陶融型大曲培养贮存过程生化指标变化规律及相关性研究

陈蒙恩1*,韩素娜1,侯建光1,李建民1,陈伟平1,李华1,邓杰2,胡晓龙3

1(河南仰韶酒业有限公司,河南 三门峡,472400) 2(四川轻化工大学 生物工程学院,四川 自贡,643000) 3(郑州轻工业大学 食品与生物工程学院,河南 郑州,450002)

摘 要 以陶融型大曲为研究对象,对大曲在培养和贮存过程中生化指标的变化规律及各指标之间的相关性进行研究。结果表明:发酵初期,酵母、霉菌、细菌大量繁殖,发酵力、糖化力、蛋白酶活力、酸度等指标急剧上升;发酵中期,霉菌、酵母数量速降,一些耐热的芽孢杆菌占据优势;发酵末期,大曲微生物中细菌占主导地位。贮存至120 d时,大曲糖化力保持在700 U/g以上,液化力0.8 U/g左右,发酵力0.8 U/g左右,蛋白酶活力在40 U/g以上,酯化力在20 U/g以上,细菌数量在1.4×107 CFU/g左右,酵母数量在1.9×105 CFU/g左右,霉菌数量在2.0×105 CFU/g左右,芽孢数量在5.6×107 CFU/g左右。相关性分析表明,酸度与细菌数量、糖化力与霉菌数量、发酵力与酵母数量等指标之间呈显著正相关性,水分含量与时间、淀粉含量与时间、水分含量与氨态氮等指标之间呈显著负相关性。该研究为大曲微生物群落及其多酶体系代谢研究提供了数据参考,为改良制曲工艺及指导陶融型白酒生产提供了理论依据。

关键词 陶融型大曲;生化指标;变化规律;相关性

大曲是一种富含微生物菌群、菌系及复合曲香的微生态制品,具有糖化、发酵、生香等功能,是中国曲酒的主要糖化发酵剂和生香剂,其质量优劣会对白酒酿造过程中的出酒率、酒质、风格等造成直接影响[1-3]。优质大曲曲香味突出,功能微生物数量能达到曲酒工艺生产所需的数量级,且具有适宜的理化指标。目前,对大曲的研究多趋向于某些特定指标,如感官指标、理化指标以及微生物指标等[4],而对微生物与相关指标间的相关性以及如何在制曲工艺中全面提升大曲品质的研究较少。

陶融型大曲是在仰韶地区自然环境、生产原料、酿造工艺等因素的前提下,以小麦、大麦、豌豆为原料,经自然接种、陶屋培养发酵而成的陶融型白酒专用大曲[5]。大曲中所富含的细菌、霉菌、酵母菌等是酿造陶融型白酒不可缺少的微生物资源,这些微生物能够利用原料中的淀粉、蛋白质等营养物质进行繁殖代谢,分泌陶融型白酒酿造过程中所需的糖化酶、淀粉酶等各种酶系。酿酒原料中的淀粉等大分子物质在生物酶和特定条件下,经过一系列复杂的生化反应而产生种类众多的芳香类物质,这些芳香类物质对大曲酒特有香味成分起着重要贡献作用[6-7]。本研究以陶融型白酒酿造专用大曲为样本,对不同阶段的大曲微生物指标及理化指标进行系统分析[8-9],对大曲不同生化指标间的相关性进行研究,为制定陶融型大曲的质量标准,改良制曲工艺,提高优质曲率提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

1.1.1 样品

样品取自河南仰韶酒业有限公司制曲车间。

1.1.2 主要试剂

HCl、甲醛,洛阳昊华化学试剂有限公司;KH2PO4,成都市科龙化工试剂厂;酒石酸钾钠,天津市光复科技发展有限公司;NaOH、MgSO4·7H2O、Na2HPO4、无水乙醇、葡萄糖,天津市凯通化学试剂有限公司。以上各试剂均为分析纯。干酪素(化学纯),国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基的配制

细菌培养基(g/L):葡萄糖15,胰蛋白胨5,牛肉膏5,NaCl 5,纳他霉素1,琼脂粉12,pH 7.0;酵母培养基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,豆芽200,氨苄青霉素1,琼脂粉12,pH 6.0;霉菌培养基(g/L):去皮马铃薯200,葡萄糖20,蛋白胨0.5,KH2PO4 5,MgSO4·7H2O 3,VB1 0.1,琼脂粉12,氨苄青霉素1,pH 7.0。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-VS2型超净工作台,无锡易纯净化设备有限公司;DHP 9272型电热恒温培养箱、MJ-Ⅱ型霉菌培养箱、DHG-9123A型鼓风干燥箱,上海一恒科技有限公司;HYG-B型全温摇瓶柜,苏州培英实验设备有限公司;LPZM-80KCS-Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂; HH-4型数显恒温水浴锅,金坛市晶玻实验仪器厂;UV-1800型紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 取样方法

选取河南仰韶酒业有限公司夏季同时入房的5房曲,安曲后在第1、3、5、7、9、15、30天取样,大曲培养时间为30 d,将成品大曲放置于通风、干燥、常温环境中贮存,同时对贮存期60、90、120 d的5房曲进行跟踪取样。每房大曲所选样品事先用红布条进行标记,在大曲翻曲、并房、打拢、贮存阶段仍将其放入指定位置,以便样品能代表整房曲;每房曲均采用四点中心法进行取样,样品粉碎后过40目筛,四分法浓缩至150 g,装于无菌袋内,4 ℃贮存备用。大曲培养过程和贮存过程温度的采集:将温度计事先插入成型后大曲的曲心处,采用四点中心法测量大曲温度。

1.3.2 水分、酸度测定

水分、酸度的测定方法参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[10-11]。水分含量及酸度分别按公式(1)、(2)计算:

(1)

式中:X,含水质量分数,g/100 g;m1,烘干前称量瓶加试样的质量,g;m2,烘干后称量瓶加试样的质量,g;m,称量瓶的质量,g。

(2)

式中:Y,酸度,mmol/10 g;c,NaOH标准溶液的浓度,mo1/L;V1,滴定试样时,消耗NaOH标准溶液的体积,mL;V0,空白试验时,消耗NaOH标准溶液的体积,mL;200,试样稀释体积,mL;20,取样液进行滴定的体积,mL。

1.3.3 氨态氮、还原糖、淀粉含量测定

通过NaOH滴定法对氨态氮含量进行测定[12-13];通过3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法对大曲中还原糖含量进行测定[14-15];采用体积比1∶4的 HCl 进行加热回流水解,用斐林试剂测定生成的糖[16]

1.3.4 糖化力、液化力测定

采用DNS法对大曲糖化力进行测定,糖化酶活力定义:1 g大曲在35 ℃、pH 4.6条件下,1 h水解淀粉生成1 mg葡萄糖为1个糖化力单位,以U/g表示[16]。参照QB/T 4257—2011对大曲液化力进行测定,液化酶活力定义:1 g大曲在35 ℃、pH 4.6条件下1 h能液化淀粉1g为1个液化力单位,以U/g表示[17-18]

1.3.5 发酵力、酯化力测定

发酵力以1 g曲样在25 ℃糖化液中发酵48 h失去的质量(U/g)计算[19];酯化力以1 g绝干曲在30 ℃条件下反应72 h催化己酸和乙醇合成己酸乙酯质量计算(U/g)[14]

1.3.6 蛋白酶活力测定

蛋白酶酶活力测定参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》[20]。酶活定义:1 g大曲在40 ℃,pH 3.0条件下,每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个酸性蛋白酶活力单位,以U/g表示;1 g大曲在40 ℃,pH 7.2条件下,每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个中性蛋白酶活力单位,以U/g表示。

1.3.7 大曲微生物含量检测

采用传统平板计数法对不同大曲样品的细菌、霉菌、酵母、芽孢的含量进行测定。称粉碎后的样品1 g溶于99 mL无菌生理盐水中,摇床振荡30 min使曲粉充分振荡均匀。采用梯度稀释法,将预培养样品分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,吸取10-5梯度样品200 μL涂布于霉菌培养基,30 ℃恒温培养2~4 d后计数[25];分别吸取10-7梯度样品200 μL涂布于酵母和细菌培养基,酵母培养基置于28 ℃恒温培养2~4 d后计数[24-25],细菌培养基置于37 ℃恒温培养1~2 d后计数[21-22];芽孢杆菌要先在80 ℃水浴30 min,对非芽孢杆菌进行预处理,再选择牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37 ℃下培养1~2 d后计数[23]

1.3.8 理化指标与微生物指标相关性分析[9,26]

数据采用SPSS 19.0软件和Origin 9.0进行统计分析、绘图和相关性分析,显著性水平设定在5%。

2 结果与分析

2.1 理化指标分析结果

对大曲培养及贮存过程中温度、水分等理化指标进行测定,结果见图1~图2。随着安曲时间的增长,氨态氮、酯化力呈上升趋势,且随着时间的增长其上升幅度逐渐减小;糖化力、发酵力、蛋白酶活力呈先增后降趋势,最后又略微上升直至恒定状态;水分、淀粉含量随时间的增长呈递减趋势,且递减幅度逐渐减小;酸度呈先升后降趋势。这主要是因为随着发酵时间的增长,微生物数量快速增长,致使氨态氮等指标呈上升趋势,随着微生物繁殖代谢的持续进行,大曲温度急剧上升,低温微生物大量死亡,糖化力等指标快速下降;随后一些耐热芽孢杆菌大量繁殖,造成酸度等指标的波动性变化。

图1 发酵时间与温度的关系

Fig.1 Relationship between fermentation time and temperature

由图2可知,大曲培养结束出房时(30 d),酸度在0.3~1.5 mmol/10 g,水分含量<14%,贮存至120 d时糖化力仍在700 U/g以上,满足我国轻工行业标准QB/T 4259—2011对优质大曲理化指标的要求。大曲的糖化力与温度变化成一定的负相关性,在曲温较低时酶活力较高,说明大曲中淀粉酶主要靠低温微生物产生,这与传统研究结果相一致。蛋白酶活力呈先增后降再增趋势,这与大曲培养过程中品温变化有关。温度过高使已形成的蛋白酶失活,在后期品温降低过程中,部分产蛋白酶的微生物再次复活,致使最终蛋白酶活力达到一定高度。在120 d时,大曲蛋白酶活力仍保持在35 U/g左右,满足优质大曲标准。蛋白酶能通过美拉德反应,将大分子物质转换为曲香形成的前体物质[27],因此,蛋白酶活力的高低往往决定了大曲风味物质的含量。

图2 时间与理化指标的关系

Fig.2 Relationship between time and physical and chemical indices

2.2 大曲培养及贮存过程微生物指标变化

采用平板分离法对大曲微生物进行研究,结果见图3和图4。入房前3 d,细菌、霉菌、酵母、芽孢数量都急剧增加,随着发酵时间增长、曲温升高,低温微生物数量下降,曲温升至50 ℃左右时,大部分真菌已死亡,耐高温芽孢杆菌大量繁殖。细菌数量在5 d时处于最大值,可能此时品温最适合高温细菌生长;5 d后细菌数量开始下降,可能是由于温度过高,一些芽孢杆菌开始进入芽孢休眠状态。大曲培养过程中酵母菌数量一直变化不大,可能是由于大曲入房温度过高,且培养过程中升温过快,超过了酵母菌生长繁殖的最佳温度所致。成品大曲入库后,由于大曲水分较低,无法满足微生物生长代谢对水分的需求,致使各种微生物含量基本处于恒定状态。从整个大曲微生物区系分析,在培菌期(0~10 d),大曲微生物以细菌和霉菌为主;培菌期后以耐热芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌和芽孢为主;成品大曲中,细菌、霉菌、芽孢含量相差不大,酵母含量较低。

图3和图4结果表明,在大曲培养初期(0~7d)酵母含量略有上升,之后迅速下降至培养初期数量,120 d时其含量在1.9×105 CFU/g左右。大曲中的有益霉菌,如曲霉、根霉,在发酵过程中产生多种复合酶类,在白酒酿造过程中主要起糖化水解作用。霉菌数量在培菌后期虽然有下降,但在大曲中仍占一定比例,在贮存至120 d时其含量在1.6×105 CFU/g左右,这也是成品大曲糖化力最终保持在700 U/g以上的原因。细菌是白酒酿造微生物的重要组成部分,芽孢杆菌在一定程度上对白酒的风味和质量起关键作用。大曲在培养至第10天时,芽孢数量有所下降,可能是因为第10天翻曲,曲房及大曲品温下降,致使部分芽孢从休眠中复苏所致。在大曲贮存至120 d时,细菌含量保持在1.4×107 CFU/g左右,芽孢含量在5.6×107 CFU/g左右,芽孢含量仍处于较高数量级,可满足生产优质白酒所需。

图3 时间与微生物指标的关系

Fig.3 Relationship between time and microbial counts

图4 大曲培养及贮存过程不同类型微生物数量占比

Fig.4 Propotion of different microorganisms duringDaqu cultivation and storage

2.3 相关性分析

大曲发酵和贮存过程中,其生化指标之间存在一定的相关性。如表1所示,酸度与细菌数量、糖化力与霉菌数量、发酵力与酵母数量、蛋白酶活力与酯化力、还原糖与水分含量、水分含量与淀粉含量等指标之间呈显著正相关性,水分含量与时间、淀粉含量与时间、水分含量与氨态氮、液化力与还原糖、氨态氮与淀粉含量等指标之间呈显著负相关性,这与杨勇等[9]对中高温大曲指标的研究结果一致。表1结果表明,随着发酵的进行,大曲中淀粉含量逐渐被消耗,水分含量逐渐降低;发酵初期糖化力和发酵力呈快速上升趋势,这与霉菌和酵母数量的变化呈一致性,说明此时的曲温处在霉菌及酵母菌最佳的生长范围内;随着曲温的进一步升高,霉菌和酵母数量的增殖受到影响,致使糖化力和发酵力总体呈下降趋势,说明发酵力主要由酵母提供,糖化力主要霉菌提供,这与王世宽等[28]的研究结果一致;酯化力和酸性蛋白酶活力显著正相关,说明大曲中相关微生物新陈代谢所产生的有机酸促进了蛋白酶的合成[29],同时,有机酸的产生也为后续的酯化反应提供了前体物质。

表1 大曲生化指标的相关性

Table 1 Correlation between biochemical indices of Daqu

注:**:在0.01水平(双侧)上显著相关;*:在0.05水平(双侧)上显著相关。

时间水分含量酸度糖化力液化力发酵力酯化力淀粉含量还原糖氨态氮蛋白酶活力细菌酵母霉菌芽孢时间1水分含量-0.816**1酸度-0.4180.2231糖化力-0.610.3460.551液化力0.605*-0.5730.2530.1851发酵力-0.5040.722*0.2650.531-0.2841酯化力-0.3080.1130.5430.0890.3560.3591淀粉含量-0.785**0.989**0.1560.287-0.5850.627*0.0181还原糖-0.5460.741**-0.4550.206-0.788**0.477-0.5100.764**1氨态氮0.483-0.786**0.630-0.3800.579-0.671*0.030-0.780**-0.657*1蛋白酶活力-0.3690.710-0.245-0.0180.2850.1490.942**-0.006-0.5490.1211细菌-0.4780.4800.812**0.4300.2930.603*0.823**0.406-0.134-0.2900.710*1酵母-0.3710.596-0.1440.288-0.5070.852**-0.0490.5310.666*-0.635*-0.2480.2081霉菌-0.4330.5270.3040.801**0.0090.697*0.3350.4410.274-0.4830.2500.642*0.4141芽孢0.077-0.3940.599-0.1310.509-0.5800.749**-0.470-0.703*0.4250.706*0.384-0.3850.0861

3 结论

本文以陶融型大曲为研究对象,对其培养及贮存过程中生化指标变化规律及相关性进行深入分析,结果表明,陶融型大曲生化指标在其培养及贮存过程中呈现一定的规律性,且不同指标之间具有一定的相关性。在发酵初期(0~7 d),酵母、霉菌、细菌大量繁殖,发酵力、糖化力、蛋白酶活力、酸度等指标急剧上升,水分、淀粉含量则快速下降;发酵中期(8~15 d),霉菌、酵母数量速降,一些耐热的芽孢杆菌占据优势,糖化力、发酵力等指标急速下降,酸度持续上升,且酸度、蛋白酶活力在发酵中期达到峰值;发酵末期(16~30 d),大曲中微生物以细菌、芽孢杆菌占主导地位,酸度、淀粉含量、酯化力、蛋白酶活力等指标下降至稳定状态。贮存至120 d时,大曲糖化力保持在700 U/g以上,液化力在0.8 U/g左右,发酵力在0.8 U/g左右,蛋白酶活力在40 U/g以上,酯化力在20 U/g以上,细菌数量在1.4×107 CFU/g左右,酵母数量在1.9×105 CFU/g左右,霉菌数量在1.6×105 CFU/g左右,芽孢数量在5.6×107 CFU/g左右。相关性分析结果表明,酸度与细菌数量、糖化力与霉菌数量、发酵力与酵母数量、蛋白酶活力与酯化力、还原糖与水分含量、水分含量与淀粉含量等指标之间呈显著正相关性,水分含量与时间、淀粉含量与时间、水分含量与氨态氮、液化力与还原糖、氨态氮与淀粉含量等指标之间呈显著负相关性。

陶融型白酒在生产中采用陈曲酿酒,大曲贮存时间为3~6个月。随着贮存期的增加,虽然大曲的一些生化指标会有所下降,但贮存期的延长,却使得大曲曲香更加浓郁,酿出的酒质也更加柔和。本文虽然对陶融型大曲相关指标进行了多方位多因素研究,但大曲微生物群落及其多酶体系的演变机理尚不清楚,后续将通过现代分子生物学与代谢组学相结合,对陶融型大曲生化功能的形成进行解析,为改良制曲工艺及指导后期酿酒提供理论参考。

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The change and correlational study of biochemical indices of Tao Rong-Daqu during the process of production and storage

CHEN Mengen1*, HAN Suna1, HOU Jianguang1, LI Jianmin1,CHEN Weiping1, LI Hua1, DENG Jie2, HU Xiaolong3

1(Henan Yangshao Distillery Co. Ltd., Sanmenxia 472400, China) 2(School of Bio-engineering, Sichuan Light Chemical University, Zigong 643000, China) 3(School of Food and Bio-engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

ABSTRACT Taking Tao Rong-type Daqu as the research object, the change and correlational study of biochemical factors of Tao Rong-Daqu during the production and storage were studied. The results showed that yeast, mold, and bacteria multiplied in large numbers. And the fermentation power, saccharification power, protease activity, acidity, and other indicators rose sharply during the initial stage of fermentation. In the middle stage of fermentation, the number of molds and yeasts decreased significantly, while some heat-resistant Bacillus species were predominant. At the end of fermentation, bacteria were predominated in Daqu. When stored for 120 d, the saccharification power, liquefaction power, fermentation power, protease activity and esterification power were up to 700, 0.8, 0.8, 40 and 20 U/g respectively. And the number of bacteria, yeasts, molds and spores were up to 1.4×107 CFU/g, 1.9×105 CFU/g, 2.0×105 CFU/g, 5.6×107 CFU/g. The correlational analysis showed that there was a positive correlation between acidity and the number of bacteria. And the same tendency was also been showed between saccharification power and mold count, fermentation power and yeast count respectively. Meanwhile, there were negative correlations between water content and time, starch content and time, water content and ammonia nitrogen. This work offered reference data for future research on microbial flora and their multi-enzyme system in Daqu. It also helps to improve the process of the production of Tao Rong-type Daqu and Tao Rong-type Baijiu.

Key words Tao Rong-type Daqu; biochemical indices; changing law; correlation

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023213

引用格式:陈蒙恩,韩素娜,侯建光,等.陶融型大曲培养贮存过程生化指标变化规律及相关性研究[J].食品与发酵工业,2020,46(13):146-151.CHEN Mengen, HAN Suna, HOU Jianguang, et al. The change and correlational study of biochemical indices of Tao Rong-Daqu during the process of production and storage[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(13):146-151.

第一作者:硕士,工程师(本文通讯作者,E-mail:609772289@qq.com)

基金项目:国家自然科学基金委项目(31801535);河南省重大科技专项(181100211400);酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开放基金项目(NJ2019-04)

收稿日期:2019-12-27,改回日期:2020-03-06