色素能赋予食品赏心悦目的色泽，增强人们的消费欲望，因此在食品工业中扮演着重要的角色[1]。目前在生产中使用的色素分为天然色素与人工合成色素。合成色素价格低廉，稳定性较好，是目前主要应用的色素，但其多为无任何营养价值的焦油，且部分存在健康隐患，随着合成色素的使用泛滥，引发的健康问题也随之增多[2-3]，人们对合成色素的使用开始表现出担忧[4]。
天然色素是从各种生物体中获得的，包括动植物、微生物和矿物色素[1]。与合成色素相比，天然色素具有如下优点：绝大多数天然色素安全性高、无毒副作用；许多天然色素如类胡萝卜素等具有营养价值与保健功能[5]；一些天然色素还具有优秀的药理活性，如姜黄素具有抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗利尿等疗效[6]；天然色素本身就是来源于天然物质的颜色，比人工合成色素色调更加自然[7]。欧盟目前批准使用的天然食用色素大部分是从开花植物和昆虫中获取的，因此天然色素的生产取决于原材料的季节性供应，可能导致获取的原料各个批次发生变化[8]；多数天然色素提取困难、稳定性不够、生产量小、成本高昂，制约了天然色素的快速发展[9]。因此开发安全稳定、低价高效的天然色素成为研究的热点。
微生物作为天然色素来源具有其得天独厚的优势：无季节性、培养周期短、生产稳定、不受外部环境制约等[9]，因而适合规模化生产应用。如红曲色素使用广泛，红曲色素发酵产品红曲米早在唐朝即有使用，它用于民间医药、食品着色剂、腐乳等已有千年历史。红曲色素及其制品具有降血脂、降血压、抗突变、防腐保鲜、抗肿瘤、抗人免疫缺陷病毒、抗氧化、抗炎等一系列优秀生理活性，且相比合成色素安全性更高，市场需求巨大[10]。类胡萝卜素是一类重要的天然色素，普遍存在于动物、植物、藻类、真菌等组织中，其中使用三孢布拉霉生产类胡萝卜素产量大，且无有毒有害的副产物，是用于工业化生产类胡萝卜素的主要菌株。三孢布拉霉发酵生产的类胡萝卜素已获得欧盟、美国食品药品监督管理局的批准[11]。踝节菌属(Talaromyces)丝状真菌被证实能产生化学结构与红曲色素类似的聚酮类色素，且不产生任何已知的真菌毒素[12]，是非常有潜力的天然色素生产菌。
天然微生物色素能否成功应用在很大程度上取决于其是否具有安全稳定、着色能力强、优秀的药理活性等特点[13]，因此对天然微生物色素相关性质的测定至关重要。本研究中我们对踝节菌属丝状真菌Talaromyces atroroseus次级代谢红色素的稳定性与抗氧化性进行了评价，为其应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
Talaromyces atroroseus菌株，实验室纯化所得；土豆，购于当地超市。
蔗糖、二氯甲烷、正丁醇、乙醇、FeCl3、CuCl2、FeCl2、PbCl2、AlCl3、MnCl2、MgCl2、ZnCl2、CaCl2、30%(体积分数) H2O2、Na2SO3、FeSO4、铁氰化钾、三氯乙酸、水杨酸、K2HPO4、KH2PO4、浓HCl、NaOH、NaCl、葡萄糖、苹果酸、苯甲酸、柠檬酸等，国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，阿拉丁试剂有限公司。
旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；UV-1780紫外-可见光分光光度计，日本岛津仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 色素生产与提取
将足量的Talaromyces atroroseus孢子接种于已灭菌的马铃薯葡萄糖肉汤培养基(potato dextrose Broth medium，PDB)中，25 ℃静置培养，经过10 d的生产周期后，使用200目纱布多次过滤除去菌丝与孢子，得到红色素培养液。使用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇对红色素培养液进行分步完全萃取后旋蒸除去溶剂得到色素粉末。平均每1 L培养液得到二氯甲烷相色素60 mg(黄色)、乙酸乙酯相色素130 mg(红色)、正丁醇相色素1 130 mg(红色)。取正丁醇相色素(主要部分)进行稳定性测定以及抗氧化评价。
1.2.2 光吸收特性与色价的确定
光吸收特性测定：取适量色素固体粉末溶于水，将其稀释至分光光度计的可测定范围进行紫外-可见光全波长扫描。
色价的确定参考GB 1886.34—2015测定辣椒红色素色价的方法并稍做修改[14]。准确称取0.1 g色素固体粉末，使用超纯水定容至100 mL，稀释至可测定范围后，使用1 cm比色皿在510 nm下测定吸光值，超纯水作为参比。平行测定3次。使用公式(1)计算色价：
(1)
式中：A，510 nm实测吸光值；f，样品总稀释倍数；m，样品称取质量，g。
1.2.3 色素的稳定性
1.2.3.1 色素的光稳定性
可见光稳定性测定：将2 mg/mL的色素稀释3倍后不避光放置，每隔一段时间测定其OD510nm，连续测定5 d。每组平行测定3次。
紫外光稳定性测定：将2 mg/mL的色素稀释3倍后在254 nm紫外灯光下持续照射2.5 h，每隔0.5 h测定其OD510nm。每组平行测定3次。
1.2.3.2 色素的热稳定性
将2 mg/mL的色素用蒸馏水稀释3倍后分别在30、40、50、60、70 ℃条件下水浴2 h，室温下冷却后测定其OD510nm。每组平行测定3次。
1.2.3.3 色素的酸碱稳定性
配制一组pH值分别为2、4、6、8、10、12的溶液，分别取6 mL不同pH值的溶液与1 mL 2 mg/mL的色素溶液混合，室温下静置30 min后测定其OD510 nm，每组平行测定3次。
1.2.3.4 常见氧化剂、还原剂对色素的影响
将30% H2O2稀释成一组0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的溶液，将Na2SO3配制成一组2、4、6、8、10 mmol/L的溶液，分别取不同浓度的H2O2、Na2SO3溶液4 mL与2 mL 2 mg/mL的色素溶液混合，室温下静置30 min后测定OD510 nm,每组平行测定3次。
1.2.3.5 常见金属离子对色素的影响
配制一组不同浓度梯度的含Ca2+、 Mg2+、 Zn2+、Mn2+、Pb2+、Fe2+、Cu2+、Al3+、Fe3+的氯化物溶液，浓度梯度设置为2、4、6、8、10 mmol/L。分别取不同浓度的金属离子氯化物溶液4 mL与2 mL 2 mg/mL 的色素溶液均匀混合后在室温下静置30 min，而后测定OD510 nm，空白组使用蒸馏水代替金属离子盐溶液，使用蒸馏水为参比，每组平行测定3次。
1.2.3.6 常见的食品添加物对色素的影响
将苯甲酸、柠檬酸、苹果酸分别配制成质量体积浓度为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L的水溶液；葡萄糖配制成40、80、120、160、200 g/L的水溶液；NaCl配制成8、16、24、32、40 g/L的溶液。分别取上述不同浓度的溶液4 mL与2 mg/mL的色素水溶液混合，室温下静置30 min后测定OD510 nm，每组平行测定3次。
1.2.4 色素的抗氧化评价
1.2.4.1 羟基自由基清除率测定
羟基自由基清除率的测定采用水杨酸法[15]，利用H2O2与Fe2+混合产生羟自由基，在体系中加入水杨酸捕捉自由基产生有色物质，该物质在510 nm有最大吸收。使用2 mg/mL的BHT作为阳性对照，蒸馏水作为参比，每组平行测定3次，按照公式(2)计算清除率：
羟自由基清除率
(2)
式中：A0，空白组吸光值；Ax，样品吸光值；A，反应后体系吸光值。
1.2.4.2 DPPH清除率测定
DPPH清除率的测定参考PANDIT等[16]的方法并稍作修改。
配制2×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液，分别在517 nm测定DPPH溶液与不同浓度色素溶液的本底吸收值A0与Ax，取4 mL不同浓度的色素与其等体积混合，37 ℃水浴反应30 min后测定在517 nm的吸光值A，蒸馏水做参比，以2 mg/mL的二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)作为阳性对照。每组平行测定3次。使用公式(3)计算DPPH清除率:
DPPH清除率
(3)
式中：A0，空白组吸光值；Ax，样品吸光值；A，反应后体系吸光值。
1.2.4.3 总还原能力测定
总还原能力测定参考任云等的方法[17]。取不同浓度的色素水溶液2.5 mL，依次加入2.5 mL磷酸缓冲液、1%(质量分数)铁氰化钾，50 ℃水浴20 min后立即加入10%(体积分数)三氯乙酸2.5 mL终止反应，随后3 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL后加入4 mL 蒸馏水、1 mL 1 mg/mL 的FeCl3溶液，室温反应10 min后在700 nm处测定吸光值，以生成的普鲁士蓝吸光值表征样品的总还原能力，以2 mg/mL的BHT作为阳性对照。每组平行测定3次。
1.3 数据处理与分析
使用Microsoft Excel作图， SPSS Statistics 22.0进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 光吸收特性与色价的确定
紫外-可见光全波长扫描(200～800 nm)结果显示红色素在425、510 nm处存在2处特征峰，在510 nm处有最大吸光值，因此选用510 nm为该色素测定波长(图1)。经测定与计算，该菌株使用此方法发酵得到的红色素色价为363.2 U/g。
图1 红色素紫外-可见光谱
Fig.1 The UV-Vis spectrum of red pigments produced by T. atroroseus
2.2 色素的稳定性
2.2.1 色素的光稳定性
色素在自然光照一段时间后其吸光值降低，但4 d后的色素残留率仍有83.38%，且第5天吸光值降低相比第4天并不显著(P>0.05)，表明该色素对可见光具有一定的耐受性。而在紫外光照处理的条件下，其吸光值迅速衰减，经历2.5 h的254 nm的紫外光照射后，其色素残留率仅为58.39%(图2)。254 nm的紫外光由于其极强的能量可能对色素结构造成了一定程度的破坏而使得色素吸光值下降。
A-红色素的自然光稳定性;B-红色素的紫外光稳定性
图2 红色素在自然光和紫外光下的稳定性
Fig.2 Stabilities of red pigments under natural light and UV light
注：图中不同小写字母表示差异显著(下同)
2.2.2 色素的热稳定性
实验数据表明，对色素进行2 h的热处理时，温度在50 ℃以下时色素基本稳定(50 ℃残留率94.91%)，色素表现出一定的热稳定性；当处理温度为70 ℃时，色素色价下降明显(P<0.05)，70 ℃处理2 h后其色素残留率仅为55.99%(图3)。持续高温环境会使色素漂白，应使处理温度保持在50 ℃以下。
图3 温度对红色素色价的影响
Fig.3 The effects of different temperatures on the color value of red pigment
2.2.3 色素的酸碱稳定性
酸性或碱性环境影响下的色素与中性环境相比，其色价变化均不显著(P<0.05)，表明该色素的酸碱稳定性非常优秀。相比酸性环境，碱性条件下的色素色价有明显提高(P<0.05)，表明碱性环境对色素存在增色作用(图4)。
图4 pH值对红色素色价的影响
Fig.4 The effects of different pH value on the color value of red pigment
2.2.4 常见氧化剂、还原剂对色素的影响
结果表明，氧化剂H2O2对色素的影响不大，而随着还原剂Na2SO3的浓度逐渐增大，色素的色价提高(图5)，表现出浓度效应(P<0.05)。说明该色素在氧化剂H2O2的作用下表现稳定，还原剂Na2SO3对该色素存在增色效应。
2.2.5 常见金属离子对色素的影响
本次测定的9种常见金属离子中，Fe3+、Cu2+、Al3+对色素表现出较明显的褪色效应(残留率<95%)，其中Fe3+的褪色效应最为显著(P<0.05)，在10 mmol/L 的Fe3+影响下，色素残留率仅为80.67%；Mg2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+对色素产生的作用较不明显(残留率>95%)，色素表现稳定；Pb2+、Fe2+则对色素表现出增色效应，在10 mmol/L的Pb2+与Fe2+的影响下，色素残留率分别为105.69%和105.35%(图6)。Fe3+、Cu2+、Al3+可能由于其较强的络合能力而对色素产生不良影响；Fe2+则是由于其还原作用对色素产生增色效应，这与还原剂Na2SO3所测得结果相互印证。
A-H2O2对红色素色价的影响;B-Na2SO3对红色素色价的影响
图5 氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3对红色素色价的影响
Fig.5 Effects of oxidative agent hydrogen peroxide and reducing agent sodium sulfate on the color value of red pigment
图6 常见金属离子对红色素色价的影响
Fig.6 The effects of common metal ions on the color value of red pigment
2.2.6 常见食品添加物对色素的影响
实验结果表明，在常用的食品调味剂、添加剂的影响下，色素表现出足够的稳定性。常用浓度的NaCl与葡萄糖的添加对色素并未产生不良影响(残留率>98%)。柠檬酸、苯甲酸、苹果酸等酸性食品添加剂的加入使色素在特征波长的吸光值略有降低，但总体表现稳定(图7)，这一结果与色素pH稳定性检测结果相符，可能是由于食品添加剂的酸效应使其吸光值降低。
A-NaCl对红色素的影响;B-葡萄糖对红色素的影响;C-苯甲酸、柠檬酸、苹果酸对红色素的影响
图7 常见食品添加物对红色素色价的影响.
Fig.7 The effect of common food additives on the color value of red pigments
2.3 色素的抗氧化评价
随着色素浓度提高，其抗氧化能力显著增强(P<0.05)，质量浓度为2 mg/mL 的色素，其总还原能力为同浓度BHT的70.76%，DPPH清除率达到71.32%，是同浓度BHT清除能力的78.69%，羟自由基清除率达81.59%，是同浓度BHT的82.73%(图8)。以上测定结果表明,该红色素具有较强的抗氧化特性。
A-红色素总还原能力;B- 红色素DPPH清除率;C-红色素羟自由基清除率
图8 红色素的抗氧化活性评价
Fig.8 Antioxidant properties of red pigment produced by T. atroroseus
3 讨论与结论
天然色素的工业化应用取决于很多因素，如色素的色价、溶解性、稳定性、药理活性、产量与生产成本等[18]。该丝状真菌Talaromyces atroroseus次级代谢产生红色素，使用本研究的方法得到的红色素色价为363.2 U/g，有较鲜艳的色泽。作为微生物来源的天然色素,其获得条件简单，只需要1株菌即可源源不断发酵生产红色素。本研究使用PDB培养基液态静置发酵的方法，可使其红色素产量达到1 g/L以上，在产量方面有着一定的优势且还可能具有进一步优化的潜力。该真菌所生产色素不含已知真菌毒素[12]，主要部分为水溶性高极性色素，相比红曲色素20%～30%的水溶性色素比例[19]，其在水中的溶解性更好，不需使用有机溶剂增溶，因而在食品、化妆品等以水为主要溶剂的生产中有广阔的应用前景，具有较大的实际应用价值。
菌株T. atroroseus产生的红色素与红曲色素结构类似，皆为聚酮类化合物[20-21]，而红曲色素在其可见光与紫外光稳定性方面表现不佳[22-23]，在接近中性或碱性条件下更稳定[4]，其中水溶性红色素在pH值影响下的表现十分稳定[24]，但不能承受热处理时的高温[25]。Talaromyces atroroseus 红色素在可见光下较稳定，对紫外光较为敏感，其色价受pH值影响不大，在50 ℃下稳定，70 ℃下色价降低明显，这些性质与红曲色素的稳定性比较相似。常见的金属离子中，仅Fe3+、Cu2+、Al3+这几种易发生络合效应的离子能使色素色价降低，其他金属离子则对红色素不产生不良影响。T. atroroseus 红色素对氧化剂表现出耐受性，在H2O2的影响下表现稳定，还原剂Na2SO3与还原性离子Fe2+则对色素产生一定的增色效应。色素对氧化剂表现出良好的稳定性，与红曲液态发酵色素的结果一致[26]，这应归功于红色素的生色团与助色团的共轭体系带来的抗氧化性；而还原性物质对色素产生增色效应的机制尚不明确，但有类似报道表明还原性物质抗坏血酸、类胡萝卜素、槲皮素对红曲色素存在护色作用，能提升红曲色素的光稳定性[27]。常用的食品调味剂(NaCl、葡萄糖)等对色素无不良影响；苯甲酸、柠檬酸、苹果酸等食品添加剂由于其酸性使色素发生微弱褪色，但色素残留率均>95%，总体表现稳定。
红色素还具有较强的抗氧化性，实验结果质量表明质量浓度为2 mg/mL的红色素其DPPH清除率达71.32%，是同质量浓度BHT的82.73%；羟自由基清除率达81.59%，是同质量浓度BHT的82.73%；总还原力是同质量浓度BHT的70.76%，这一结果与红曲色素的抗氧化性在一定程度上吻合[28]。T. atroroseus 发酵生产的红色素物质组成复杂，其中不乏具有强抗氧化活性的物质，有待进一步深入研究。
使用丝状真菌T. atroroseus静置发酵生产红色素，条件简单并可大量制备。该红色素具有较强的抗氧化性能并对可见光有良好的耐受性；温度低于50 ℃时表现出稳定性；金属离子除Fe3+对色素褪色效应较明显外，在其他金属离子的影响下残留率均高于90%；在常见的食品添加物或氧化还原剂的影响下表现稳定且该色素对酸碱性环境耐受能力较强；然而该色素在高温与紫外光照条件下不稳定。综上所述，该真菌红色素有工业化生产的潜力与应用前景，但在生产与储存过程中应避免高温与紫外线处理。
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