开菲尔发酵过程中风味物质动态变化

古丽加马力·艾萨1,邢军2,马龙1,李安1,张瑞1*

1(新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室,新疆师范大学 生命科学学院,新疆 乌鲁木齐,830054) 2(新疆大学 生命科学与技术学院,新疆 乌鲁木齐,830046)

摘 要 为探究开菲尔发酵过程中风味物质的变化过程,以采集自阿勒泰地区的开菲尔为实验原料,分离培养其中开菲尔粒,将其接种至杀菌牛乳中。采用顶空气质联用仪(headspace-gas chromatograph-mass spectrometry,HS-GC-MS)检测发酵过程中风味物质的动态变化规律。开菲尔在整个发酵过程中的挥发性风味物质可达到约174种。开菲尔中的风味物质主要是酸类、酯类、酮醛类、烃类、醇类和其他化合物6大类。发酵过程中酸类物质呈现先增加后减少再增加的趋势、酯类化合物在发酵过程中呈现先增加后减少的变化趋势。烃类、酮醛类物质在发酵过程中无明显变化。该文旨为传统开菲尔的品质控制和风味改良提供数据支持。

关键词 开菲尔;发酵过程;风味物质;动态变化

开菲尔是以新鲜牛乳为原料,经过接种传统开菲尔粒发酵剂形成的乳制品。由于其独特的风味,纯正的口味和潜在的益生功能,受到越来越多人的欢迎[1-5]。从化学角度来看,发酵乳是一种复杂的凝胶系统,含有蛋白质,多糖和脂质,其主要品质特征是质地、味道和风味[6-9],风味是开菲尔制品中重要的品质之一,其中风味物质的种类及其含量决定了产品的品质。随着人们生活水平的提高,人们对发酵乳制品风味的要求越来越高,其中发酵乳的风味已成为食品生产者和消费者关注的问题[10-14]。发酵乳的风味物质有3个主要来源:由原料奶形成的挥发性化合物、经过杀菌发酵等加工形成的化合物、发酵乳中各种微生物的代谢物质[15-16]。近年来,国内外学者利用现代生物化学与色谱学技术对发酵乳风味进行了研究[2-6],但目前国内外学者大多对开菲尔及发酵乳风味进行了研究,对于不同发酵阶段风味物质动态变化的相关研究工作未能展开。

在本文中,项目组采集了新疆阿勒泰地区牧民家里的手工开菲尔制品,在实验室中制备分离了开菲尔粒并采集了发酵时间从0~120 h的开菲尔样品,使用GC-MS技术来分析在发酵过程中开菲尔的风味组分及相应峰面积变化,分析了风味物质种类的差异和含量的动态变化,为传统开菲尔的品质控制和风味改良提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

取自新疆阿勒泰地区牧民家中传统手工制作的传统开菲尔粒(编号为ALT),试剂盒冷冻保藏运至实验室-80 ℃冰箱保存备用。

Agilent 190 91 N-136 HP-INNOWax气相色谱-质谱仪,色谱柱为HP-5毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm),美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 传统开菲尔活化

传统开菲尔活化流程如下:

开菲尔粒→粉碎→过40目筛→温水30 ℃泡洗3次→按质量比1∶5加入30 ℃水打浆→均质→按1∶10质量比接种在25 ℃已灭菌牛乳中→25 ℃培养24 h→过滤获得开菲尔粒→重复上述活化培养次数3~5次→过滤获得发酵用开菲尔粒

1.2.2 发酵开菲尔样品

将活化完成的开菲尔粒加入到装有已杀菌牛乳的发酵瓶中25 ℃发酵,取刚接种开菲尔粒的牛乳为发酵0 h样品,-80 ℃冰箱冷冻备用。依次取发酵24、48、72、96、120 h时间点发酵样品至-80 ℃冰箱冷冻备用,每一个时间点取3个平行样,共18个样品进行后续实验。

1.2.3 发酵开菲尔样品

样品的前处理用无菌注射器分别吸取0、24、48、72、96、120 h发酵乳各5 mL转入20 mL的顶空瓶内,同时加入2 g NaCl,加盖密封。样品预孵化10 min,然后用萃取头吸附30 min,即可进样解吸。挥发性风味物质定性方法采用与NIST谱库进行比较,同时使用保留指数进行定性分析;定量方法采用峰面积归一化法。

GC条件:HP-INNOWax毛细管色谱柱(60 m×250 μm×0.25 μm)0~260 ℃(270 ℃);气化室温度250 ℃;辅助加热器温度280 ℃;升温程序为起始温度50 ℃以10 ℃/min升温到90 ℃,最后以4 ℃/min升至240 ℃,保持20 min;载气为高纯 He;流速0.8 mL/min;分流比100 ∶1。

MS条件:电离方式为EI;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;传输线温度280 ℃;质量扫描范围50~500 m/z;全扫描;溶质延迟0 min;调谐文件为标准调谐。

顶空参数:7 697 A(Agilent);加热箱温度150 ℃;定量环温度170 ℃;传输线温度180 ℃;样品平衡时间40 min;进样持续时间1 min;GC循环时间65 min;样品瓶体积20 mL;样品量2 mL。

1.2.4 感官评定

本实验邀请实验室无经验型感官评价人员8名,有经验型感官评价人员2名组成评定小组,实验前对评价人员进行培训,明确感官评价指标体系及评价方法。每次评定由每个评定员单独进行,相互不接触,样品随机编号进行盲标,评定之间用纯净水漱口,选取色泽,气味,组织状态,口感4个主要影响因素,分别对发酵0、24、48、72、96、120 h时间点样品进行感官简单描述检验。

2 结果与分析

2.1 发酵初期(0 h)风味物质检测结果

如图1所示,发酵前期,GC-MS检测的样品中有26种挥发性风味物质,包括3种烃类、5种酸类、6种酯类、6种酮醛类、2种呋喃类和3种其他类物质,其中酯类物质种类最多。峰面积最多的物质是8.000 min出峰的4-(羟甲基)咪唑(18.583%)、8.371 min出峰的斯皮罗[2,4]七氯-4,6-二烯烃(2.108%)、18.477 min出峰的十八碳-6,9-二烯酸乙酯(1.880%)和(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯(1.880%)、18.367 min出峰的棕榈酸(1.390%)。发酵前期酯类物质累计峰面积为(5.097%)、酸类物质累计峰面积为(2.397%)、烃类物质累计峰面积为(2.522%)、酮醛类物质累计峰面积为(2.187%),其中酯类物质优势明显。

感官评价结果为样品为乳白色均匀液体,黏度较小,在透明玻璃杯内摇动,可以肉眼看到微小开菲尔粒发酵剂颗粒,口感细腻,具有鲜乳特有滋气味,可说明此阶段样品尚未发酵。

图1 开菲尔发酵前期(0 h)GC-MS谱图
Fig.1 GC-MS spectrum of the initial fermentation of Kefir fermented milk

2.2 发酵前期(24 h)风味物质检测结果

如图2所示,发酵24 h时,GC-MS检测的样品中有20种挥发性风味物质,包括6种酸类,2种醛类,1种酮类,4种酯类,3种烃类,4种其他类物质。最高峰面积为8.122 min出峰的4-(羟甲基)咪唑(55.304%)、8.483 min出峰的2-丁炔-二乙基-乙缩醛(36.033%)、7.040 min出峰的-二苄氧基-L-酒石酸酐(12.04%)和17.070 min出峰的糠酸(3.524%)。

感官评价结果为样品质地较均匀,为乳白色溶胶,黏度增大,基本不分层,在透明玻璃杯内摇动,有少量上清乳清析出,品尝后口感细腻,具有明显酸味,具有乳的滋气味但是风味不浓郁,可说明此阶段样品正在发酵,处于发酵初期阶段。

图2 开菲尔发酵初期(24 h)GC-MS谱图
Fig.2 GC-MS spectrum of the initial fermentation of Kefir fermented milk

2.3 发酵中期(48 h)风味物质检测结果

如图3所示,在发酵进入第2天时,GC-MS检测结果显示共有33种挥发性物质,9种酯类,6种酸类,5种醇类,3种烃类,5种酮醛类和5种其他类物质。最高峰面积为18.522 min出峰的5-氧代四氢呋喃-2-羧酸(3.046%)、8.011 min出峰的3,3-二异丙基-N-甲基杂氮环丁烷-2,4-二酮(2.599%)、17.236 min出峰的苯并呋喃-6,7-二醇(2.541%)和19.471 min出峰的甲基3-O-苯甲基-α-D-呋喃葡糖苷5,6-碳酸盐(1.532%)、18.480 min出峰的5-羟甲基糠醛(1.532%)、15.069 min出峰的乙酰氧基乙酸,2-萘基酯(1.579%)、18.148 min出峰的棕榈油酸(1.041%)、9.869 min出峰的庚酸(1.002%)。

感官评价结果为样品质地均匀,为乳白色溶胶,黏度增大有凝固感,无明显分层,有部分乳清析出,品尝后口感细腻,具有明显酸味,具有发酵乳特有的滋气味,风味不够浓郁,说明此阶段样品持续发酵,按照品尝风味判断处于发酵中期阶段。

图3 开菲尔发酵中期(48 h)GC-MS谱图
Fig.3 Mid-term GC-MS spectrum of Kefir fermented milk fermentation

2.4 发酵后期(72 h)风味物质检测结果

如图4所示,发酵进入第3天时,检测样品中的挥发性风味物质,共检测出51种风味物质,包括16种酯类,12种酸类,4种烃类,3种醛类,3种酮类,2种醇类,11种其他类物质。最高峰面积为4.971 min出峰的7,9-十八二酸甲酯(40.008%)、18.403 min出峰的棕榈酸(29.204%)、8.012 min出峰的3,3-二异丙基-5-甲基沸石-2,4-二酮(23.508%)、11.663 min出峰的乙酰氧基-2-甲基-吡喃-4-酮(23.508%)、7.761 min出峰的正戊酸(22.898%)、17.235 min出峰的苯甲酸甲酯(20.465%)、4.706 min出峰的1-戊烯-3-醇(13.739%)、5.515 min出峰的9,11-十八二酸甲酯(8.675%)、7.570 min出峰的1,3-丙二醇,2-甲基-二丙酸酯(8.222%)、5.461 min出峰的8,10-十八二酸甲酯(6.431%)、7.358 min出峰的苯甲酸,3,5-二氟苯基酯(6.147%)、12.123 min出峰的油酸(5.393%),10.209 min出峰的肉豆蔻酸(5.219%)。

感官评价结果为样品质地均匀,为乳白色凝胶,黏度适中具有发酵酸乳应有的黏度,无明显分层,无明显凝块,有少量乳清析出,在透明玻璃杯内摇动,有部分乳清析出,品尝后口感细腻,具有发酵酸乳特有的滋气味及芳香气味,风味浓郁,可说明此阶段样品持续发酵,按照品尝风味判断处于发酵后期阶段。

图4 开菲尔发酵中期(72 h)GC-MS谱图
Fig.4 Mid-term GC-MS spectrum of Kefir fermented milk fermentation

2.5 发酵末期(96 h)风味物质检测结果

如图5所示,发酵进入96 h时,检测样品中的挥发性风味物质共检测出18种挥发性风味物质,包括9种其他类物质、5种酯类、4种酸类。最高峰面积为硬脂酸在18.965 min出峰(2.684%)、正十五酸在13.270 min出峰(0.949%)、己酸在9.868 min出峰(0.835%)、β-桉叶油醇在5.557 min出峰(0.831%)。

感官评价结果为样品出现分层现象,伴有颗粒状凝胶悬浮,大量乳清析出,在透明玻璃杯内摇动,有少量气泡产生,品尝后酸感较重,具有发酵酸乳特有的浓郁气味,综合口感风味品质变劣,可说明此阶段样品持续发酵,按照品尝风味判断处于发酵末期阶段。

图5 开菲尔发酵后期(96 h)GC-MS谱图
Fig.5 Later period GC-MS spectrum of Kefir fermented milk fermentation

2.6 发酵末期(120 h)风味物质检测结果

由图6可知,在120 h风味物质种类和峰面积又增加了。一共有38种挥发性风味物质在样品中被检测到,包括11种酸、11种酯、5种烃类、5种酮醛类、3种醇类和3种其他类物质。最高峰面积为7.805 min出峰的戊酸(41.291%),在18.281 min出峰的棕榈酸(16.699%),在5.545 min出峰的1,3-双(肉桂酰氧基甲基)金刚烷(2.554%)。

感官评价结果为样品出现明显分层,伴有固体颗粒析出,颗粒黏连在发酵管壁上,大量乳清析出,在透明玻璃杯内摇动,有少量气泡产生,品尝后酸感较重,具有酸乳发酵过度特有的刺鼻酸味及浓郁气味,部分气味具有不良发酵感受,不易令人接受,综合口感风味品质变劣,可说明此阶段样品持续发酵,按照品尝风味判断处于发酵末期阶段。

图6 开菲尔发酵末期(120 h)GC-MS谱图
Fig.6 GC-MS spectrum of Kefir fermented milk during fermentation

2.7 开菲尔发酵过程中风味物质变化

如图7所示,酸类风味物质在开菲尔发酵过程中逐渐增加,72 h达到高峰,发酵制品酸味稳步增加。在发酵前期、中期检测到的酸类物质分子量较大,难于挥发,发酵后期、末期开始出现低分子量有机酸类如戊酸、糠酸与己酸等,因此发酵制品在发酵72 h后具有明显酸味。发酵120 h后随着丙酸等低级有机酸的大量产生,发酵制品开始出现不良刺激性酸味。结合感官评价,发酵终点已至。

酯类风味物质在开菲尔中稳定增加,72 h达到高峰,在发酵前期、中期检测到多为16个碳原子以上的的酯类物质,在常温中易挥发,发酵中后期小于7个碳原子的酯类物质开始出现,并逐渐增加。如48 h检测到的丙烯酸乙酯、呋喃-乙酯类物质等。72 h小于7个碳原子的酯类物质种类开始增多,此时感官评价开菲尔发酵乳制品风味较好。96 h检测的酯类物质种类急剧减少,主要为大于16个碳原子的酯。120 h小于7个碳原子的酯类物质开始出现,并急剧增加,风味浓郁[17]

在开菲尔中,发酵前期检测到6种酮醛类物质,主要为乳制品特有风味物质。如糠醛、呋喃醛等。随着发酵的进行主要酮醛类物质持续增加,72 h达到高峰,糠醛、二酮类化合物含量较高,发酵制品开始呈现良好风味[18]

烃类物质在开菲尔发酵过程中稳定存在,变化不大但其对发酵制品风味具有一定影响。例如发酵前期至后期检测到的3-氨基苯乙炔是重要的有机合成中间体[19]

在开菲尔中,醇类物质在发酵中期开始出现,因而一般含酒精的发酵乳制品可以控制此时为发酵终点。主要醇类物质包括1-己烯-3-醇、苯乙醇和麦芽醇等都是重要的香味中间体,可以呈现较为独特的芳香气味,对开菲尔发酵乳制品风味具有一定作用[20-21]

开菲尔发酵过程中还产生除上述几类风味物质外的其他类化合物,如呋喃类,半乳糖糖苷类物质等,还有少量未定物质,在发酵初期、前期有吡嗪、2-乙酰基呋喃、4-(羟甲基)咪唑等物质,它们是香料中间体参与风味物质的反应。在发酵末期120 h时检测含有丙酸酐、吲哚等物质,它们有恶臭、粪臭味,与发酵末期感官评价味道相吻合。

图7 开菲尔发酵过程中主要风味物质变化
Fig.7 Change of main flavor substances during Kefir fermentation

3 讨论与结论

酯类化合物是发酵乳中的一类重要挥发性化合物,主要是通过脂肪酸水解和微生物代谢产生。发酵乳中的酯类化合物的风味阈值较低,低浓度的酯类化合物对发酵乳风味的贡献较大。一般来说,对发酵乳的风味影响较大的酯类化合物主要是一些分子质量较低的酯,如乙酸甲酯、乙酸乙酯等。在新鲜的发酵乳中发现微量的乙酸乙酯,在发酵乳贮藏30 d后才检测到乙酸乙酯,且随着贮藏时间的延长,乙酸乙酯的浓度呈上升的趋势[9-11]。大多数酯类化合物具有水果和花香味,能降低脂肪酸和胺带来的苦味和其他异味[22-24]。开菲尔发酵过程中,棕榈酸乙酯、油酸乙酯、7,9-十八二酸甲酯含量变化如图8-a所示。

醛是牛奶中重要的香味物质,过量的乙醛会带来青草气味。醛化合物是发酵乳风味物质中比例较低属于跟踪香气成分,但对发酵乳的风味组合物有重要的影响。本研究中3-糠醛多次出现在发酵过程中,提供苦杏仁味香气,是重要的风味物质中间体[22]。酮类化合物多是由不饱和脂肪酸的氧化、热降解,氨基酸降解或微生物代谢产生[23]。开菲尔发酵过程中,3-糠醛,2-丁炔-二乙基-乙缩醛和3,3-二异丙基-N-甲基沸石-2,4-二酮含量变化如图8-b所示。

发酵初期优势酸类物质主要是棕榈酸,发酵前期开始出现癸酸、糠酸等饱和脂肪酸,开菲尔制品风味开始产生,发酵中期时,苯甲酸,棕榈油酸和庚酸所占比重逐渐增大,开菲尔制品特有风味开始出现,发酵后期,棕榈酸,正戊酸,月桂酸,肉豆蔻酸,油酸成为优势酸类物质,其中棕榈酸含量达到最高,开菲尔制品风味浓郁,口感细腻具有发酵酸乳特有的滋气味及芳香气味,发酵96 h达到末期时,酸类物质减少,主要是硬脂酸和己酸,开菲尔制品风味浓郁,酸感较重,但是总体口感风味品质劣变,发酵120 h时戊酸、棕榈酸、丙酸是最主要的酸类物质,酸感较重,具有酸乳发酵过度特有的刺鼻酸味及浓郁气味,部分气味具有不良发酵感受,不易令人接受,综合口感风味品质劣变。开菲尔发酵过程中,代表性酸类物质,棕榈酸、糠酸、癸酸含量变化如图8-c所示。

麦芽醇具有焦糖香,在稀溶液中有草莓香。发酵乳中重要的醇类化合物是乙醇,乙醇是葡萄糖和氨基酸代谢的最终产物。一般发酵乳中乙醇的含量较高,在0.2~9.9 mg/kg,而酸羊奶中乙醇的含量普遍低于酸牛奶中乙醇的含量[22, 25]。开菲尔中醇类物质在发酵中期开始出现,因而一般含酒精的发酵乳制品可以控制此时为发酵终点。主要醇类物质包括1-己烯-3-醇、苯乙醇和麦芽醇等,都是重要的香味中间体,可以呈现较为独特的芳香气味,对开菲尔发酵乳制品风味具有一定作用[20-21,25]。开菲尔发酵过程中,麦芽醇、苯丙醇含量变化如图8-d所示。

本研究中,开菲尔发酵乳全发酵过程中中共检测得到18种烃类化合物,开菲尔发酵乳发酵期间3-氨基苯乙炔,1-乙氧基-1-甲基环丁烷,乙基三甲基硅烷和1,3-双(肉桂酰氧基甲基)金刚烷等含量较大,烃类物质在开菲尔发酵过程中稳定存在,变化不大但其对发酵制品风味具有一定影响。例如发酵前期至后期检测到的3-氨基苯乙炔是重要的有机合成中间体[19]。开菲尔发酵乳全发酵过程中共检测得到34种其他类化合物,发酵过程中优势物质为4-(羟甲基)咪唑,发酵后期时,呋喃,吲哚等物质开始增多。

开菲尔中风味物质的来源主要有3种途径,原料乳中的成分、加工过程中产生的风味物质及开菲尔中微生物代谢产生的风味物质。因此,研究开菲尔发酵过程中风味物质动态变化规律,使我们对开菲尔生产的工艺技术进行了规范,不同的风味物质产生意味着生产处于不同的阶段,能够更好地指导生产实践,同时也揭示了新疆地区开菲尔的独特风味产生的缘由,对于今后产品风味改善以及风味的调配组合提供了理论依据,还能够对开菲尔制品的部分营养功能性进行分析,使今后可能的应用型生产实践根植于理论研究之上。本文应用顶空-气相色谱-质谱联用技术对新疆地方特色发酵乳制品开菲尔发酵过程中的挥发性风味物质动态变化规律进行了分析,结果表明此方法快速便捷,可以对新疆地方特色发酵乳制品开菲尔中的挥发性风味物质的成分含量进行有效的分析。

a-开菲尔发酵过程中优势酯类物质含量变化;b-开菲尔发酵过程中优势醛酮类物质含量变化;c-开菲尔发酵过程中优势酸类物质含量变化; d-开菲尔发酵过程中优势醇类物质含量变化
图8 开菲尔发酵过程中优势风味物质含量变化
Fig.8 Changes in the content of dominant flavor substances during Kefir fermentation

通过GC-MS鉴定结果分析,新疆特色发酵乳制品开菲尔风味物质鉴定结果中挥发性风味物质主要有6类,包括醇类、酮醛类、有机酸类、呋喃类、酯类和烷烃类,其中棕榈酸、糠酸、癸酸、糠醇、3-糠醛、麦芽醇等为优势风味物质,可以为今后研究新疆地方特色发酵乳制品开菲尔中的挥发性风味物质指纹图谱提供参考依据。

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Dynamic changes of flavor substances during Kefir fermentation

GULJAMAL·Aisa1,XING Jun 2,MA Long1,LI An1,ZHANG Rui1*

1((Xinjiang Special Environmental Species Protection and Regulation Biology Laboratory, College of Life Science, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China)2(Life Science and Technology College, Xinjiang University, Urumqi 830046,China)

Abstract In order to explore the change of flavor substances in the Kefir fermentation process, Kefir collected from Altay region was used as the experimental raw material. Kefir grains were separated and cultured, and then inoculated into sterilized milk. Headspace-gas chromatography-mass spectrometry (HS-GC-MS) was used to detect the dynamic change of flavor substances during fermentation. There were about 174 volatile flavor substances in the whole fermentation process. The flavor substances in Kefir were mainly six categories: acids, esters, ketoaldehydes, hydrocarbons, alcohols and others. During the fermentation process, the acid content increased first, and then decreased and increased. And the ester compounds showed the trend of increasing and then decreasing, while the hydrocarbons and ketone aldehydes did not change significantly. This article aims to provide data support for quality control and flavor improvement of the traditional Kefir.

Key words Kefir;fermentation process; flavor substances;dynamic changes

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023537

引用格式:古丽加马力·艾萨,邢军,马龙,等.开菲尔发酵过程中风味物质动态变化[J].食品与发酵工业,2020,46(12):173-178.GULJAMAL·Aisa, XING Jun, MA Long, et al. Dynamic changes of flavor substances during Kefir fermentation[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(12):173-178.

第一作者:本科生(张瑞教授为通讯作者,E-mail:zhangrui1124@xjnu.edu.cn)

基金项目:国家自然科学基金项目(31560440);新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室(XJD1414-2018-01)

收稿日期:2020-02-06,改回日期:2020-03-05