果胶是一种酸性多糖，由超过65%的半乳糖醛酸组成，还含有一些中性糖以及少量的蛋白质和酚类物质。果胶按照其酯化度的不同分为高甲氧基果胶和低甲氧基果胶，自然界中绝大部分果实中存在的果胶都是高甲氧基果胶(即高脂果胶)[1]。目前国际上商品类果胶主要来源于柑橘皮和苹果渣。近年来也开发出甜菜果胶、柠檬皮果胶等新来源果胶。百香果又名西番莲，是我国主要的热带水果之一,果实由30%的果汁、50%～55%的果皮及5%～8%的种子组成[1-2]，果皮占比较大且含有丰富的果胶物质，若将其加以利用，则可变废为宝。
酸性乳饮料(acidified milk drink，AMD)是非常受欢迎的蛋白质类饮料之一，为了获得更好的口感，其pH范围一般控制在4.7左右，但乳液中的酪蛋白容易发生聚集和沉淀，影响自身的口感。因此，在生产过程中常利用稳定剂抑制这种聚集沉淀。果胶为常见的乳品稳定剂，可以与酪蛋白产生静电相互作用和空间位阻效应，从而有效地防止蛋白质聚集沉淀以及乳清分离[3-5]。然而果胶亲水性高、疏水性低对酸性乳饮料的稳定效果有限，利用食品工业级的酯化衍生法来提高果胶分子的疏水性，有利于促进果胶在酸性乳品饮料的稳定效果。
本研究提取百香果果皮中的果胶(passion fruit pectin，PFP)，进而制备含疏水性辛烯基琥珀酸酐(octenyl succinic anhydride，OSA)基团的果胶衍生物，以市售的柑橘果胶(citrus pectin，CP)作为参考，探讨3种果胶样品的添加对酸性乳饮料酸化过程中的稳定效果，确定较适宜的稳定条件和果胶种类。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
百香果果皮，云南猫哆哩集团；柑橘果胶(JMJ-YM150-H),美国CPKelco公司；脱脂乳粉，上海恒天然有限公司；HCl、OSA、HNO3、苯酚、葡萄糖酸-δ-内酯(glucono-delta-lactone, GDL)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomer, FITC)等试剂采购于上海源叶生物技术有限公司；乙醇、NaOH等试剂,上海泰坦股份科技有限公司。
1.2 主要仪器与设备
PL2002型分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；RRH-A1000高速多功能粉碎机，上海缘沃工贸有限公司；OSB-2100旋转蒸发仪，日本EYELA公司；冷冻干燥机，美国Labconco公司；SP-752冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；T25数显型分散机，德国IKA公司；马尔文zeta电位仪Nano ZS，英国马尔文公司；173 plus多角度激光光散射粒径分析仪，美国Brookhaven公司；Discovery HR-3流变仪，美国TA仪器公司；A1R型激光共聚焦显微镜，日本尼康公司。
1.3 实验方法
1.3.1 百香果果胶的提取与酯化度测定
将百香果果皮烘干，磨粉，过120目筛，称取粉末按料液比1∶20(g∶mL)加入去离子水，搅拌溶解，用1 mol/L HNO3调节pH为2.1，静置30 min，85 ℃水浴加热3 h得到粗提液。粗提液经8 000 r/min离心15 min，得到上层提取液，蒸发浓缩至1/3～1/2体积，缓慢向浓缩液中加入2倍体积的95%乙醇(体积分数)，静置1 h，8 000 r/min离心15 min得到下层沉淀，用无水乙醇脱水，搅拌细碎化，4层纱布过滤，沉淀物置于50 ℃真空干燥箱72 h得到粗提果胶。然后将粗提果胶复溶，用3倍体积95%乙醇醇沉，经离心后再细碎化以及干燥，最终得到百香果果胶。
酯化度采用GUZEL等[6]的滴定法进行测定。
1.3.2 果胶分子修饰及取代度测定
根据ZHAO等[7]的方法，称取10 g PFP样品，加入90 mL去离子水，60 ℃搅拌溶解2 h，用0.5 mol/L NaOH调节pH至8.5，按照m(OSA)∶m(PFP)=1∶7的比例缓慢加入OSA，期间维持溶液pH在8.5附近，反应1 h后，调节pH至6.0终止反应，用截留量8 000～14 000 Da透析袋于4 ℃下透析48 h，浓缩后冻干得到果胶衍生物POSA。
取代度采用滴定法[8]。称取2 g POSA样品溶解于25 mL含有体积分数90%异丙醇配制的2.5 mol/L HCl中，离心过滤，残留物用90%异丙醇洗涤3次，干燥去除多余的异丙醇，将产物溶解于300 mL去离子水中，加入几滴酚酞，用0.1 mol/L NaOH进行标定，记录NaOH消耗体积为V1，以PFP为空白组，得到NaOH消耗体积V0，按公式(1)计算取代度：
取代度
(1)
式中：V0,空白组NaOH消耗体积,mL；V1,样品组NaOH消耗体积,mL；c,NaOH浓度,mol/L；m,样品质量, g。
1.3.3 酸化乳饮料制备
取脱脂乳粉配制100 g/L的脱脂乳，室温搅拌1 h，静置2 h，90 ℃加热灭菌15 min，冷却至室温，分别移取50 mL于容器中，分别加入2 g/L的PFP、POSA或CP，搅拌溶解，乳液以8 000 r/min均质2 min后分别加入0、5、10、14和16 g/L的GDL，40 ℃保温4 h，使乳液pH分别达到6.5、5.48、4.68、4.25和4.1，4 ℃过夜，使用前400 r/min搅拌15 min，使样品恢复至室温。
1.3.4 ζ-电位测定
使用配备有4 mol/L He/Ne激光器的Malvern Zetasizer Nano ZS装置在633 nm处进行ζ-电位测定。测定前，样品溶液用对应pH值去离子水稀释10倍。仪器参数设置为等待时间120 s，平衡时间180 s，在室温下使用Zetasizer软件进行数据收集与分析。
1.3.5 粒径测定
使用173 plus多角度激光散射粒径分析仪对样品溶液的光散射特征进行分析。测定前，样品溶液用对应pH值的去离子水稀释10倍，过0.45 μm滤膜。仪器参数设置：测试角度90°；温度25 ℃；平衡时间300 s；检测时间120 s。
1.3.6 流变学测定
使用配备有Peltier温度控制器和恒温循环水浴装置的Discovery HR-3流变仪和不锈钢平板(直径：40 mm;间隙：1 000 μm)进行流变参数测试。为了避免干燥引起的误差，采用蒸馏水密封蒸汽屏蔽。采用TRIOS软件对样品的实验数据进行采集和分析。
静态剪切流变测试：取1.5 mL样品置于平板上，于温度25 ℃下剪切速率在0.01～1 000 s-1范围内测试表观黏度随剪切速率的变化。
动态黏弹性测试：在25 ℃，2%应变下(线性黏弹区内)，测定其弹性模量(G′)和黏性模量(G″)，扫描范围：0.1～100 rad/s。
1.3.7 微观分析—激光共聚焦测定
用1 mg/mL FITC乙醇溶液对AMD中蛋白质进行染色，FITC终浓度为40 μg/mL。将染色好的AMD置于单凹片上，盖上载玻片，使用配备有Ne/Ar激光器的激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)进行测定。测定条件：激发波长488 nm，发射波长范围500～550 nm，放大倍数400倍。
2 结果与分析
2.1 果胶的提取与分析
由表1可以看出，百香果果胶的平均得率为10.59%，稍低于KULKARNI等[9]报道的果胶提取率，分子修饰之后的POSA果胶取代度为0.016。PFP和POSA果胶的酯化度平均为84.9%～87.6%，大于CP的76.8%，表明3种果胶都属于高甲氧基果胶(酯化度>50%)。
表1 果胶样品的得率、取代度与酯化度
Table 1 Yields, degree of substitution, and degree of
esterification of pectin samples
参数PFPPOSACP果胶得率/%10.59±0.5384.56±0.21-取代度-0.016±0.001-酯化度/%84.9±6.287.6±1.676.8±14.6
2.2 三种果胶对酸化过程中ζ-电位的影响
由于果胶是酸性多糖，乳液中主要的蛋白质酪蛋白也是带电基团，通过ζ-电位来表征分子之间的相互作用以及表面电荷密度，ζ-电位的绝对值越大说明稳定效果越好[10-11]。从图1可以看出，当未添加果胶的空白组AMD在pH 6.5到4.1，ζ-电位值的绝对值逐渐变小，并在酸性pH<4.5时由负转正[11]，说明体系在酸化过程逐渐失稳。当体系中加入PFP、POSA和CP时，在pH>5.5时对ζ-电位值没有明显影响，这可能是由于此时的pH值与果胶溶液本身的pH值相近所致，随着体系pH降低至酪蛋白等电点(pI 4.7)附近，加入果胶的3个体系ζ-电位值增大，说明果胶吸附在蛋白质的表面，改变了表面电荷密度，与溶液中的阴离子多糖产生静电排斥，阻止了大颗粒聚集物的形成。实验表明，3种果胶均具有稳定效果，且在pH 4.7附近，PFP和POSA的稳定效果优于CP，在pH<4.7时，PFP和POSA乳体系的ζ-电位值增长较快，说明稳定效果变差。
图1 三种果胶对脱脂乳悬浮液酸化过程中
ζ-电位的影响
Fig.1 Effects of PFP, POSA and CP on ζ-potential during
acidification of skimmed milk dispersions
2.3 三种果胶对酸化过程中粒径大小的影响
因果胶为酸性阴离子多糖，可吸附在脱脂乳中酪蛋白的表面，运用动态光散射法测量聚合物的有效粒径，进而评估分子间的相互作用[12-13]。由图2可知，空白组AMD的有效粒径在pH 6.5～4.68范围内逐渐增大，并在pH 4.68时达到最大值1 803 nm；当pH继续降低，有效粒径降低。添加PFP的乳液在偏中性的条件下未发现明显的结合，在酸化至pH 4.68附近时，相对于空白组，PFP组体系的粒径较小，在pH<4.68时则明显增大了体系的粒径，说明PFP在此范围内稳定效果不佳，这一点与电位分析结果一致。而POSA从偏中性开始与体系中蛋白质发生结合，并在pH 4.68时明显减小了体系粒径，随着pH进一步降低，这种稳定效果逐渐变差。商品果胶CP对抑制大颗粒形成的效果与PFP类似，在pH<4.68的范围内,POSA呈现更好的稳定效果。综上，分子修饰之后的果胶POSA有着更好的稳定效果，但在酸化后期的稳定效果较差。
图2 三种果胶对脱脂乳悬浮液酸化过程中
有效粒径的影响
Fig.2 Effect of PFP, POSA and CP on effective particle
size during acidification of skimmed milk dispersions
2.4 三种果胶对酸化过程中流变性质的影响
流变性是研究物质在力的作用下的流动和变形，是果胶的重要属性之一。当果胶作为稳定剂加入到乳饮料中，黏度是评价果胶效果的重要指标[14-15]。图3为PFP、POSA和CP对脱脂乳酸化过程中表观黏度随剪切速率变化的影响。
a-AMD;b-PFP-AMD;c-POSA-AMD;d-CP-AMD
图3 PFP、POSA和CP对脱脂乳悬浮液酸化过程中表观黏度的影响
Fig.3 Effects of PFP, POSA and CP on apparent viscosities of skimmed milk dispersions during
acidification as a function of shear rate
图3-a中，未添加果胶的乳液在酸化过程中表现出明显的剪切稀化行为，其中在pH 4.68时剪切变稀更为明显，且对应的黏度也较低，这与体系失稳有着必然的联系[16]。而添加PFP、POSA和CP后，明显抑制了乳液在酪蛋白等电点时的不稳定性，宏观表现为表观黏度对剪切速率依赖性降低。其中修饰之后的果胶POSA有着更低的剪切速率依赖性，在LIU等[17]的研究中也发现类似的现象。而添加PFP和CP的乳液在pH 4.68时有着相对较高的黏度，这可能是因为PFP和CP与乳液中蛋白质颗粒之间有着更强的分子缠绕，使得分子间相对流动减弱，表现为表观黏度增大[18]。
为了模仿人体口腔环境，选取剪切速率为40 s-1的表观黏度[19]作图。从图4可以看出，AMD组在pH 4.68时表观黏度下降到最低，随着酸化的进行，表观黏度有明显的升高。3种果胶的加入明显增加了乳液在pH 4.68时的表观黏度，PFP在pH<4.68的范围内有很好的稳定性，而POSA在pH>4.68时对乳液的表观黏度的稳定性较好，随着pH的进一步降低，乳液的表观黏度明显上升。CP在酸化开始时显著增加了体系的表观黏度，在pH≤4.68的范围，乳液的表观黏度呈现上升趋势。说明PFP和CP在pH<4.68的范围内对乳液的表观黏度有较好的稳定性，分子修饰之后的果胶POSA在偏中性条件下对表观黏度的稳定效果较好。
图4 脱脂乳-果胶系统在剪切速率40 s-1下的表观
黏度随pH值的变化
Fig.4 Changes in apparent viscosity at a shear rate of
40 s-1 with pH value for skim milk-pectin systems
物质的黏弹特性反映着溶液的凝胶性质，同时与胶体的实际生产应用有着很大的关联性。储能模量(G′)代表能量贮存而可恢复的弹性性质，损耗模量(G″)代表流体流动的黏性性质。从图5可以看出，4种乳体系下的G′和G″均表现出频率依赖性，在pH 4.68时，AMD、PFP-AMD和CP-AMD体系的G′<G″，这与JENSEN等[20]研究的高脂果胶对酸化脱脂乳的稳定作用的结果一致，而POSA-AMD体系在>15 rad/s的范围G′>G″，表现出弹性特征。与空白组AMD相比较，PFP和POSA组增大了其在pH 4.25时的模量值，在高频区表现出G′>G″的类流体性质，说明PFP和POSA在pH<4.7时对体系的凝胶性质有着很大的影响，而含CP的乳体系则表现出在偏中性的环境下有利于G′和G″值的提高，当pH<4.7时有着相对较高的模量值，但与空白组AMD比较，这种数值变化较小。
综合稳态剪切黏度(图3)和动态黏弹性模量(图5)的分析，可以看出CP对乳体系下的流变性质影响较小，而PFP和POSA则增大了乳体系的抗剪切能力以及高频区的凝胶性质，这可能是由于PFP和POSA与乳液中蛋白质的相互作用更强，分子之间的缠绕更为紧密，形成的凝胶网络不易发生“滑动”所致[21]。
a-AMD;b-PFP-AMD;c-POSA-AMD;d-CP-AMD
图5 三种果胶对脱脂乳悬浮液酸化过程中动态黏弹性模量的影响
Fig.5 Effects of PFP, POSA and CP on dynamic moduli during acidification of skimmed milk dispersions
2.5 三种果胶对酸化过程中的微观结构影响
通过对体系中蛋白质进行荧光标记，在一定的激发波长和发射波长下，用激光共聚焦显微镜观察，可以更加直观地反映果胶对乳体系的稳定性作用。从图6可以看出，空白组AMD可以清楚的看出大面积的聚集，且聚集体呈絮状，较为厚实，这与JORDAN等[22]的研究结果一致。而添加PFP的乳体系表现为局部较为细小的聚集。分子修饰之后的果胶POSA呈现出分布均匀但较为分散的聚集体，这可能是由于OSA具有一定的疏水性质[23-24] 导致的。而商品果胶CP在pH 4.68时表现出局部的、松散絮状的大颗粒聚集。因此，从微观图像看，PFP抑制乳体系中大颗粒聚集的效果要优于POSA， 而POSA又稍优于CP。
a-AMD；b-PFP-AMD；c-POSA-AMD；d-CP-AMD；标尺为50 μm
图6 三种果胶对脱脂乳悬浮液在pH 4.68时的
CLSM图像
Fig.6 CLSM images of skimmed milk dispersions with PFP,
POSA and CP at pH 4.68
3 结论
通过测定ζ-电位、粒径、流变学特性以及微观分析，研究了百香果果胶PFP，分子修饰后的果胶POSA以及商品类柑橘果胶CP对脱脂乳酸化过程中的稳定效果。PFP、POSA和CP在添加量为2.0 g/L下，均提高了脱脂乳体系在酪蛋白等电点pH 4.7附近的ζ-电位绝对值，降低了有效粒径。但是随着pH继续下降，PFP和POSA体系下的稳定效果变差。另一方面，PFP和POSA提高了脱脂乳体系在酸化过程的抗剪切能力，以及动态黏弹模量(G′、G″)，改变体系的凝胶性质。通过CLSM图像分析可以看出PFP和POSA均具有较好的抑制乳液中聚集物的形成效果，具有发展成商品类果胶的潜质。
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