甜型黄酒陈酿过程中5-羟甲基糠醛的生成规律

黄酒(Chinese rice wine)是以稻米、小麦等为主要原料，经浸米、蒸煮、糖化发酵、压榨过滤、煎酒、陈酿等步骤酿造而成的中国传统发酵酒精饮料[1]。其中甜型黄酒是指含糖量>100 g/L的黄酒，其口味鲜甜醇厚，香气浓郁。陈酿时间是评价黄酒质量高低的重要指标[2]，新酒经过陈酿不断发生物理和化学反应。由于黄酒中含有丰富的还原糖[3]、氨基酸[4]等物质，新酒中羰基化合物和氨基化合物在常温条件下不断进行美拉德反应，并产生大量美拉德反应产物，一方面增加了黄酒的色泽和风味[5-6]，另一方面很多美拉德反应产物，例如5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)、糠醛和丙烯酰胺[7]等，具有一定的神经毒性和遗传毒性[8-9]。

通常新鲜果汁中5-HMF不超过10 mg/L[7]，欧盟规定蜂蜜中的最大限量为40 mg/kg[8]；在酒精饮料中，例如威士忌和朗姆酒中5-HMF质量浓度达到40～50 mg/L[9]；在干李子及其饮品、咖啡粉、可可粉等食品中5-HMF质量分数较高，可超过500 mg/kg[10]。新鲜食用的食品/饮品中5-HMF主要来源于热处理加工[11-14]，而黄酒中5-HMF是在较长的储存过程中产生的，当黄酒中5-HMF含量过高且摄入过多会对人体健康产生不利影响。这些具有安全风险的物质在一定程度上影响了黄酒的发展。

本文研究了甜型黄酒陈酿过程中5-羟甲基糠醛的含量变化，结合甜型黄酒中主要成分的含量变化(还原糖、氨基态氮、总酸及pH值等)，并通过甜型黄酒模拟体系设置各因素(理化指标)与5-HMF形成的关系，揭示了5-羟甲基糠醛在甜型黄酒陈酿过程中的生成规律。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

陈酿黄酒样品，江苏和浙江地区3个酒厂(B、G、Z)提供的陈酿甜型黄酒，样品具体信息如表1所示。

5-羟甲基糠醛(5-HMF)标准品，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；DNS试剂，上海源叶生物科技有限公司；甲醇(HPLC级)、葡萄糖、氨基酸(Gly, Ala,Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Asp, Glu, Lys, Met, Ser, Thr,Cys, Pro, His, Arg)、无水乙醇、乳酸、NaOH、甲醛等，中国医药集团化学试剂有限公司。

HITACHI chromaster高效液相色谱仪，日本日立公司；Agilent分析色谱柱Eclipse Plus C18 250 mm×4.6 mm(5 μm)，美国安捷伦公司；Enspire多标记检测系统(酶标仪)，珀金埃尔默有限公司；DK-8D电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；AS220.R2电子天平，波兰RADWAG Wagi Elektroniczne公司；FE28pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SB-4200DT超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酒中理化指标的检测

还原糖测定采用DNS法[15]；pH、总酸、氨基态氮的测定参照GB/T 13662—2018《黄酒》[16]。

1.2.2 5-羟甲基糠醛(5-HMF)标准溶液的配制

精确称取0.037 29 g 5-HMF 标准品, 用5%甲醇水溶液溶解后定容至100 mL, 制得0.372 9 mg/L 的5-HMF 标准品贮备液，并用5%(体积分数)甲醇水溶液稀释成不同浓度的标准品工作液。

1.2.3 样品的前处理及5-羟甲基糠醛(5-HMF)检测方法

将黄酒样品用5%甲醇水溶液稀释至相应浓度，使用0.45 μm纤维素滤膜过滤后进样。

使用高效液相色谱法检测黄酒中5-HMF[17]。将20 μL样品注入Agilent Eclipse Plus C18分析色谱柱进行色谱分离，使用甲醇和超纯水进行等度梯度洗脱(体积比5∶95)；在30 ℃以1.0 mL/min的流速进行检测，在284 nm记录色谱图来进行数据采集。样品中的5-HMF含量通过标准曲线计算。

1.2.4 甜型黄酒模拟体系的构建

配置质量浓度为200 g/L葡萄糖溶液母液，20 g/L混合氨基酸溶液母液(17种氨基酸等比混合)，12 g/L乳酸溶液母液。因素条件(葡萄糖、氨基酸、乳酸)为分别添加该因素质量浓度不同的工作液，其余因素添加浓度条件固定，其中固定浓度条件分别为葡萄糖质量浓度100 g/L、氨基酸质量浓度3 g/L、乳酸质量浓度6 g/L，之后使用15%(体积分数)乙醇水溶液定容；因素条件(pH值)为添加上述相同固定浓度条件，使用15%(体积分数)乙醇水溶液定容，之后调节pH至相应梯度。

将所有样品置于90 ℃、1 h水浴加热，结束后立即冷却至室温。样品按1.2.3进行5-HMF的检测。

1.3 数据分析

每个实验进行平行重复3次。数据表示为平均值±标准误差。使用Orgin 2016、Adobe Illustrator和 SPSS 19.0软件进行数据统计、方差分析和作图。Pearson检验用于确定平均值之间差异的显着性，P>0.05表示无显著性差异，0.01<P<0.05 表示显著性差异，P<0.01表示极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 黄酒中5-羟甲基糠醛的含量

2.1.1 5-羟甲基糠醛检测的标准曲线

取5-羟甲基糠醛标准品贮备液，用5%(体积分数)甲醇水溶液稀释成质量浓度不同的标准品工作液，在上述色谱条件下进样，以5-羟甲基糠醛的峰面积与其质量浓度进行线性回归，得到回归方程y=483 793x+9 107.6，R2=0.999 3。实验结果表明，其质量浓度与峰面积之间存在良好的线性关系。

2.1.2 黄酒陈酿过程中5-羟甲基糠醛的含量

从甜型黄酒在陈酿过程中5-羟甲基糠醛(5-HMF)的含量变化(图1)来看，在常温条件下，随时间增加美拉德反应不断进行，甜型黄酒中5-HMF含量从初始较低到呈指数增加，且后期增长趋势变缓。从地域上看，其中酒厂G(浙江地区)中5-HMF的整体含量较高，其5-HMF的质量浓度在新酒中为15.35 mg/L，8年陈酿后达到565.40 mg/L，可能和其传统型发酵工艺积累较多还原糖和氨基态氮以及酒体酸度相对较高有关。而酒厂B、Z(江苏地区)8年陈酿后5-HMF质量浓度分别达到516.56和401.70 mg/L，可能和江苏地区黄酒大多为清爽型工艺，黄酒中糖分、氨基态氮含量及总酸含量都较低有关。

图1 甜型黄酒陈酿过程中5-羟甲基糠醛的质量浓度
Fig.1 Content of 5-hydroxymethylfurfural during the aging process of sweet Chinese rice wine

2.2 甜型黄酒中理化指标的含量

2.2.1 甜型黄酒中还原糖及氨基态氮含量

5-HMF的生成途径主要有2条，一条为还原糖和氨基酸之间的美拉德反应[12]，另一条为还原糖高温条件下直接裂解[18]，例如果糖可以在强酸性干燥条件下脱水得到。而在黄酒中5-HMF主要来源于美拉德反应，即醛糖和氨基化合物经反应生成N-糖基胺，之后经过Amadori重排生成重排产物，在酸性条件下(pH≤7)生成5-HMF。

由图2可知，在甜型黄酒陈酿过程中还原糖含量和氨基态氮含量都在不断提高，还原糖含量增加一方面主要是由于在黄酒酸性作用下淀粉糊化后逐渐转化成葡萄糖，另一方面在长时间储存过程中液体的蒸发致使还原糖的浓度有所增加；而黄酒中氨基态氮的不断升高是由于在黄酒陈酿过程中蛋白质会逐渐被分解为多肽和氨基酸。由此印证了2.1中酒厂G甜型黄酒中5-HMF的含量相对较高是由于其还原糖和氨基态氮含量相对较高。

所以甜型黄酒中5-HMF含量的逐年增加，一方面是由于随时间增加美拉德反应不断进行，另一方面是由于还原糖和氨基态氮不断提高从而为5-HMF提供底物。

a-还原糖质量浓度;b-氨基态氮质量浓度
图2 甜型黄酒陈酿过程中还原糖及氨基态氮质量浓度的变化
Fig.2 Changes of reducing sugar and amino nitrogen content during the aging of sweet Chinese rice wine

2.2.2 甜型黄酒中pH、总酸含量

5-HMF是美拉德反应在酸性条件下形成，由于陈酿过程中黄酒中醇酸类不断酯化以及少量有机酸的挥发，如图3所示，在甜型黄酒陈酿过程中黄酒的总酸含量都降低了0.3～1 g/L，相应的pH值略微升高了0.05～0.2，虽然pH值在3.5～4.0仍促进5-HMF的生成，这可能是甜型黄酒在1年陈酿后5-HMF增长速度减慢的一个原因。

a-pH值;b-总酸质量浓度
图3 甜型黄酒陈酿过程中pH值、总酸质量浓度的变化
Fig.3 Changes of pH,total acid content during the aging of sweet Chinese rice wine

2.3 甜型黄酒中5-羟甲基糠醛的含量与理化指标的相关性分析

在探究了3个酒厂甜型黄酒中5-HMF含量及其黄酒中主要成分的含量变化后，可以看出3个酒厂之间只存在含量差异但变化规律相似，故将3个酒厂的5-HMF含量及理化指标含量平均值作相关性分析，如图4所示，5-HMF与所有理化指标都呈显著相关，其中5-HMF与还原糖含量和氨基态氮含量在0.05水平(双侧)上显著相关，而5-HMF 与pH和总酸含量在0.01水平(双侧)上显著相关，证明在甜型黄酒中还原糖和氨基态氮作为反应底物，低pH值与酸性条件作为反应条件都是影响5-HMF含量的重要因素。

图4 甜型黄酒中5-HMF的含量与理化指标含量的相关性
Fig.4 Correlation between 5-HMF and physicochemical parameters in sweet Chinese rice wine
注：**表示在0.01水平(双侧)上显著相关；*表示在 0.05 水平 (双侧)上显著相关

2.4 甜型黄酒模拟体系中5-羟甲基糠醛的含量与各影响因素的关系

2.4.1 葡萄糖含量及氨基酸含量与5-HMF生成的关系

在甜型黄酒中总糖一般以葡萄糖含量计[14]，使用葡萄糖作为甜型黄酒模拟体系的还原糖进行实验。以葡萄糖的浓度与5-HMF含量进行线性回归，得到回归方程为y=3.737 6x-37.618，R2=0.994 4，如图5-a所示，葡萄糖含量和5-HMF生成呈良好的线性相关。也就是说黄酒的甜度越高时，其5-HMF的含量越多。另外当葡萄糖不存在时，此时模拟体系中不生成5-HMF，进一步证实还原糖(葡萄糖)是甜型黄酒中生成5-HMF的必要因素。

氨基态氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，使用游离氨基酸含量表示氨基态氮含量。由图5-b可知在模拟体系中少量添加氨基酸后，随着氨基酸浓度的增加5-HMF的含量也随之增加，这时由于氨基酸含量的不断增加和葡萄糖反应生成5-HMF。当添加氨基酸质量浓度超过8 g/L，5-HMF的含量明显下降，此时体系中过量氨基酸又和5-HMF继续美拉德反应从而降低了其含量，也就是说氨基酸不是甜型黄酒中生成5-HMF的必要因素，但甜型黄酒中存在的氨基态氮的含量(2.2.1)影响着其5-HMF的含量，可以和还原糖不断反应生成5-HMF。

a-葡萄糖;b-氨基酸
图5 甜型黄酒模拟体系中5-HMF质量浓度与葡萄糖浓度和氨基酸质量浓度的变化
Fig.5 Changes of 5-HMF, glucose and amino acid concentration in sweet Chinese rice wine simulation

2.4.2 pH值、总酸含量与5-HMF生成的关系

如图6-a所示，在美拉德反应的甜型黄酒模拟体系中，当pH≤7时会生成5-HMF，尤其是当pH<3时含5-HMF会剧烈生成，在pH=1时体系产生的5-HMF量达到了1 393 μg/L，是pH=7时体系中5-HMF含量的116倍。由2.2.2得到甜型黄酒中的pH在3～4，此时的甜型黄酒也是促进5-HMF生成的体系。而当pH>7时不生成5-HMF，此时醛糖和氨基化合物反应生成的Amadori重排物在碱性条件下生成醇醛类物质等其他美拉德反应产物。

在黄酒中总酸含量一般以乳酸含量计[14]。随着乳酸含量的增加，模拟体系中5-HMF含量随之逐渐增加，如图6-b所示，当外加乳酸的含量为0 g/L时，此时体系仍然有5-HMF的生成，可能因为此时体系pH值依然为酸性(pH<6)，如图6-c所示。当乳酸含量不断增加时，体系的pH值也在不断降低，从而不断促进体系中5-HMF的生成。所以总酸含量对5-HMF积累的作用是通过改变体系pH值来影响5-HMF的含量。

综上所述，在甜型黄酒体系中pH值是影响5-HMF生成的必要因素，尤其在极低pH值时非常有利于5-HMF的生成。

a-pH值；b-乳酸；c-不同乳酸质量浓度下pH值
图6 甜型黄酒模拟体系中5-HMF质量浓度与pH值和总酸质量浓度的变化以及不同总酸质量浓度下的pH值
Fig.6 Changes of 5-HMF,pH value and lactic acid content in sweet Chinese rice wine simulation system and pH value under different lactic acid content

3 结论

其他新鲜食品中5-HMF主要来源于热处理过程，在甜型黄酒生产工艺中煎酒时间较短且温度相对热处理食品较低，甚至有些甜型黄酒由于含糖量高且酒精度高不需要煎酒杀菌处理，所以其5-HMF含量主要是常温长时间储存产生的。在甜型黄酒陈酿过程中，5-HMF含量随着陈酿时间增加而逐年增加，同时黄酒中还原糖和氨基态氮的含量也在缓慢增加，并由甜型黄酒模拟体系实验证实还原糖对于5-HMF生成的必要作用和氨基酸的存在对5-HMF生成的影响作用，即在甜型黄酒陈酿过程中可以为5-HMF的生成源源不断提供底物。5-HMF是美拉德反应在酸性条件下形成的，由模拟体系实验得到5-HMF在pH值越低时越容易生成，而在甜型黄酒陈酿过程中总酸含量略减少，相应pH值在升高，可能是在甜型黄酒陈酿后期5-HMF含量的增长速度减慢的原因。

综上所述，甜型黄酒中还原糖、氨基态氮含量、总酸含量及pH值是影响甜型黄酒中5-HMF生成的因素，其中必需的因素是还原糖和酸性条件。在甜型黄酒中较高的葡萄糖含量和黄酒本身酸性体系是5-HMF含量较高的主要原因，加之长时间的储存更使甜型黄酒中5-HMF不断积累。当5-HMF摄入量过高时，会对人体健康有风险，所以一方面需要消费者控制自身饮用量，另一方面可以采取一些调控措施[17,19-20]来适当控制其含量。

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