,利用进化树系统分析,筛选催化GABA转化为2-吡咯烷酮的CoA转移酶。其次,选择C.glutamicum E01作为生产L-谷氨酸的天然菌株,为了使更多葡萄糖的碳流量流向L-谷氨酸,根据文献报道[10],敲除argB基因阻断L-谷氨酸合成L-精氨酸,获得生产更多L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌底盘细胞。最终,体内外验证及N-端RBS优化后,成功在谷氨酸棒杆菌中建立了2-吡咯烷酮合成途径,发酵结果显示合成(8±0.3) g/L 2-吡咯烷酮。由于此项研究利用微生物生产2-吡咯烷酮含量低,今后利用微生物合成2-吡咯烷酮的研究将聚焦几个方面进行。(1)通过对CoA转移酶理性改造拓宽底物与酶结合口袋进而提高酶的催化效率;(2)采用非理性策略对CoA转移酶随机突变,高通量筛选催化效率高效的酶;(3)挖掘新酶高效催化2-吡咯烷酮合成;(4)拓宽更多的碳源来合成2-吡咯烷酮,如果糖、蔗糖、淀粉、木聚糖、纤维素等。总之,本研究首次揭示了在谷氨酸棒杆菌中建立可持续合成2-吡咯烷酮的方法,为未来工业上利用可再生资源生产2-吡咯烷酮奠定了基础。

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Recombinant Corynebacterium glutamicum produced 2-pyrrolidone from glucose

MA Zhenfeng, XU Meijuan, YANG Taowei, ZHANG Xian, SHAO Minglong,NAKANISHI Hideki*, RAO Zhiming*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education(Jiangnan University), Wuxi 214122, China)

ABSTRACT 2-Pyrrolidone as a highly promising bio-based platform chemical, has received more attention due to their widely used in textile and pharmaceutical industries. 2-Pyrrolidone synthesis pathway was established in Corynebacterium glutamicum by exploring the function of the key enzyme, CoA transferase, thus providing guidance for sustainable industrial synthesis of 2-pyrrolidone. Firstly, argB gene was knocked out to block the L-arginine biosynthesis pathway and increase the carbon flux to the 2-pyrrolidone synthesis pathway, resulting in a highly efficient synthesis of L-glutamate in the chassis cells. Secondly, a glutamate decarboxylase (Gad) was expressed to convert L-glutamate to GABA. Finally, CoA transferase derived from Anaerotignum propionicum was optimized for the N-terminus RBS, then recombined and expressed in C. glutamicum to convert GABA to 2-pyrrolidone. The engineered C.g EAGAN2 strain was tested in a 5 L fermenter and after 72 h of fermentation, (8±0.3) g/L 2-pyrrolidone was accumulated. The 2-pyrrolidone synthesis pathway was for the first time established in C. glutamicum. The CoA transferase could convert GABA to 2-pyrrolidone, achieving optimum biosynthesis in fed-batch cultures using glucose as a cheap carbon source.

Key words Corynebacterium glutamicum; 2-pyrrolidone; CoA transferase; γ-aminobutyric acid; glutamate decarboxylase

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023680

第一作者:硕士研究生(中西秀树教授和饶志明教授为共同通讯作者,E-mail: hideki@jiangnan.edu.cn;raozhm@jiangnan.edu.cn)

基金项目:国家重点研发计划项目(2018YFA0900300);国家自然科学基金(31770058);江苏省自然科学基金项目(BK20181205);宁夏回族自治区重点研发计划(2019BCH01002);中组部万人计划科技创新领军人才项目资助

收稿日期:2020-02-19,改回日期:2020-03-09

引用格式:马振锋,徐美娟,杨套伟,等.以葡萄糖为底物合成2-吡咯烷酮重组谷氨酸棒杆菌的构建及发酵研究[J].食品与发酵工业,2020,46(11):1-8.MA Zhenfeng, XU Meijuan, YANG Taowei, et al. Recombinant Corynebacterium glutamicum produced 2-pyrrolidone from glucose[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(11):1-8.