近年来,随着我国国民经济水平持续快速增长、居民消费水平不断提升和消费者饮酒习惯逐渐改变,我国酿酒工业呈现了快速发展趋势,特别是葡萄酒消费逐年增长,已成为我国工业经济中增长较快且具活力的产业之一。当前消费者对葡萄酒质量的要求也逐渐增高,既要求其具有独特的风味又要求其具有高的保健功能。
硒是谷胱甘肽过氧化物酶、谷氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白还原酶及其他一些脱碘酶等含硒酶蛋白的必需组分,还能形成多种硒代谢产物参与代谢活动[1],对维持人体正常代谢,特别是对机体自身免疫功能、局部物质能量代谢以及重要内分泌器官功能具有重要作用,缺硒不仅容易导致正常发育障碍,还会促使多种疾病发生[2]。无机硒不能被人体直接吸收利用且易引起中毒,而植物能够将其转化成有机硒,通过食物链被人体吸收利用[3-4],则富硒食品的研发成为当前研究的热点。大量研究证实,叶面喷施硒后树体叶片吸收的硒可直接向果实中转运,从而提高酿酒葡萄硒含量,且具有用量低、利用率高等优点[5],因此,通过添加外源硒提升酿酒葡萄硒含量成为酿制富硒葡萄酒的途径之一。
随着富硒食品的研发,研究者们发现适量硒除了提高植物组织含硒量外,还可以增加叶绿素含量、促进光合作用、提高可溶性蛋白质含量、清除自由基、增强免疫机能、抵抗真菌病害的入侵以及拮抗环境毒害等作用,并对氮、硫及氨基酸代谢产生影响[6]。叶面喷施富硒肥可使奥迪亚无核葡萄平均单株产量增加4.45%[7],提高鲜食葡萄和酿酒葡萄果实单粒重、横径、纵径、可溶性糖和VC含量[5,8-9];降低甜柿叶片和果实中的镉、铅、汞含量,增加果实可溶性糖、VC和可溶性固形物含量,降低果实可滴定酸含量[10]。酿酒葡萄富含酚类物质,它们是葡萄中重要的次生代谢产物,也是葡萄酒中最重要的风味物质之一,不仅赋予葡萄酒各种颜色而且使葡萄酒具有各种复杂的口感和味感特征;然而,葡萄中酚类物质含量受气候条件、土壤状况、栽培措施以及品种等多因素影响[11]。有关硒对葡萄生长发育、抗氧化酶活性、硒的累积和分配以及果实糖酸含量影响的报道屡见不鲜,但对酿酒葡萄果实酚类物质、营养元素以及抗氧化特性的研究甚少。因此,本研究通过大田叶面喷施不同浓度亚硒酸钠,监测发育期果实总糖、还原糖、可溶性固形物、可滴定酸、pH值、总酚、总黄烷醇和花色苷含量以及矿质元素含量,并测定果实DPPH自由基清除活性、ABTS自由基阳离子清除活性和总还原力,运用灰色系统关联度,综合评价不同浓度硒对酿酒葡萄品质的影响,旨在为生产优良葡萄酒原料提供理论基础和技术支撑。
没食子酸、葡萄糖、抗坏血酸、三氯乙酸、铁氰化钾、甲醇、浓HNO3、浓H2SO4、1,1-二苯基-2-三硝基苯(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)]、福林试剂、儿茶酚、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、H2O2均为分析纯,天津市大茂化学试剂厂;高纯氩气(纯度 ≥99.99%),上海恒箐特种气体有限公司。
UV-2100紫外可见分光光度计,上海尤尼柯上海尤尼柯仪器有限公司;AUW 220D电子天平,日本岛津公司;PHS-3C型酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;PAL-1型手持折射仪,上海鑫际仪器有限公司;Millipore纯水仪,Millipore 公司;15-ESICP全谱直读电感耦合等离子体发射光谱仪,美国VARIAN公司;MDS-6型微波快速制样系统,上海新仪微波化学科技公司;ECH-1型电子控温加热板,上海新仪微波化学科技公司。
试验于2017年在宁夏园林场葡萄试验基地(北纬37°43′~39°23′,东经105°45′~106°47′)进行,该地区属于中温带大陆性气候,年均降水量193.4 mm,年均气温9.4 ℃,年均日照时数3 000 h,无霜期185 d。供试品种为欧亚种酿酒葡萄(Vitis viniferal L.)赤霞珠(Cabernet sauvignon),2006年定值,东西行向,行距3.0 m,株距0.5 m,葡萄架势为单臂篱架,沿葡萄行每隔8 m竖立水泥支柱,其上拉3道铁丝,葡萄架高约1.5 m。
分别在葡萄的幼果期(7月8日)和着色前期(7月28日)进行叶面喷施一定浓度的亚硒酸钠(Na2SeO3),根据葡萄植株对硒的需求量和安全范围,将喷施的质量浓度设定为5个水平,分别为0 mg/L(Se0)、10 mg/L(Se10)、25 mg/L(Se25)、50 mg/L(Se50)和75 mg/L(Se75)。试验葡萄分区处理,每区有16株葡萄树,每个处理完全随机排列,重复3次。试验期间葡萄的施肥、除虫除草、修剪、施肥追肥等均按正常情况进行。7月28日喷施后每隔8~10 d采集1次果实样品,直至成熟。样品立即进行液氮速冻,随后将果粒置于采样袋中放置在-80 ℃冰箱冷冻储藏,以备测定。
1.4.1 葡萄果实基本理化指标
葡萄果实可溶性固形物用手持糖量计检测,以°Brix表示;总糖和还原糖(以葡萄糖计)采用斐林试剂直接滴定法;可滴定酸(以酒石酸计)采用指示剂法;pH值采用酸度计法测定。每个葡萄样品重复检测3次,最后取平均值。
1.4.2 葡萄果实酚类物质
总酚采用福林-肖卡法,参考ARNOUS等[12]方法,以没食子酸表示,其回归方程为y=0.001 1x+0.005 9,R2=0.999 7;总黄烷醇采用二甲氨基肉桂醛法,参考张娟等[11]方法,以儿茶素表示,其回归方程为y=0.004 5x+0.028 8,R2=0.993 9;花色苷采用pH示差法,参考张娟等[11]方法,以花青素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,CGE)表示。
1.4.3 葡萄果实矿质元素分析
将采集的样品洗净尘沙,经冷冻干燥至恒重粉碎后,果实硝态氮采用双波长紫外分光光度计法测定;铵态氮采用2 mol/L KCl 浸提-靛酚蓝比色法测定;Se、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn含量采用微波消解-电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定。
1.4.4 葡萄果实抗氧化特性
DPPH自由基清除能力采用1,1-二苯基-2-三硝基苯法,以Trolox当量抗氧化能力表示,其回归方程为y=3.45x-29.6,R2=0.993 9;ABTS自由基清除能力采用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐方法,以Trolox当量抗氧化能力表示,其回归方程为y=4.28x-143.9,R2=0.994 6;总还原力采用铁氰化钾还原法,以AAE当量抗氧化能力表示,其回归方程为y=7.28x+0.03,R2=0.995 7。
本试验采用SAS 12.1统计分析软件进行方差分析,不同处理间差异比较采用最小显著差别(least significant difference,LSD)法进行多重比较,利用Microsoft Excel 2013软件作图。采用灰色系统关联度理论,选取不同处理间具有差异显著性的理化指标进行灰色关联度分析,综合评价硒对赤霞珠酿酒葡萄果实质量的影响。
由图1可知,叶面喷施硒元素能够提高葡萄浆果中硒含量,并随着喷硒浓度的增加而增加,其中Se75处理组浆果硒含量最高,达到89.1 μg/kg,极显著(P<0.01)高于其他处理,Se25和Se50极显著高于(P<0.01)Se10和Se0,但Se25与Se50、Se10与Se0间无显著性差异。与对照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50和Se75处理组浆果硒含量增加72.9%、350.5%、387.9%和734.9%。
图1 不同硒浓度对酿酒葡萄果实硒含量的影响
Fig.1 Influence of selenium on selenium content of grape berry
注:图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
葡萄酒酿造过程中,原料浆果中营养元素供酿酒酵母和乳酸菌的生长繁殖,且葡萄酒中的矿质元素组成、含量与葡萄原料密切相关。由表1可知,叶面喷施硒对酿酒葡萄果实 K、Zn、Fe、Ca、N-NH4、N-NO3和S元素含量均无显著性影响,但可以促进果实对P、Cu、Mn和Mg元素的吸收和积累,其中Se10处理组Mn元素含量最高,Se75处理组P、Cu和Mg元素含量最高。ZHU等[13]研究表明,喷施硒肥能够提高鲜食葡萄果实 K 和 Ca 元素含量,但本研究结果与其不相符,可能因品种和硒源不同。与对照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50和Se75处理的浆果 P 元素分别提高7.57%、11.84%、20.06%和20.68%;Cu元素分别提高35.17%、32.26%、31.18%和36.01%;Mn 元素分别提高37.92%、-6.15%、10.10%和-8.54%;Mg 元素分别提高4.76%、6.42%、1.29%和11.84%。
表1 硒对酿酒葡萄果实营养元素的影响
Table 1 Influence of selenium on nutritional elements of grape berry
处理P/(mg·kg-1)K/(mg·kg-1)Cu/(mg·kg-1)Zn/(mg·kg-1)Fe/(mg·kg-1)Mn/(mg·kg-1)Ca/(g·kg-1)Mg/(g·kg-1)N-NH4/(g·kg-1)N-NO3/(g·kg-1)S/(g·kg-1)Se01.07±0.025c32.08±2.008a4.47±0.145b5.07±0.612a114.78±17.88a12.87±1.001bc1.32±0.066a0.51±0.007c7.15±0.279a0.67±0.091a0.43±0.046aSe101.15±0.012bc32.02±1.376a6.04±0.231a6.29±0.525a91.82±13.43a17.81±0.776a1.24±0.027a0.54±0.008bc6.99±0.382a0.92±0.069a0.40±0.024aSe251.20±0.024ab35.86±3.597a5.91±0.321a5.44±0.506a83.56±8.73a12.13±0.400bc1.33±0.077a0.55±0.016ab6.62±0.163a0.72±0.291a0.34±0.017aSe501.28±0.055a30.31±1.115a5.86±0.327a6.86±0.595a106.44±12.62a14.24±0.778b1.21±0.014a0.52±0.006bc6.15±0.287a0.83±0.317a0.33±0.108aSe751.29±0.017a32.17±0.840a6.08±0.143a5.08±0.196a123.32±6.73a11.82±0.613c1.28±0.056a0.58±0.013a7.21±0.095a0.77±0.064a0.27±0.109a
注:同一行不同字母表示差异显著性(P<0.05)(下同)
糖和酸是酿酒葡萄果实生长发育过程中的基础物质,是色素和风味物质的基础原料,其组成和含量是决定浆果品质和商品价值的最重要指标[14-15]。由图2可知,硒显著增加赤霞珠浆果糖类物质含量,而对有机酸含量的影响因浓度不同而异,但对pH值无显著性影响。Se75和Se50处理的浆果糖类物质含量最高,其总糖、还原糖和可溶性固形物含量均显著高于其他处理;Se25处理的总糖、还原糖含量显著高于Se10处理,但可溶性固形物含量无显著性差异;Se10与Se0处理间糖类物质含量均无显著性差异。葡萄果实糖分主要来源于碳水化合物的同化,而喷施硒能够促使果实对 P、Cu和Mg元素吸收和积累,其中 P 参与光合磷酸化作用,Cu 和 Mg 元素是叶绿体的结构部分,是维持叶绿体结构所必须的微量元素,也是许多酶的组成成分,从而增强了光合作用,使得光合产物增加,增强了源的供给能力,并且硒可以提高果实酸性转化酶的活性[11],最终增加果实中糖类物质的含量。相对于糖分,葡萄果实中的有机酸含量很低,但酸有助于抑制微生物繁殖,稳定葡萄与葡萄酒的适口性[14]。Se50处理的有机酸含量最高,其可滴定酸含量显著高于其他处理,Se10处理的可滴定酸含量显著高于Se25、Se75和Se0处理,但Se25、Se75和Se0处理间无显著性差异。有机酸是通过果实组织自身固定CO2在果实内部合成[16],而Mn是许多酶的组成成分,对许多酶活性起重要的调节作用,Se50和Se10处理提高了浆果Mn含量,则有助于有机酸的合成。与对照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50 和Se75处理的总糖含量分别提高2.1%、7.3%、16.0%和16.3%,还原糖含量分别提高1.2%、9.6%、14.7%和13.7%,可溶性固形物含量提高 0.44%、2.6%、15.9%和 16.3%,可滴定酸含量分别提高10.5%、-2.6%、18.4%和-5.3%。故从糖类物质来看,最佳处理是Se75和Se50;从有机酸来看,最佳处理是Se50。
a-总糖;b-还原糖;c-可溶性固形物;d-可滴定酸;e-pH值
图2 硒对酿酒葡萄果实基本理化指标的影响
Fig.2 Influences of selenium on basic physical and chemical indicators in wine grapes
注:图中不同小写字母表示相同采样期中不同处理间差异显著(P<0.05)(下同)
2.4.1 硒对赤霞珠酿酒葡萄果实总酚含量的影响
酚类物质是葡萄酒中最重要的风味物质之一,不仅影响葡萄酒颜色、香气和口感等感官质量,还决定葡萄酒的诸多生理活性功能,也是葡萄酒保健价值所在[17]。然而,葡萄酒中的酚类物质主要来源葡萄果皮、籽和肉中酚类物质的溶出,则提高果实中酚类物质含量才有可能增加葡萄酒酚类物质的含量[11]。由图3可知,硒对果籽、果皮和果肉总酚含量具有一定促进作用。Se10处理组果籽、果皮和果肉总酚含量最高,且果皮和果肉总酚含量显著高于Se0处理。尽管Se10与Se0处理间果籽总酚含量无显著性差异,但Se10处理组果籽总酚含量比Se0处理高24.44%。Se10、Se25、Se75处理与Se0处理间果籽、果皮和果肉总酚含量均无显著性差异。与对照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50 和Se75处理组果实总酚含量分别提高27.9%、-9.9%、12.2%和-3.7%,故从果实总酚含量来看,Se10为最佳处理。
a-果籽;b-果皮;c-果肉
图3 硒对酿酒葡萄果实总酚含量的影响
Fig.3 Influences of selenium on total phenolic content of wine grapes
2.4.2 硒对赤霞珠酿酒葡萄果实总黄烷醇含量的影响
黄烷醇是类黄酮合成途径的产物,与黄酮醇、花青素的前体物质相同[18],是形成葡萄酒涩味、苦味的结构物质,同时还起到稳定葡萄酒色度的作用[19]。葡萄果肉中总黄烷醇含量微小,用常规测定方法未检测出。由图4可知,硒对果籽和果皮总黄烷醇含量具有一定促进作用。喷硒处理组葡萄果籽总黄烷醇含量均显著高于对照(Se0),但喷硒处理间果籽总黄烷醇含量无显著性差异。Se10和Se25处理组果皮总黄烷醇含量均显著高于对照(Se0),但Se10和Se25处理间无显著性差异;Se50和Se75处理组果皮总黄烷醇含量与Se0处理间均无显著性差异,但Se75处理组果皮总黄烷醇含量显著低于Se50处理组。与对照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50 和Se75处理组果实总黄烷醇含量分别提高34.0%、41.8%、34.2%和31.6%,故从果实总黄烷醇含量来看,Se25为最佳处理。
a-果籽;b-果皮
图4 硒对酿酒葡萄果籽和果皮总黄烷醇含量的影响
Fig.4 Influences of selenium on total flavanols content of seeds and skins in wine grapes
2.4.3 硒对赤霞珠酿酒葡萄果实花色苷含量的影响
花色苷是存在于葡萄果皮中的水溶性天然色素,属于类黄酮化合物,影响着葡萄酒的色泽、口感及营养价值,且直接决定红葡萄酒和新葡萄酒的颜色。同时,花色苷与单宁结合可使葡萄酒中的单宁软化,降低其苦涩味和粗糙感,使口感变得更加圆润[20]。由图5可知,随着生育期的推进,果皮花色苷含量大幅度提高,且喷硒处理后2周,硒对其有显著性影响。采收期,Se50处理组果皮花色苷显著高于Se0处理,而Se75处理组果皮花色苷显著低于其他处理。糖是花色苷合成的原料之一,在果实发育过程中,花色苷的合成伴随糖的积累[21],喷施硒有利于葡萄果实糖类物质的积累,从而促进花色苷的合成与积累;然而,不同种类糖对花色苷合成的影响有所不同,其中蔗糖对花色苷的生物合成有明显正向调控作用,而葡萄糖和果糖等的促进作用较小[22-23]。本研究中Se50处理可能更有利于蔗糖的合成与积累,故其浆果果皮花色苷含量最高。与对照(Se0)相比较, Se10、Se25、Se50 和Se75处理组花色苷含量分别提高19.3%、24.3%、49.2%和-51.1%,故从果实花色苷含量来看,Se50为最佳处理。
图5 硒对酿酒葡萄果皮花色苷含量的影响
Fig.5 Influences of selenium on anthocyanins of skins in wine grapes
硒是谷光甘肽过氧化物酶的必须组分,能够降低膜受过氧化损害,维持植物抗氧化系统,减轻氧化损伤[24];同时,酚类物质和糖酸等营养物质也参与抗氧化的过程[25]。由表2可知,喷硒处理显著提高葡萄浆果抗氧化能力,其中Se50处理浆果的总还原力和ABTS自由基清除活性最高,Se75处理浆果的DPPH自由基清除活性最高。与对照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50和Se75分别提高总还原力80.17%、102.87%、206.63%和86.90%;分别提高DPPH自由基清除活性40.08%、46.79%、56.58%和93.82%;分别提高ABTS自由基阳离子清除活性8.35%、17.94%、32.54%和20.16%。故从抗氧化能力来看,Se50和Se75为最佳处理。
表2 不同浓度硒对赤霞珠酿酒葡萄果实抗氧化特性的影响
Table 2 Influence of selenium on antioxidant properties of grape berry
处理总还原力/(mg AAE·L-1)DPPH自由基清除活性/(μmol TEAC·L-1)ABTS自由基阳离子清除活性/(μmol TEAC·L-1)Se06.84±0.934c113.5±11.121c120.1±9.91bSe1012.32±0.144b159.0±4.011b130.2±8.77abSe2513.88±0.921b166.6±7.256b141.7±1.05abSe5020.97±2.970a177.7±5.198b159.2±11.44aSe7512.78±0.964b219.9±5.498a144.4±2.82ab
采用灰色系统关联度理论,选取不同处理间具有显著差异的理化指标进行灰色关联度分析,其包括总糖、还原糖、可滴定酸、可溶性固形物、总酚、总黄烷醇、花色苷、Se、P、Cu、Mn、Mg、总还原力、ABTS、DDPH 15项指标。由表3可知,喷硒处理的酿酒葡萄果实理化特性加权关联度高于未喷硒处理的酿酒葡萄果实理化特性加权关联度,表明喷硒能够改善酿酒葡萄果实质量;喷硒处理中,酿酒葡萄果实理化特性加权关联度随喷硒浓度的增加先增后降,其中Se50处理的酿酒葡萄果实理化特性加权关联度最高,则表明Se50处理组酿酒葡萄果实质量最佳。
表3 不同硒浓度下酿酒葡萄果实化学成分的灰度关联分析
Table 3 The relational grade of physicochemical property in grape berry of Cabernet Sauvignon under different selenium dose
处理关联系数总糖还原糖可滴定酸可溶性固形物总酚总黄烷醇花色苷SePCuMnMg总还原力DPPHABTS得分排名Se00.3330.3330.3910.3330.3760.3330.5080.3550.3330.3330.3820.3320.3330.3330.3330.3565Se100.3580.3520.6000.3451.0000.7280.6260.4100.4410.9551.0000.4540.4500.4660.4020.5774Se250.4340.5910.3600.4170.3331.0000.6680.9960.5390.8280.3450.5200.4990.4990.5270.5893Se500.6821.0001.0001.0000.4340.7311.0000.8350.9430.7880.4550.3581.0000.5571.0000.7941Se751.0000.8820.3330.6670.4200.6710.3330.3331.0001.0000.3331.0000.4631.0000.5680.6812关联度0.5610.6320.5370.5520.5130.6930.6270.5860.6510.7810.5030.5330.5490.5710.566权重0.0630.0710.0610.0620.0580.0780.0710.0660.0740.0880.0570.0600.0620.0650.064
酿酒葡萄果实发育期喷施适宜浓度的硒可显著提高赤霞珠果实可溶性固形物、总糖、还原糖、可滴定酸和Se、P、Cu、Mg含量及其总还原力、DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性,而对果实pH值和K、Zn、Fe、Ca、N-NH4、N-NO3及S元素含量均无显著性影响。硒对果实酚类物质如总酚、总黄烷醇、花色苷等含量和营养元素Mg的效应因喷施浓度不同而异,通过灰色系统关联度分析,Se50处理的酿酒葡萄果实质量指标加权关联度最高,故果实发育期喷施50 mg/L的亚硒酸钠有助于改善果实质量。
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