二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基的能力；其IC50分别为0.10、0.24和0.50 mg/mL，且还原力强于Vc。在保持鲜切苹果感官价值及品质方面，Vc@SeNPs效果优于Vc。其中10 g/L Vc@SeNPs对延缓鲜切苹果褐变的效果最佳，50 g/L Vc@SeNPs能有效防止鲜切苹果多酚氧化，降低水分散失，而蒸馏水组褐变迅速，水分大量散失，多酚严重氧化。因此，Vc@SeNPs有望成为新型果蔬保鲜剂。摘 要 为开发既能补充人体微量元素硒，又能保持鲜切苹果优良品质的果蔬保鲜剂，以抗坏血酸(Vc)还原亚硒酸钠制得Vc修饰纳米硒(Vc modified nano selenium, Vc@SeNPs)，采用紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、透射电镜对其进行表征，通过体外抗氧化指标，及鲜切苹果褐变、失重率、平均散失率和总酚含量的测定，初步评价Vc@SeNPs对鲜切苹果品质的影响。结果表明，Vc@SeNPs分散均匀，呈球形形貌，平均粒径为64.80 nm；具有较好的清除羟自由基(·OH)，超氧阴离子自由基二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基的能力；其IC50分别为0.10、0.24和0.50 mg/mL，且还原力强于Vc。在保持鲜切苹果感官价值及品质方面，Vc@SeNPs效果优于Vc。其中10 g/L Vc@SeNPs对延缓鲜切苹果褐变的效果最佳，50 g/L Vc@SeNPs能有效防止鲜切苹果多酚氧化，降低水分散失，而蒸馏水组褐变迅速，水分大量散失，多酚严重氧化。因此，Vc@SeNPs有望成为新型果蔬保鲜剂。
苹果是世界四大水果之冠，汁甜肉脆，富含铁、钾、有机酸等营养成分，有清热化痰，补中益气的功效[1]。鲜切苹果是指苹果经去皮、去核、切分、保鲜等工艺处理的轻加工产品，很大程度上保持了苹果肉脆、多汁、味美的特征[2]。随着生活方式的改变，鲜切苹果等营养、健康、安全，方便的轻加工食品已经形成并深受消费者喜爱，然而加工过程中的机械损伤加速了鲜切苹果水分及营养物质流失，同时促进酶促褐变、组织软化、果片表面微生物生长，严重降低鲜切苹果的营养价值和商品价值，极大地缩短了鲜切苹果的货架期[3-5]。目前，通过物理保藏方法，如低温贮藏、食用涂膜、气调保鲜、紫外辐照等方式处理鲜切苹果，不同程度地延长了鲜切苹果的货架期，但这类方法对贮藏环境要求严苛，投入成本过高，技术要求复杂，难以控制[6-8]。化学保鲜方法成本低廉、操作简便、保鲜效果好，被人们广泛接受。例如，抗坏血酸(Vc)等抗氧化剂是防止鲜切水果褐变，保持水果品质的重要方法，但Vc性质不稳定，易氧化，当Vc被完全氧化成脱氢抗坏血酸时就会丧失抑制褐变的能力，同时可能会引起鲜切苹果的氧化损伤[9-10]。因此，开发稳定、安全的抗氧化剂是目前果蔬保鲜的重要工作。
硒(selenium，Se)被誉为“生命元素”，是人体必须的微量营养元素及一些抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶、谷氨酸还原酶等)的重要组成成分[11]，有增强免疫、抗氧化、预防心血管疾病、拮抗重金属毒性等功效[12-14]。因此富硒农产品开发已然成为热潮，但是硒的活性与毒性之间的作用范围较窄，相比于无机硒和有机硒，纳米硒(SeNPs)具有毒性小，生物利用度高，生物活性好的优势[15-16]。目前SeNPs主要用于药物开发，在果蔬保鲜方面的研究鲜有报道。本试验以Vc还原亚硒酸钠制得Vc修饰纳米硒(Vc modified nano selenium，Vc@SeNPs)，通过测定体外抗氧化指标及鲜切苹果褐变，失重率、平均散失率和总酚含量，初步评价Vc@SeNPs对鲜切苹果品质的影响，以期获得即可膳食补硒，又可保持鲜切苹果品质的果蔬保鲜剂，并为开发更加安全有效的果蔬保鲜剂提供理论依据。
红富士苹果：选取大小均一，八至九成熟，无机械损伤和病虫害，购买后保存于4 ℃冰箱。
Vc、30% H2O2、FeSO3、水杨酸、邻苯三酚，均为分析纯，天津永大化学试剂厂；亚硒酸钠，郑州红祥化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、亚硒酸钠、Na2CO3、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)[2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、福林酚，北京索莱宝科技有限公司；其他试剂,国药集团化学试剂有限公司。
Titan透射电镜，中国FEI公司；多功能酶标仪，Moecular Devices；UV-5200型UV-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱，美国Thermo公司；AUY120型电子天平,岛津公司；CL-3型磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1.2.1 Vc@SeNPs的制备
依据软模板法制备Vc@SeNPs并适当调整[17]。以PVP为模板剂，Vc为还原剂。将200 μL Vc溶液(0.2 mol/L)加入小烧杯中，并用磁力搅拌器轻轻搅拌，然后将100 μL亚硒酸钠溶液(0.1 mol/L)和50 μL PVP(5.0 g/L)溶液滴入Vc溶液中，搅拌至颜色由无色变至砖红色，将所得溶液离心，弃去上清液，将沉淀复溶后定容至10 mL，4 ℃保存。
1.2.2 Vc@SeNPs的化学表征
1.2.2.1 紫外-可见光谱(ultraviolet-visible absorption spectrometry, UV-Vis)测定
将Vc与Vc@SeNPs稀释至适当浓度后，在190～450 nm波长范围内检测紫外扫描吸收峰。
1.2.2.2 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)测定
FT-IR测定采用溴化钾压片法，取适量冷冻干燥的Vc@SeNPs粉末与溴化钾按照1∶100质量比混合，测定红外吸收峰。
1.2.2.3 透射电镜(transmission electron microscope,TEM)表征
取10 μL Vc@SeNPs滴至TEM专用铜网上，室温放置至干燥，于FEI透射电子显微镜上观察并拍照。
1.2.3 Vc@SeNPs体外抗氧化活性测定
1.2.3.1 还原力测定
参考OYZIAU[18]测定还原力的方法并适当调整。不同浓度的Vc@SeNPs溶液及Vc溶液1 mL,加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mmol/L，pH 6.6)、2.5 mL K3Fe(CN)6(10 g/L)溶液，50 ℃水浴20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸(100 g/L)溶液，终止反应后3 000 r/min离心10 min, 取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl3(1.0 g/L)，测定700 nm处混合物的吸光度。
1.2.3.2 超氧阴离子自由基
清除能力测定
参照MARKLUND[19]测定
取不同浓度Vc@SeNPs溶液1 mL分别与4.5 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.2)混匀，25 ℃水浴20 min，随后加入0.4 mL邻苯三酚(25 mmol/L)，25 ℃反应5 min后立即加入1 mL HCl溶液(8 mmol/L)终止反应，以Tirs-HCl为空白对照，Vc为阳性对照，测定325 nm处吸光度，各组均为3个平行，取平均值，按公式(1)计算清除率：
(1)
式中：E，清除率，%；A0，空白吸光度；A1，样品吸光度；A2，显色剂本底吸光度。
1.2.3.3 羟自由基(·OH)清除能力测定
参照LI等[20]的方法测定·OH清除能力。取不同浓度的Vc@SeNPs溶液1 mL分别与FeSO4(9 nmol/L，1 mL)、水杨酸-乙酸溶液(9 nmol/L，1 mL)、H2O2溶液(9 nmol/L，1 mL)混匀，37 ℃水浴30 min，以超纯水为空白， Vc为阳性对照，510 nm处测定吸光值，各组均为3个平行，取平均值，根据1.2.3.2中公式(1)计算清除率。
1.2.3.4 DPPH自由基清除能力测定
参照MA等[21]的方法稍作改动。取不同浓度的Vc@SeNPs溶液及DPPH-乙酸溶液各2 mL，摇匀，25 ℃避光放置30 min，在517 nm处测定吸光度，以无水乙醇替代样品溶液为空白对照，以不同浓度Vc溶液作为阳性对照，各组均为3个平行，取平均值。根据1.2.3.2中公式(1)计算清除率。
1.2.4 Vc@SeNPs对鲜切水果的保鲜试验
1.2.4.1 鲜切苹果的处理
将置于4 ℃的苹果在室温(22 ～25 ℃)条件下放置2 h后清洗、去皮、去核、切块(切为1cm左右厚度的苹果片)，分别用蒸馏水、10、30、50 g/L Vc@SeNPs或Vc浸泡后，测定各个时间段的相关指标。
1.2.4.2 感官评价
参照管磬馨等[22]的方法。请10位具备食品感官评定专业知识的人员对苹果切片的色泽、气味、组织状态等指标进行评分，评定标准如表1所示。
表1 鲜切苹果感官评分细则
Table 1 Fresh-cut apple sensory score rules
评分项目评分标准分数色泽外观(30分)白色或微黄色,颜色分布均匀黄色, 某些部位颜色较深棕褐色, 颜色分布不均匀21～3011～2010分以下气味(30分)具有明显的苹果香味,无不良气味无苹果香味,略有不良气味16～3015分以下组织状态(40分)组织状态完整,结构紧密组织状态不完整,结构松散21～4020分以下
1.2.4.3 褐变度测定
称取2 g鲜切苹果，分别放入30 mL 10、30、50 g/L Vc或Vc@SeNPs溶液及蒸馏水中浸泡，观察不同时间段内鲜切苹果的褐变情况，并拍照。
1.2.4.4 失重率和平均散失率测定
将鲜切苹果分别放入装有30 mL 10、30、50 g/L Vc或Vc@SeNPs溶液及蒸馏水中，浸泡30 min后用滤纸吸干其表面附着的水分，室温(25 ℃)置于保鲜膜上，每隔30 min称重并记录数值。按公式(2)计算失重率，按公式(3)计算平均散失速率:
失重率
(2)
平均散失速率
(3)
1.2.4.5 总酚含量测定
参照韩菊等[23]的方法。称取0.5 g鲜切苹果放入研砵中，分别加入100 μL 10、30、50 g/L Vc@SeNPs溶液，研磨成浆后定容至10 mL容量瓶中，取250 μL的样液于10 mL试管中，再加入1.25 mL福林酚试剂，摇匀，3 min后加入75 g/L的Na2CO3溶液1 mL,振荡。静置1 h后在765 nm处测定吸光值，以10、30、50 g/L Vc溶液为阳性对照，蒸馏水代替Vc@SeNPs做空白测定，以没食子酸做标准品测定标准曲线。每组重复测量3次，取平均值。
试验所得数据均采用SPSS 22.0软件进行分析，结果表示为均值±标准差(Mean±SD)，P<0.05表示显著差异。运用Origin 2018进行绘图。
2.1.1 紫外-可见光谱分析
Vc及Vc@SeNPs的UV-Vis光谱如图1所示。在220 nm以下的远紫外区，Vc及Vc@SeNPs均有最大吸收峰，Vc的最大吸收峰位于266 nm处，Vc@SeNPs的最大吸收峰位于256 nm处。最大吸收峰蓝移10 nm。依据王娜等[24]以没食子酸修饰纳米硒的紫外光谱，杨志恒等[25]对纳米TiO2/β-CDP复合物的紫外光谱，可以推测Vc还原亚硒酸钠后Vc侧链的羟基(—OH)与SeO结合形成Se—O共价键，从而影响—OH吸收峰，导致Vc@SeNPs特征峰蓝移。
图1 Vc@SeNPs的紫外-可见光谱
Fig.1 UV-Vis spectra of Vc@SeNPs
2.1.2 FT-IR光谱分析
Vc@SeNPs红外光谱如图2所示。
图2 Vc@SeNPs红外图谱表征
Fig.2 Vc@SeNPs characterization of FT-IR
Vc图谱中3 410.65 cm-1为—OH伸缩振动，1 029.56 cm-1为—OH面内弯曲振动峰[26]。对比Vc图谱发现，Vc@SeNPs图谱中的上述特征峰均发生移动，这是由于Vc侧链中的—OH与SeO结合后形成Se—O共价键，分子间氢键作用增强，表明Vc与SeNPs结合形成Vc@SeNPs[27]。
2.1.3 TEM表征
Vc@SeNPs的形貌如图3所示。Vc@SeNPs呈明显单分散球状颗粒，分散性良好，粒径分布均匀。粒径分布如图4所示，通过Nano Measurer 1.2软件分析得出Vc@SeNPs平均粒径为64.80 nm。
图3 Vc@SeNPs透射电镜表征
Fig.3 TEM characterization of Vc@SeNPs
图4 Vc@SeNPs粒度分布柱状图(a)及分布曲线(b)
Fig.4 Vc@SeNPs particle size distribution histogram(a) and distribution curve(b)
2.2.1 Vc@SeNPs还原力活性评价
还原力被认为是评价抗氧化能力最重要的指标，直接反映了抗氧化剂清除自由基能力的强弱[18]。Vc@SeNPs的还原能力如图5所示。
图5 Vc@SeNPs对还原力的影响
Fig.5 Effect of Vc@SeNPs on reducing power
在一定浓度范围内，Vc@SeNPs的还原能力随浓度的增大而增加，呈浓度依赖性。当样品质量浓度为0.1 g/L时，Vc@SeNPs的还原力是Vc的1.65倍，表明在低浓度时Vc@SeNPs还原力较强，当质量浓度升高至0.6 g/L时，Vc@SeNPs还原力为1.87，仍高于相同浓度下Vc的还原力，表明Vc@SeNPs具有较强的还原能力。
2.2.2 Vc@SeNPs清除·OH活性评价
·OH被认为是最活泼的氧化剂，可以与细胞中的蛋白质、核酸以及糖类等各种大分子物质作用导致细胞损伤[28]。Vc具有较强的还原能力，可以与·OH发生氧化还原反应以降低自由基对机体的危害[29]。Vc@SeNPs对·OH的清除能力如图6所示。在0.1～0.6 g/L质量浓度范围内，Vc@SeNPs对·OH的清除能力与Vc相当，IC50为0.10 g/L，且有明显的量效关系。当Vc@SeNPs质量浓度为0.6 g/L时对·OH的清除率为77.9%，是Vc的90%。由此可见，Vc@SeNPs对·OH的清除能力较强。此外，郑晓凤[30]研究发现，当SeNPs及Vc质量浓度为10 g/L时，SeNPs对·OH的清除能力与Vc相当，但在低浓度时Vc对·OH的清除能力高于SeNPs，与本文结果相似。
图6 Vc@SeNPs对·OH的清除率
Fig.6 Effect of Vc@SeNPs on the scavenging rate of ·OH
2.2.3 Vc@SeNPs清除
活性评价
在活性氧形成过程中起着重要作用，主要损害细胞膜及亚显微结构，并引起一系列有害的生化反应[19]。Vc@SeNPs对的清除能力如图7所示。在一定浓度范围内，Vc@SeNPs对的清除率呈线性增长，具有量效关系，IC50为0.25 g/L。当质量浓度≥0.5 g/L时，Vc@SeNPs对的清除率是Vc的97%，且趋于稳定，这与罗海英等[31]制备的纳米硒-氨基酸溶胶有类似的清除效果。
图7 Vc@SeNPs对
清除率的影响
Fig.7 Effect of Vc@SeNPs on the scavenging rate of
2.2.4 Vc@SeNPs清除DPPH自由基活性评价
DPPH被广泛用于评估各种抗氧化剂对自由基清除作用。在抗氧化剂存在的情况下，DPPH自由基可以接受电子或氢原子以减少自由基损伤[32]。如图8所示，Vc@SeNPs对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增大而增加，具有明显的量效关系，IC50为0.51 g/L。当质量浓度为0.1 g/L时，Vc@SeNPs对DPPH清除率是Vc的62%，当质量浓度增高至0.4 g/L时，Vc@SeNPs对DPPH的清除率是Vc的45%，表明Vc@SeNPs在0.1～0.6 g/L范围内均能有效清除DPPH自由基。
图8 Vc@SeNPs对DPPH清除率的影响
Fig.8 Effect of Vc@SeNPs on the scavenging rate of DPPH
2.3.1 Vc@SeNPs对鲜切苹果感官品质的影响
感官品质是综合评价鲜切苹果品质的重要指标。不同浓度Vc@SeNPs或Vc溶液对鲜切苹果感官品质影响如图9所示，10、30、50 g/L Vc@SeNPs或Vc溶液处理后鲜切苹果感官评分随贮藏时间的延长而降低。10、30、50 g/L Vc@SeNPs溶液处理鲜切苹果感官评分明显优于Vc溶液处理组及蒸馏水处理组。处理2 h内，Vc@SeNPs及Vc处理组状态良好，未表现出色泽变黄，有不良气味等症状。处理4 h以后，Vc处理组均出现色泽变黄，有些部位出现棕褐色，苹果香味变淡，而10、30、50 g/L Vc@SeNPs处理组感官评分均大于60分，且未出现褐变，气味变淡等不良状态。6 h以后蒸馏水处理组苹果切面出现严重褐变，切面表层发黏，几乎无苹果香味。而Vc@SeNPs处理组感官评分虽有所下降，但组织状态，苹果香味以及色泽等均表现良好。综合比较发现， 30、50 g/L Vc@SeNPs处理均可较好的保持鲜切苹果的新鲜度，延长鲜切苹果的货架期，其中50 g/L Vc@SeNPs处理组效果最佳。
图9 不同处理对鲜切苹果感官品质的影响
Fig.9 Effects of different treatments on sensory quality of fresh-cut apples
2.3.2 Vc@SeNPs对鲜切苹果褐变的影响
色泽是消费者评估鲜切果蔬外观品质的重要指标，也从一定程度上反映了鲜切果蔬的营养价值变化。蒸馏水处理后，苹果褐变程度随储藏时间的延长而加剧。这可能是由于机械切割破坏苹果组织结构，诱导产生大量活性氧，过量的活性氧加剧膜脂质过氧化，膜渗透性增大，进而加剧酶促褐变[33-34]。对比蒸馏水，30、50 g/L Vc@SeNPs及Vc均可显著抑制鲜切苹果褐变，但两者并无明显差异，而10 g/L Vc@SeNPs及10 g/L Vc对防止鲜切苹果褐变的效果差异较大。如图10所示，处理6 h后，10 g/L Vc@SeNPs处理组鲜切苹果仅有轻微褐变，10 g/L Vc处理组鲜切苹果褐变程度加深，显著优于蒸馏水处理组。表明Vc@SeNPs能有效延缓鲜切苹果发生褐变。
图10 处理6 h时鲜切苹果的褐变情况
Fig.10 Browning of fresh-cut apples at 6 h
由于Vc@SeNPs具有较好的自由基清除效果，因此，Vc@SeNPs可能通过自身抗氧化特性清除机械损伤中产生的大量自由基，从而延缓苹果切片褐变。
2.3.3 Vc@SeNPs对鲜切苹果失重率的影响
水分是影响鲜切水果品质的重要因素，直接反映了鲜切苹果的新鲜状况[35]。鲜切苹果在加工过程中细胞受损，呼吸强度增大，蒸腾作用加剧，导致营养物质流失，果品品质下降，货架期缩短[36]。由图11可知，鲜切苹果在贮藏期间质量变化较大，说明贮藏期间鲜切苹果呼吸强度较高，水分散失较多。对比不同处理组发现，蒸馏水处理组失重率增长最快，Vc及Vc@SeNPs处理组均能有效减缓鲜切苹果水分散失，其中50 g/L Vc@SeNPs处理组对鲜切苹果的水分维持明显优于蒸馏水及50 g/L Vc处理组(P<0.05)。这是由于Vc@SeNPs有效降低了鲜切苹果面水膜的透过率，阻断了水蒸气散失[37]。表明Vc@SeNPs可以减缓苹果质量的下降速度，较好地保持苹果的水分。
图11 不同处理对鲜切苹果失重率的影响
Fig.11 Effect of different treatments on the weight loss rate of fresh-cut apples
2.3.4 Vc@SeNPs对鲜切苹果水分平均散失率影响
鲜切苹果的水分平均散失率如图12所示，所有处理组均在贮藏前1 h内急剧升高，1～3 h内各组平均散失率均有所延缓，之后平缓下降。这表明苹果切片在贮藏前3 h内水分散失较快，应在此阶段做好保鲜措施。
图12 不同处理对鲜切苹果水分平均散失率的影响
Fig.12 Effect of different treatments on the average loss rate of fresh-cut apples
对比不同处理组发现，不同浓度Vc处理组平均散失率存在差异，其中，50 g/L Vc处理组优于10 g/L Vc处理，这与杨巍等[38]的研究一致。对比不同浓度Vc和Vc@SeNPs处理组发现，Vc@SeNPs处理明显优于蒸馏水和Vc处理组，其中50 g/L Vc@SeNPs处理水分平均散失率最低，是50 g/L Vc处理的58%(P<0.05)。这表明50 g/L Vc@SeNPs处理鲜切苹果能有效防止水分散失。
2.3.5 Vc@SeNPs对鲜切苹果总酚含量的影响
苹果多酚是苹果生长过程中产生的次生代谢产物，是苹果及其加工产品重要的呈味物质及显色物质。如图13所示，贮藏期间不同处理鲜切苹果总酚含量均呈下降趋势。贮藏0 h，鲜切苹果总酚含量为1 410 mg/kg，贮藏7 h，鲜切苹果总酚含量为634.65～1 134.00 mg/kg，与LI等[4]和CHEN等[37]研究一致。对比不同浓度Vc及Vc@SeNPs处理组发现，不同处理组存在差异，10、30、50 g/L Vc@SeNPs处理组总酚含量均高于Vc及蒸馏水处理组，其中50 g/L Vc@SeNPs处理组总酚含量仅下降19.5%，是蒸馏水处理组的1.79倍， 是50 g/L Vc处理组的1.42倍，这可能是由于Vc及Vc@SeNPs均属于抗氧化性物质，当Vc及Vc@SeNPs含量较高时不仅抑制了鲜切苹果多酚氧化，而且促进酚类物质生成，因而Vc@SeNPs可有效延缓鲜切苹果多酚氧化[38]。
图13 不同处理对鲜切苹果总酚含量的影响
Fig.13 Effect of different treatments on total phenolic content of fresh-cut apples
目前SeNPs或SeNPs修饰物在果蔬保鲜方面的研究鲜有报道，本文以Vc为还原剂成功制备了分散均匀，平均粒径为64.80 nm的球形Vc@SeNPs。通过还原力，
和DPPH自由基指标表明Vc@SeNPs在0.1～0.6 mg/mL浓度范围内均具有量效关系，且清除率随浓度的增大呈上升趋势，能有效清除自由基。在鲜切苹果保鲜方面，Vc@SeNPs处理鲜切苹果后能有效防止鲜切苹果发生褐变，较好地保持水分，延缓苹果质量的损失和鲜切苹果多酚氧化。此外，Vc和Se均为无污染食品添加剂，因此Vc@SeNPs作为果蔬保鲜剂，即可膳食补硒，又能起到保鲜作用，有望成为理想的鲜切苹果保鲜剂。
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