西式熏煮火腿是西式低温肉制品的一种，其营养价值高，风味卓越，肉质鲜口感好，深受大众喜爱[1]。目前，国内外学者对西式熏煮火腿的研究主要集中在原辅料品质特性、加工工艺改善及品质提升研究、西式熏煮火腿加热和烟熏等过程的质量安全控制三个方面[2-4]。西式熏煮火腿区别于其他西式火腿在于其独特的烟熏风味，目前常使用传统发烟方式烟熏火腿，但烟熏过程中常产生苯并芘和多环芳烃等有害物质[5]。为避免有害物质的产生，绿色烟熏液研制并上市，液熏法赋予西式火腿烟熏风味应运而生，然而其烟熏风味却不如传统烟熏方式烟熏风味好[6]。研究表明，风味成分与食品基质中的蛋白质、碳水化合物和脂质相互作用，从而影响对某些风味的感知[7]。其中，蛋白质由于氨基酸侧链结构的显著变化，具有以多种方式与风味化合物相互作用的潜力[8]，这些相互作用包括离子键，氢键和疏水键等。上述类型的相互作用本质上属于都是非共价相互作用，故具有可逆性[9]。肌浆蛋白占猪肉蛋白的30%～35%[10]，属于水溶性蛋白，在维持肉质方面起着重要作用。因此，为了优化西式熏煮火腿的烟熏风味，有必要探究西式熏煮火腿不同加工环节对火腿肌浆蛋白结构的影响，以及西式熏煮火腿中肌浆蛋白结构变化与风味之间的关系。
本研究以西式熏煮火腿不同加工阶段的肌浆蛋白为对象，运用傅里叶变换红外、紫外、内源荧光等光谱技术手段，测定不同加工环节肌浆蛋白巯基总量、表面疏水性及蛋白质结构变化，旨在解释西式熏煮火腿不同加工环节中肌浆蛋白结构变化，对提升西式熏煮火腿产品品质、优化西式火腿加工工艺具有指导意义为烟熏液在西式火腿加工中的使用及风味的提升提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
西式火腿制作材料：新鲜猪后腿精瘦肉；食盐、白砂糖、味精、黑胡椒粉、淀粉等调味料，购于合力超市；乳酸钾，北京清源食品添加剂有限公司；亚硝酸盐，杭州龙山化工有限公司；三聚磷酸钠、焦磷酸钠、D-异抗坏血酸钠，河南万邦实业有限公司；黄原胶、卡拉胶，内蒙古阜丰生物科技有限公司；大豆分离蛋白，万利达生物科技有限公司；硬木烟熏香味料SmokeZ C-10-12、C-10-06，美国红箭公司。以上材料均为食品级。
试剂：尿素，天津市福晨化学试剂厂；Tris，美国Genview公司；K2HPO4、NaH2PO4、KCl，成成金山化学试剂有限公司；2-硝基苯甲酸(DTNB)，上海麦克林生物化学公司；8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；β-巯基乙醇，广东翁江化学试剂有限公司；KBr，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电子分析天平(CP214)，奥豪斯仪器有限公司；梅特勒-托利多的便携式pH计(Seven2GoTM)，瑞士；高速分散均质机(XHF-DY)，宁波新芝生物科技股份有限公司；全波长酶标仪(SpectraMAX190)，美国Molecular Devices公司；超声清洗器(SB25-12DT)，上海冠特超声仪器有限公司；斩拌机(ZBJ-40)、 灌肠机(GCJ-50)，诸城市华刚机械有限公司；真空滚揉机(GR-60)，诸城市新得利食品机械有限公司；傅里叶变换红外光谱仪VERTEX70，日本岛津公司；紫外-可见分光光度计(UV2600)日本，Shimadzu公司；荧光分光光度计(Cary eclipse)，美国Aglient公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品的制备
西式熏煮火腿加工方法：
(1)修整切块：将后腿精瘦肉切成小肉块，肉块规格为1 cm×2 cm×3 cm。
(2)腌制：按照腌制配方制作好腌液，倒入切好的肉中，充分混合均匀，放在0～4 ℃环境腌制24～48 h。腌制配方(以实际腌制肉质量计)：食盐 2.5%，亚硝酸钠0.015%，异抗坏血酸钠0.06%，多聚磷酸钠0.1%，焦磷酸钠0.2%，白砂糖0.8%，蒸馏水5%左右。
(3)真空滚揉：在0～8 ℃下滚揉4 h，每滚揉20 min间歇10 min，在滚揉快结束时按加工配方加入配料，再继续滚揉10 min，以保证其分布均匀。加工配方(以实际加工肉质量计)：胡椒粉0.5%、味精0.5%、大豆蛋白2.2%、淀粉6.5%、卡拉胶0.3%、黄原胶0.3%、红曲红0.01%、硬木烟熏香味料Smoke ZC-10-12型0.2%、Smoke ZC-10-06型 0.5%、乳酸链球菌素0.1%。
(4)斩拌：取滚揉后的20%的肉料，经斩拌机斩至肉糜后与肉块混匀。
(5)灌肠：将塑料肠衣剪开，一端打卡后排气，操作灌肠机灌馅，每间隔约20 cm打1次卡。
(6)蒸煮：预先在蒸煮锅内加入清洁水，预热到85 ℃放入火腿，将水温恒定在80 ℃蒸煮2 h。
(7)冷却：采用流水冷却，冷却后于0～5 ℃冷库保藏。
依据上述实验室探索的西式熏煮火腿加工过程生产西式熏煮火腿，分别在原料肉、腌制、真空滚揉、斩拌和蒸煮环节进行取样。
1.3.2 肌浆蛋白的提取
参照XIA等[11]的方法。准确称量10 g肉样于100 mL烧杯中，加入40 mL 0.03 mol/L缓冲液(含0.04 mol/L NaCl，pH=6.5)。在冰浴条件下以8 000 r/min匀浆3 min后12 000 r/min，4 ℃冷冻离心20 min取上清液，保存于4 ℃下并尽快使用。
以牛血清白蛋白作为标准，采用二辛可宁酸法测定蛋白质浓度。
1.3.3 肌浆蛋白巯基含量的测定
巯基总量的测定方法参考XU等[12]的方法。使用20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4磷酸盐缓冲液(含 0.6 mol/L KCl，pH=7.0)将肌浆蛋白稀释到浓度为4 mg/mL。以未加入肌浆蛋白的缓冲液混合体系为空白。巯基总量的计算如公式(1)所示：
巯基总量
(1)
式中：A为减去试剂空白后412 nm处肌浆蛋白吸光值；D为肌浆蛋白稀释倍数；C为肌浆蛋白质量浓度，mg/mL。
1.3.4 肌浆蛋白质表面疏水性的测定
参考BOYER等的方法[13]。以原料肉中肌浆蛋白为对照，疏水强度以不同加工环节肌浆蛋白与原料肉组肌浆蛋白荧光强度的比例(相对荧光强度)计，计算公式如公式(2)所示：
疏水强度
(2)
1.3.5 肌浆蛋白化学作用力的测定
参考G
MEZ-GUILLÉN等的方法[14]。分别准确称取1 g不同加工环节的肉样于50 mL烧杯中，以原料肉为对照。分别准确吸取10 mL 0.05 mol/L NaCl(SA组)、0.6 mol/L NaCl(SB组)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC组)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD组)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/L β-巯基乙醇(SE组)于装有样品的烧杯中。设置匀浆机转速为10 000 r/min时间1 min，冰浴静置2 h，SE组在通风橱中操作。设置冷冻离心机转速为10 000 r/min，温度4 ℃，离心时间10 min，离心后取上清液。以牛血清白蛋白作为标准，采用二辛可宁酸法测定蛋白质浓度。各化学作用力计算如公式(3)、(4)、(5)、(6)所示：
离子键含量=CSB-CSA
(3)
氢键含量=CSC-CSB
(4)
疏水相互作用=CSD-CSC
(5)
二硫键含量=CSE-CSD
(6)
式中：CSA、CSB、CSC、CSD、CSE、分别为溶解于SA、SB、SC、SD、SE的蛋白质含量，各化学作用力相对含量以该化学作用力含量与所有化学作用力含量之和的比计算。
1.3.6 肌浆蛋白傅里叶变换红外光谱分析
参考蓝蔚青等[15]的方法。
1.3.7 肌浆蛋白内源荧光光谱分析
参考李庆舒等[16]的方法。
1.3.8 肌浆蛋白紫外吸收光谱分析
参考康怀彬等[17]的方法。
1.4 数据处理
实验设置3次平行，结果用X±SD表示，数据采用IBM SPSS Statistics 23软件进行分析，采用ANOVA进行LSD差异分析，P<0.05表示差异显著。Origin 2016软件用于制图。
2 结果与分析
2.1 西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质巯基总量变化
已有研究表明，蛋白展开的过程中原来掩埋于蛋白内部的作用位点、疏水基团和巯基基团就会暴露于蛋白表面与风味化合物发生共价结合[18]，将蛋白溶液由水溶性环境转换成疏水性环境并形成二硫键，且蛋白分子的疏水区域和巯基基团具有吸附性，从而增强蛋白的风味吸附能力[19]。蛋白质巯基分为表面活性巯基和包埋于蛋白质分子内部的巯基，巯基总量即蛋白质分子的所有巯基。实验西式熏煮火腿不同加工环节肌浆蛋白巯基总量的变化结果如图1所示。
图1 西式熏煮火腿不同加工环节肌浆蛋白巯基总量的变化
Fig.1 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on total sulfhydryl content of sarcoplasmic protein
由图1可知，肌浆蛋白巯基总量在西式熏煮火腿加工过程中呈先逐渐降低再急速上升的趋势，斩拌环节肌浆蛋白巯基总量最低，这可能是因为快速斩拌的剪切力导致蛋白内部或蛋白质间有外在因素和环境变化。蒸煮环节肌浆蛋白巯基总量最高(P<0.01)(图1)，在蒸煮过程中，温度升高使掩埋在蛋白质内部的巯基基团逐渐暴露，巯基总量升高。KO等[20]等指出热环境导致蛋白结构改变，蛋白质分子链展开，暴露更多的疏水性风味结合位点，这一点与实验结果一致。
2.2 不同加工环节肌浆蛋白表面疏水性变化
表面疏水性的变化已成功用于反映经加压和超声修饰等处理后蛋白质三级和四级结构变化[18,21]。以ANS作为荧光探针，测定西式熏煮火腿不同加工环节肌浆蛋白表面疏水性，结果如图2所示。
图2 西式熏煮火腿不同加工环节肌浆蛋白表面疏水强度 的变化
Fig.2 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on surface hydrophobicity of sarcoplasmic protein
由图2可知，在西式熏煮火腿加工过程中，肌浆蛋白相对荧光强度先轻微降低再升高(P<0.05)，真空滚揉环节达到最大值后逐渐降低(P<0.01)，这可能与真空环境下，受到物理作用力后蛋白质暴露更多疏水基有关。荧光强度所表征的表面疏水性残基含量在加工过程中先轻微下降后增加，后逐渐降低。CHELH[22]的研究表明随着加热温度的上升和加热时间的延长(最高温度70 ℃，加热时间30 min)，肌原纤维蛋白的表面疏水性不断升高。虽然蒸煮后肌肉肌浆蛋白巯基总量最高，但在西式火腿的蒸煮环节，蒸煮温度为80 ℃时间2 h，蛋白质在长时间蒸煮过程中发生变性且结构趋于稳定，故蛋白质表面疏水性反而降低。
2.3 不同加工环节蛋白质化学作用力变化
肌浆蛋白化学作用力变化及显著性差异分析如表1所示。与原料肉相比，腌制、真空滚揉、斩拌和蒸煮过程中离子键相对含量显著下降(P<0.05)。氢键相对含量除在蒸煮环节剧烈减少(P<0.05)外，在不同加工环节差异不明显，蒸煮过程是一个加热过程，加热导致了氢键大量断裂[22]。疏水相互作用相对含量在西式熏煮火腿加工过程中呈现上升的趋势(P<0.05)，并在蒸煮环节达到最大值。与原料肉相比，二硫键相对含量在蒸煮环节最高(P<0.05)，蛋白质之间产生了交联作用并促进了二硫键的形成[23]，表明蒸煮后火腿蛋白质网络结构致密，凝胶强度增强。
表1 西式熏煮火腿不同加工环节化学作用力的变化
Table 1 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on chemical force of sarcoplasmic protein
加工环节离子键相对含量/%氢键相对含量/%疏水相互作用相对含量/%二硫键相对含量/%原料肉 35.13±1.64a22.37±1.45a46.04±1.82c8.46±0.83c腌制 28.79±1.19b21.80±2.63a47.64±1.64c7.56±1.01c真空滚揉22.50±2.32cd17.72±2.22ab60.38±2.40b11.54±1.20b斩拌 25.81±1.81bc17.27±1.45b59.11±1.19bc6.84±1.18c蒸煮 7.50±2.06e6.62±0.81c73.91±1.36a17.25±1.78a
注：同一列中不同小写字母表示不同加工环节化学作用力具有显著性差异(P<0.05)
2.4 西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质傅里叶变换红外光谱分析
蛋白质的结构从平面到空间有一级结构的氨基酸按序排列、二级结构的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲、三级结构在二级结构上的折叠，和四级结构的蛋白质分子空间排列[24]。蛋白质结构的相关研究主要分有两类：一类是蛋白质晶体结构的解析，主要技术有X射线晶体衍射，核磁共振技术和电镜技术[15]；一类是溶液中蛋白质分子构象的研究，主要方法有荧光光谱法、傅里叶变换红外光谱法、圆二色谱法和拉曼光谱法等[25]。通过傅里叶变换红外光谱对西式熏煮火腿不同加工环节肌浆蛋白分子构象进行分析，结果如图3所示。
图3 西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质傅里叶变换 红外光谱图
Fig.3 Fourier transform infrared spectra of sarcoplasmic protein at different processing operations of western-style smoked ham
由图3可知，西式熏煮火腿原料肉中肌浆蛋白酰胺A带吸收峰的波数为3 235 cm-1,反映了N—H的伸缩振动，酰胺B带吸收峰的波数为2 781 cm-1，酰胺Ⅰ带吸收峰的波数为1 637 cm-1，由C
O的伸缩振动产生，酰胺Ⅱ带吸收峰波数为1 481 cm-1，反映了C—N或N—H的弯曲振动[26]，酰胺Ⅲ带吸收峰波数为1 234 cm-1，由C—H的伸缩或N—H弯曲振动产生[27]。与原料肉相比，真空滚揉、斩拌和蒸煮环节肌浆蛋白的酰胺A带分别从3 235 cm-1处右移至3 440 cm-1、3 446 cm-1和3 433 cm-1附近，说明发生了键长变短的振动，或形成了共轭体系，键长趋于平均化，吸收峰向高波数移动[28]。在2 781 cm-1附近，腌制后肌浆蛋白酰胺B带吸收峰与原料肉相比未发生移动，真空滚揉、斩拌和蒸煮后肌浆蛋白酰胺B带右移至2 943 cm-1、2 325 cm-1和2 922 cm-1，说明在这3个环节肌浆蛋白氢键发生了变化。1 637 cm-1附近的酰胺Ⅰ带吸收峰未发生明显移动，表明在西式熏煮火腿不同加工环节中肌浆蛋白的CO的伸缩振动变化不大，酰胺Ⅰ带未发生明显变化。酰胺Ⅱ带吸收峰出现在1 481 cm-1，腌制和真空滚揉后肌浆蛋白吸收峰为发生明显移动，但在斩拌和蒸煮后吸收峰左移至1 463 cm-1和1 458 cm-1，这可能与N—H弯曲振动和C—N伸缩振动有关[29]。原料肉肌浆蛋白的酰胺Ⅲ带吸收峰在1 234 cm-1附近，经过腌制、真空滚揉和斩拌，吸收峰右移至1 240 cm-1、1 249 cm-1，说明在腌制、真空滚揉和斩拌环节引起了C—N伸缩振动，C—O面内弯曲振动和C—C伸缩振动。在蒸煮环节吸收峰左移至1 228 cm-1，说明温度可能改变了官能团振动方式。此外，我们发现在2 248～2 250 cm-1附近，原料肉中无明显吸收峰，但在经过腌制、真空滚揉、斩拌和蒸煮后出现了明显吸收峰，这可能与西式熏煮火腿腌制和滚揉环节加入的腌制配方和加工配方中的调料与添加剂有关。在西式熏煮火腿的加工过程中，酰胺A带、酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带均发生了移动，且不同加工环节肌浆蛋白氨基酸残基吸光度不同，说明蛋白质的二级结构也发生改变[30]。
2.5 西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质内源荧光光谱分析
蛋白质变性会导致其构象发生变化，从而改变芳香族氨基酸残基的位置和微环境，芳香族氨基酸残基可吸收紫外线入射光以发出荧光，因此内源性荧光光谱可用于研究蛋白质构象[31]。
西式熏煮火腿不同加工环节肌浆蛋白荧光发射光谱如图4所示。由图4可知原料肉肌浆蛋白的荧光峰位置在338 nm，腌制和蒸煮后肌浆蛋白的荧光峰位置相对于原料肉发生红移，荧光峰位置分别为349 nm和352.96 nm，且蒸煮后荧光强度降低(P<0.05)，这与LEFEVRE等的研究结果大西洋鲑肌原纤维蛋白分子随着加热温度的升高，内源荧光强度逐渐降低的结果一致[32]。真空滚揉和斩拌后肌浆蛋白的荧光峰位置相对于原料肉发生蓝移，荧光峰位置分别为327.96 nm和329.06 nm。荧光峰位置蓝移表明荧光发射基团处于更加疏水的环境中，蛋白分子的微环境发生了变化，也能反映出肌浆蛋白表面疏水性的增大[21]。这与肌浆蛋白表面疏水性结果一致。
图4 西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质内源荧光光谱
Fig.4 Intrinsic fluorescence spectra of sarcoplasmic protein at different processing operations of western-style smoked ham
2.6 西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质紫外吸收光谱分析
蛋白中的色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)残基的芳香结构对紫外光有吸收作用使得蛋白能够吸收紫外光[33]。280 nm左右处的峰为蛋白中Trp、Tyr以及Phe残基中共轭双键的吸收峰，代表的是蛋白中氨基酸残基微环境的变化，因此紫外线吸收光谱法可用于研究蛋白质三级结构的变化[34]。西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质紫外吸收光谱如图5所示。
图5 西式熏煮火腿不同加工环节蛋白质紫外吸收光谱
Fig.5 Ultraviolet-visible spectra of sarcoplasmic protein at different processing of western-style smoked ham
由图5可知，原料肉中肌浆蛋白紫外最大吸收峰波长(λmax)在284 nm处产生了特征吸收峰，与原料肉相比不同加工环节均发生了不同程度的红移，腌制、真空滚揉、斩拌和蒸煮环节肌浆蛋白λmax分别红移至293、299、294和297 nm，说明在西式熏煮火腿加工过程中，蛋白质结构发生了变化或者受到溶剂效应的影响，从而使λmax向长波方向移动。与真空滚揉环节相比，斩拌环节λmax发生轻微蓝移，说明斩拌后使得色氨酸和酪氨酸残基暴露于蛋白质表面，其所处微环境由非极性偏向极性[35]，这一结果与巯基总量、表面疏水性的结果相符合。
3 结论
在西式熏煮火腿加工过程中，肌浆蛋白巯基总量呈先逐渐降低再急速上升的趋势，分别在斩拌环节最低、蒸煮环节最高，肌浆蛋白表面疏水强度则呈先轻微降低后升高再逐渐降低，分别在真空滚揉环节最高、蒸煮环节最低，表明真空环境下，受到物理作用力后蛋白质暴露更多疏水基。离子键与氢键在西式熏煮火腿不同加工环节发生不同程度的断裂，疏水相互作用则表现出上升趋势，二硫键的形成与巯基含量相关，在蒸煮环节二硫键相对含量最高。肌浆蛋白酰胺A带、酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带均发生了移动，且不同加工环节肌浆蛋白氨基酸残基吸光度不同，说明蛋白质的二级结构也发生改变。紫外吸收光谱和内源荧光光谱结果表明，不同加工环节对肌浆蛋白的三级结构产生了影响，在蒸煮环节尤为明显，更多蛋白质残基暴露于蛋白质表面。
肌浆蛋白在西式熏煮火腿加工中扮演了重要的角色，蛋白质化学作用力与结构变化表明肌浆蛋白有更多与风味物质结合的可能，在西式熏煮火腿实际加工过程中，可以将烟熏液的使用与产品感官品质结合，本研究条件下在真空滚揉环节加入烟熏液为宜。
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