膳食纤维被称为第七大营养素[1]。豆渣中膳食纤维含量可达50%～60% (干基)，分为可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维，其中不溶性膳食纤维含量占总膳食纤维的90%[2-3]，多作为废物被丢掉或用作饲料，其营养价值没有得到充分利用。因此，对大豆不溶性膳食纤维 (soybean insoluble dietary fiber, SIDF) 的开发和利用具有重要意义。
肠道菌群是人体生态系统的一个重要组成部分，可调节人体健康[4]。膳食纤维不能在体内消化吸收，大部分直接到达大肠 (盲肠和结肠) 中，可被肠道菌群发酵产生短链脂肪酸 (short-chain fatty acids, SCFAs)，如乙酸，丙酸，丁酸等[5-7]，可调节肠道内的pH，对肠道上的致病菌有抑制作用[8-9]，并可为结肠细胞提供能量[10-12]，除了可以作为能源外，还可以激活G蛋白偶联受体，充当信号分子并调节宿主中的不同生物过程[13-14]，在调节宿主代谢[15-17]、免疫系统和细胞增殖中具有关键作用[18-20]，并可促进肠道健康进而维持人体健康[21-22]。吴洪斌等[23]发现体外发酵番茄皮膳食纤维可产生SCFAs；赵兰涛[24]对燕麦、大麦中的膳食纤维进行体外发酵，发现SCFAs的浓度在发酵10 h后显著增加。陈雷[25]体外发酵苦荞粉，产生的SCFAs中乙酸含量最大。目前，对SIDF体外发酵的研究鲜有报道。
本文探究4种外源菌不同时间体外发酵SIDF的pH变化及产生SCFAs的含量变化。为体内发酵SIDF调节肠道健康和SIDF开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SIDF，本实验室提取得到。两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum) BNCC186304、粪肠球菌(Enterococcus faecalis) BNCC102668，北纳生物科技有限公司；乳杆菌 (Lactobacillus) LP5，大肠杆菌 (Escherichia coli) ATCC 25922，为实验室留存。LB培养基、MRS培养基、BBL培养基，青岛海博生物技术有限公司；乙酸、丙酸、丁酸标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；厌氧发酵培养基，北京陆桥技术股份有限公司。
1.2 仪器与设备
DG250厌氧工作站，英国Don Whitely Scientific；BXM-30R立式电热压力蒸汽锅、YP4002电子分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；LXJ-IIB离心机，上海化科实验器材有限公司；SW-CJ-2D超净工作台，上海析域仪器设备有限公司；GC-2010plus气相色谱仪，日本岛津公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种活化及计数
将保存在甘油的乳酸杆菌LP5、大肠杆菌ATCC25922以体积分数5%接种量接到相应培养基上进行活化(表1)。两歧双歧杆菌BNCC186304、粪肠球菌BNCC102668为冻干菌粉，在超净台内用体积分数75%酒精擦拭管壁，在火焰上灼烧上部后迅速滴加无菌水后用镊子敲碎，然后取400 μL相应培养基加入冻干菌粉管中轻轻吹打至完全溶解，成悬浮状态，将其全部加入10 mL相应培养基中，培养条件见表1。每种菌种活化3次，平板涂布计算菌落数后进行后续实验。
表1 菌种培养基类型及培养条件
Table 1 Media types and culture conditions of bacteria
菌种培养基类型培养时间/h培养条件乳酸杆菌MRS培养基2437 ℃,厌氧两歧双歧杆菌BBL培养基4837 ℃,厌氧粪肠球菌MRS培养基2437 ℃,微好氧大肠杆菌LB培养基2437 ℃,厌氧
1.3.2 体外发酵
取SIDF 250 mg，活化后的菌种1.5 mL加入到厌氧发酵培养基 (30 mL) 中，以不加SIDF组为对照，在37 ℃，厌氧工作站中厌氧发酵48 h，分别在发酵的0、6、12、24、48 h取发酵液分别进行pH、SCFAs的测定，分析不同菌种在不同发酵时间发酵液的pH变化以及产生SCFAs含量的变化。
1.3.3 pH测定
分别在发酵的0、6、12、24、48 h取发酵液，在4 500 r/min的条件下离心15 min，离心后进行pH的测定。
1.3.4 SCFAs测定
取各个时间段的发酵液1 mL加入0.2 mL偏磷酸(体积分数25%)于1.5 mL离心管中，涡旋2 min，充分混合均匀后，在10 000 r/min 条件下离心15 min，离心后取上清，通过0.22 μm滤膜后上机检测。采用外标法进行SCFAs测定。
气相色谱条件：检测器FID，色谱柱Nukol (30 m×0.32 mm×0.25 μm) 毛细管柱。测定条件：载气N2流速为75 mL/min； H2流速为70 mL/min；空气流速为50 mL/min，进样量体积为1 μL。进样口温度为220 ℃；检测器温度250 ℃，升温程序：60 ℃，以20 ℃/min 升到190 ℃，保持3 min，分流比20∶1。
图1 短链脂肪酸气相色谱图
Fig.1 The gas chromatogram of SCFAs
1.4 数据处理与分析
所有数据重复测定3次，以
表示，数据采用SPSS 24软件分析，P<0.05时，具有显著性，采用Origin 2017软件作图。
2 结果与分析
2.1 原菌液菌落数
原菌液菌落数如表2所示。
表2 外源菌活菌数
Table 2 Viable counts of exogenous bacteria
外源菌活菌数×10-7/(CFU·mL-1)乳酸杆菌192.67±8.73两歧双歧杆菌96.00±8.00大肠杆菌144.00±5.29粪肠球菌108.50±4.50
2.2 发酵液中pH变化
2.2.1 乳酸杆菌体外发酵的pH变化
由图2可以看出，乳酸杆菌 (Lacto.) 组和Lacto.+SIDF组发酵液的pH在0～6 h急剧下降，Lacto.从6.71下降到5.05，Lacto.+SIDF组从6.70下降至4.98，这主要是因为在0～6 h乳杆菌利用厌氧培养基中大量的碳源产酸使pH急剧下降，Lacto.组在12 h时pH达到最低为4.91，之后pH基本恒定。而Lacto.+SIDF组在24 h时达到最低为4.49，Lacto.+SIDF组pH显著低于Lacto.组 (P<0.05)，说明乳酸杆菌利用SIDF 发酵产酸。
图2 乳杆菌体外发酵SIDF的pH变化
Fig.2 Changes of pH in vitro fermentation by Lacto.
2.2.2 两歧双歧杆菌体外发酵的pH变化
由图3可知，两歧双歧杆菌 (Bifido.) 组和Bifido.+SIDF组发酵液的pH在0～12 h急剧下降，Bifido.组从6.37下降到3.54，Bifido.+SIDF组从6.28下降至3.51，Bifido.在12 h时pH达到最低为3.54，12 h之后发酵稳定，而Bifido.+SIDF组在48 h时达到最低为3.29，两歧双歧杆菌发酵液的最低pH比乳酸杆菌发酵液低，这说明两歧双歧杆菌利用SIDF产酸比乳酸杆菌发酵SIDF产生的酸多。
图3 两歧双歧杆菌杆菌体外发酵的pH变化
Fig.3 Changes of pH in vitro fermentation by Bifido.
2.2.3 粪肠球菌体外发酵的pH变化
由图4可见，粪肠球菌 (Entero.) 组和Entero. + SIDF组发酵液的pH在0～12 h变化趋势与两歧双歧杆菌发酵液变化相似。当发酵到24 h，Entero.+SIDF组pH显著低于Entero.组 (P<0.05)，随着发酵时间的延长，Entero.+SIDF组pH持续下降，在48 h达到最低为4.36，其最低pH比两歧双歧杆菌高，这说明其产酸没有两歧双歧杆菌发酵SIDF产酸多。发酵24 h后 Entero.组pH值略有上升趋势，这主要是Entero.组随着发酵时间延长将碳源全部利用完毕，发酵液中代谢产物增多，菌体死亡并产生菌体自溶，使pH略有上升。
图4 粪肠球菌体外发酵的pH变化
Fig.4 Changes of pH in vitro fermentation by Entero.
2.2.4 大肠杆菌体外发酵的pH变化
由图5可知，大肠杆菌 (Escher.) 组和Escher.+SIDF组发酵液的pH在0～6 h急剧下降，Escher.组从7.35下降到5.27，Escher.+SIDF组从7.36下降至5.13，这主要是因为在0～6 h大肠杆菌利用厌氧培养基中大量的碳源使pH急剧下降，在发酵24 h，2组发酵液的pH基本保持恒定，Escher.组在48 h时pH达到最低为4.68，而Escher.+SIDF组在48 h时达到最低为4.59；大肠杆菌发酵的最低pH比粪肠球菌最低pH高，这说明大肠杆菌发酵SIDF产生的酸没有粪肠球菌发酵产酸多。Escher.+SIDF组pH显著低于Escher.组 (P<0.05)。Escher.组在发酵12 h之后，pH有所上升，这主要是因为大肠杆菌充分利用了培养基中的碳源后产生代谢产物，利用蛋白质等物质，使pH有上升趋势[12]，Escher.+SIDF组pH在发酵12 h后仍继续下降。
图5 大肠杆菌体外发酵的pH变化
Fig.5 Changes of pH in vitro fermentation by Escher.
2.2.5 外源菌体外发酵SIDF的pH变化
4种外源菌体外发酵SIDF的发酵液pH变化如图6所示。乳酸杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌发酵液pH在12 h时相近，分别为(4.62±0.04)、(4.64±0.05)、(4.68±0.06)，随着发酵时间的增长，变化趋势平稳，pH值最低分别为(4.49±0.06)、(4.36±0.05)、(4.59±0.05)，与另外3种外源菌相比，两歧双歧杆菌在发酵过程中pH变化最大，最低pH值为(3.29±0.05)。这说明两歧双歧杆菌发酵SIDF产生的酸最多。
图6 四种外源菌体外发酵SIDF的pH变化
Fig.6 Changes of pH in vitro fermentation of SIDF
by 4 exogenous intestinal bacteria
2.3 不同外源菌及不同发酵时间产SCFAs变化
乙酸、丙酸、丁酸的标准曲线方程见表3。
表3 短链脂肪酸标准方程
Table 3 Standard equation of SCFAs
短链脂肪酸保留时间/min标准曲线R2乙酸7.245±0.018y=309 078X+32 4750.999丙酸9.274±0.015y=403 294X-323.730.998丁酸11.448±0.010y=387 431X+154.470.999
2.3.1 乳酸杆菌体外发酵产SCFAs
由图7-a和图7-c可以看出，各组乙酸、丁酸含量随着发酵时间延长而逐渐增加，在48 h时Lacto.+SIDF组含量达到最大，分别为(1.19±0.015)、(0.082±0.001)g/L，在发酵24 h产生的丙酸最多，为(0.12±0.002)g/L(图7-b)；SCFAs总的含量在发酵48 h达到最大为(1.35±0.031)g/L (图7-d)，乳酸杆菌体外发酵产生的乙酸含量最多，丙酸次之，丁酸最少。发酵的整个过程中，Lacto.与Lacto.+SIDF组相比产生的SCFAs具有显著性差异 (P<0.05)。在发酵48 h时，乙酸和丁酸含量最大，连晓蔚等[26]利用低聚麦芽糖体外发酵，在24 h时乙酸、丁酸含量最高，本研究延长了发酵时间，在发酵48 h乙酸、丁酸含量最大。在发酵48 h时，丙酸含量大幅减少，可能是因为随着发酵时间的增加丙酸不再产生并发生挥发所致。
2.3.2 两歧双歧杆菌体外发酵产SCFAs
由图8-a和图8-b可以看出， Bifido.+SIDF在发酵24 h时乙酸、丙酸含量达到最大，分别为(4.05±0.024)、(0.13±0.014)g/L；丁酸在发酵48 h含量最高为(0.024±0.000 4)g/L (图8-c)。两歧双歧杆菌发酵SIDF产生的总SCFAs在24 h时达到最大为(4.20±0.11)g/L (图8-d)。在整个发酵过程中，Bifido.与Bifido.+SIDF组产生的SCFAs具有显著性差异 (P<0.05)。两歧双歧杆菌发酵产生的总SCFAs最大值比乳酸杆菌大。发酵时间24～48 h，乙酸、丙酸含量大幅下降，乙酸、丙酸随着发酵时间的增加不再产生并发生挥发所致。这与刘露等[27]报道的结果相似。丁酸在此过程中继续产生，丁酸含量累积增加。
2.3.3 粪肠球菌体外发酵产SCFAs
由图9-a可以看出，乙酸含量随着发酵时间的增加，其含量逐渐积累，在48 h时达到最大为(0.49±0.011)g/L，在6 h时， Entero.+SIDF组丙酸 (图9-b) 开始产生，而Entero.组在24 h才开始产生丙酸，
图7 乳酸杆菌体外发酵产SCFAs含量
Fig.7 Production of SCFAs by Lacto.
注：同一时间不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)
图8 两歧双歧杆菌体外发酵产SCFAs含量
Fig.8 Production of SCFAs by Bifido
在发酵48 h时Entero.+SIDF组丙酸含量达到最大为(0.07±0.003)g/L，如图9-c所示，Entero.组丁酸在12 h产生，而Entero.+SIDF组在6 h时开始产生丁酸，并随着时间积累逐渐增多，在48 h时达到最多为(0.013±0.001 4)g/L；如图9-d所示，在发酵48 h时Entero.+SIDF组总SCFAs含量为(0.57±0.026)g/L。粪肠球菌发酵产生的总SCFAs最大值没有两歧双歧杆菌大。
2.3.4 大肠杆菌体外发酵产SCFAs
由图10-a可以看出，2组乙酸都是在发酵6 h时开始产生，在48 h达到最大，Escher.+SIDF组为(1.06±0.021)g/L；在0～24 h内，Escher.组没有产生丙酸 (图10-b)， Escher.+SIDF在24 h时丙酸含量最大为(0.006±0.000 3)g/L；Escher.+SIDF组在24 h产生的丁酸最多为(0.006±0.000 8)g/L (图10-c)；整个发酵过程中，48 h时总SCFAs最多为(1.07±0.031)g/L (图10-d)。大肠杆菌发酵产生的总SCFAs最大值比粪肠球菌大。有文献报道[28-29]，体外发酵淀
图9 粪肠球菌体外发酵产SCFAs
Fig.9 Production of SCFAs by Entero.
图10 大肠杆菌体外发酵产SCFAs
Fig.10 Production of SCFAs by Escher.
粉产生乙酸的含量最高，这与本研究相一致；彭喜春等[30]利用直肠菌群体外发酵麦麸和甘蔗渣2种不溶性膳食纤维产丙酸含量最大，与本研究不一致，这可能是菌群种类不同，发酵的纤维不同所致。
2.3.5 外源菌体外发酵产SCFAs
4种外源菌发酵产生SCFAs中乙酸均为最高，丁酸最低。乳酸杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌在发酵0～48 h，产生的乙酸含量随时间增加而增大，在48 h达到最大，两歧双歧杆菌发酵产生的乙酸含量先增加后减少，与另外3种外源菌相比，两歧双歧杆菌发酵产生的乙酸、丙酸含量最多，在24 h达到最大分别为(4.05±0.024)、(0.13±0.014)g/L (图11-a、b)，乳酸杆菌发酵产生的丁酸最多为(0.082±0.001)g/L (图11-c)。两歧双歧杆菌发酵产生的总SCFAs最多，在发酵24 h时产量最大为(4.20±0.11)g/L，两歧双歧杆菌发酵SIDF产生SCFAs能力最强，粪肠球菌发酵产SCFAs能力最弱 (图11-d)。
3 结论与讨论
本研究以乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌4种外源菌体外发酵SIDF，从单一菌群角度研究发酵过程中的pH变化、SCFAs含量，发现4种外源菌发酵SIDF都可使pH降低，产生SCFAs。但是，在pH最低时，产生的SCFAs并不是最高，这说明菌群发酵SIDF产生多种酸，不仅是SCFAs。试验中还存在不足，比如单一菌群虽然能清楚表现出产生SCFAs的总类和含量，但没能体现肠道菌群的多样性，体内发酵SIDF可能更好地调节肠道健康，更深入地研究多菌群试验将进行体内试验研究。
图11 外源菌发酵SIDF产短链脂肪酸
Fig.11 SIDF was fermented in vitro by exogenous intestinal bacteria to produce SCFAs
试验结果表明，乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌4种外源菌可体外发酵SIDF使pH降低。两歧双歧杆菌发酵液中pH最低。两歧双歧杆菌在发酵24 h 产乙酸、丙酸含量最多，分别为(4.05±0.024)、(0.13±0.014)g/L。乳酸杆菌在发酵24 h时，产生的丁酸最多为(0.082±0.001)g/L。整个发酵过程中，产生的乙酸含量最大，大肠杆菌产生的丁酸比丙酸含量多，而其他3种菌产生的丁酸含量比丙酸少。两歧双歧杆菌发酵SIDF产SCFAs能力最强。SIDF可通过外源菌群体外发酵产生对人体有益的SCFAs，使发酵液的pH发生变化，这可为SIDF在体内发酵产生有益的SCFAs奠定基础。
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