摘 要 ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一种新型广谱天然防腐剂。由于生产成本较高，价格昂贵，限制了其在食品工业上的广泛应用。为降低生产成本，研究了不同氨氮
浓度对淀粉酶产色链霉菌生产ε-聚赖氨酸的影响。摇瓶发酵试验结果表明,当
初始质量浓度为0.5 g/L时，提高了天冬氨酸激酶(aspartokinase，Ask)和聚赖氨酸合成酶(polylysine synthetase，Pls)的活力，发酵96 h, ε-PL产量达到0.95 g/L，与对照组相比提高了15.13%。5 L发酵罐分批发酵和流加发酵实验确定了一种有效提高ε-PL产量的方法：初始质量浓度2.5 g/L，发酵过程中流加(NH4)2SO4使质量浓度维持在0.5 g/L。采用此工艺进行补料分批发酵，ε-PL最高产量达到27.67 g/L，与对照组相比提高了17.72%。
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是一种由赖氨酸单体通过ε-氨基和α-羧基形成酰胺键聚合而成的天然同聚物。因其具有安全性高、抑菌谱广、水溶性和热稳定性好等优点，被日本、美国、韩国等多个国家用作食品防腐剂，2014年我国国家卫计委批准ε-PL及其盐酸盐作为食品防腐剂使用[1-3]。为了提高 ε-PL的产量，国内外学者在产生菌改造、营养条件优化和发酵过程调控等方面进行了研究。李双等[4]从不同ε-PL生产菌株出发，利用基因重排技术(Genome shuffling)使产量进一步提高。SHIMA等[5]研究了不同碳氮比对白色链霉菌发酵产生ε-PL的影响。KAHAR等[6]利用pH 双阶段调控策略，有效提高了ε-PL的生产效率。REN等[7]建立了一种酸性pH冲击策略，ε-PL产量有了很大提高。GUO等[8]研究发现不同浓度的酵母粉对ε-PL产量、生物量及关键酶活力有显著性差异(P<0.05)。WANG等[9]研究了金属离子对 S. diastatochromogenes CGMCC3145 产生ε-PL的影响， 当添加0.1 mmol/L Fe2+时，ε-PL 产量提高了 29.2%。此外，外源添加甘氨酸、赖氨酸[10-11]、ATP及生物素[12]均能提高 ε-PL 产量。
已有的ε-PL发酵过程中，氮源是随着碳源的流加进行补充的，往往只对碳源进行控制[13]。氮源的消耗主要体现在发酵液中氨氮
浓度的变化，其中，无机氨氮发挥着重要的作用。产物合成与
的消耗速率存在相关性，过高浓度的会阻遏氯霉素、力复霉素、头孢菌素、白霉素和放线菌素的生物合成[14]。冯宁等[15]在研究氮源及其补料策略对L-缬氨酸发酵影响时，也发现(NH4)2SO4初始浓度高于225 mmol/L会对菌体生长产生抑制作用。在ε-PL合成代谢途径中，经三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环得到的草酰乙酸与结合生产L-天冬氨酸，进而合成最终产物ε-PL[16]。前期以Streptomyces albulus IFO14147和Streptomyces noursei NRRL 5126生产ε-PL的研究中发现，可显著影响ε-PL 合成[17-18]。陈旭升等[19]采用Streptomyces sp.M-Z18菌株，在发酵过程中控制碳源浓度的同时将氨氮质量浓度控制在0.1～0.5 g/L，ε-PL产量提高29%，但氨氮质量浓度对菌株Streptomyces diastatochromogenes 6#-7发酵生产ε-PL有何影响尚不清楚。因此，本研究尝试对ε-PL发酵过程中的进行定量控制，以确定氨氮对ε-PL合成的影响。
淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 6#-7)，天津科技大学生物反应工程研究室保藏。
种子和发酵培养基均为M3G培养基(g/L)：葡萄糖50，(NH4)2SO4 10，酵母浸粉5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO4 1.36，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.03，用NH3·H2O调pH至7.2，121 ℃灭菌20 min。
通过调节培养基中(NH4)2SO4含量控制初始氨氮质量浓度。
1.2.1 摇瓶发酵
从斜面挑1环孢子接于含有100 mL M3G液体培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min条件下振荡培养30 h得到种子液。
将种子液以6%接种量接于含有100 mL M3G液体培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min条件下培养。定时取样，测定相关参数。
1.2.2 5 L分批发酵
采用5 L搅拌式发酵罐(B.Braun自控式发酵罐)。初始装液量2.7 L，接种量为10%。发酵过程中控制温度30 ℃，初始pH 6.8，自然降至pH 4.0时自动流加体积分数11%～13% NH3·H2O维持pH。通风量1～2 vvm，溶氧量(dissolved oxygen, DO) 30%，发酵液中残糖降至0 g/L时，发酵结束。
1.2.3 5 L补料分批发酵
采用5 L 搅拌式发酵罐(B.Braun自控式发酵罐)。初始装液量2.7 L，接种量为10%。采用严格的2阶段pH控制工艺进行发酵：初始pH 6.8，前期控制pH在6.0左右，当葡萄糖质量浓度降至10 g/L时，此时控制pH维持在4.0，温度30 ℃，通风量1～2 vvm，DO控制30 %(搅拌转速为300～1 000 r/min)，通过流加葡萄糖控制残糖质量浓度并流加(NH4)2SO4控制质量浓度。
残糖、生物量、pH参数的测定参照文献[20]。
ε-PL标准曲线和产量的测定参照文献[21]。
标准曲线和浓度的测定参照文献[22]。
天冬氨酸激酶(aspartokinase, Ask)活性测定参照文献[23]；聚赖氨酸合成酶(polylysine synthetase, Pls)活性测定参照文献[24-25]。
质量浓度对摇瓶发酵生产ε-PL的影响选择不同初始
质量浓度作为实验组，以M3G培养基作为对照组
质量浓度2.5 g/L)，摇瓶发酵96 h，研究质量浓度对摇瓶发酵生产ε-PL的影响，结果如图1所示。
图
质量浓度对摇瓶发酵生产ε-PL的影响
Fig.1 Effect of concentration on ε-PL production in flask fermentation
由图1看出，除空白组(初始未添加
外，其他实验组随着初始质量浓度的增加，残糖(RG)质量浓度逐渐提高，耗糖能力逐渐减弱，pH逐渐升高，ε-PL产量降低。空白组 pH保持较高水平，残糖较其他实验组低，生物量较高，但发酵液中未检测出ε-PL，这可能与参与氨基酸合成有关[26]，菌体利用葡萄糖用于细胞生长，但由于缺少不能合成关键氨基酸，进而影响了ε-PL的合成[27]。初始质量浓度为0.5 g/L时，ε-PL产量达到0.75 g/L，与质量浓度2.5 g/L对照组ε-PL产量(0.69 g/L)相比提高了8.70%。
为了解释初始质量浓度对ε-PL生产影响的原因，对初始质量浓度分别为0、0.5、2.5、5.0 g/L组取样并测定Ask和Pls的活力(图2)及测定ε-PL产量等参数(表1)。Ask是天冬氨酸途径的第一个酶，在ε-PL生物合成中起到决定性的调控作用[28]。Pls作为ε-PL合成途径中最后一个酶，控制ε-PL的合成，它的表达水平直接影响ε-PL的产量[29]。
从图2中看出，
初始质量浓度0.5 g/L时，酶活力均高于其他组，24 h Ask酶活力达最高52.21 U，是对照组(23.63 U)的2.21倍，48、72 h分别达41.21、33.11 U，是对照组1.18、1.12倍，总体上保持较高的水平。Pls酶活力在发酵48h达到1 077.59 U，是对照组(967.72 U)的1.11倍；72 h Pls酶活力达到最高1 264.51 U，是对照组(958.18 U)的1.32倍；96 h酶活力下降，但仍高于对照组。根据表1可知，初始质量浓度为0.5 g/L时，细胞活力高，ε-PL产量最高，糖酸转化率达到3.93%，高于对照组(3.69%)，就摇瓶发酵而言，初始质量浓度为0.5 g/L更有利于生产ε-PL。
表1 摇瓶发酵96 h相关数据对比
Table 1 The comparison of data on shaker fermentation
注：a残糖(residual sugar)
初始ρ(NH+4-N)/(g·L-1)最大菌体量/(g·L-1)ε-PL产量/(g·L-1)ρ(RG)a/(g·L-1)最终ρ(NH+4-N)/(g·L-1)糖酸转化率/%05.42021000.54.310.95260.193.932.5(对照组)4.72g0.8128.52.193.695.04.230.7330.54.453.48
a-Ask酶活力;b-Pls酶活力
图
质量浓度对摇瓶发酵Ask和Pls酶活力的影响
Fig.2 Effect of concentration on the activities of Ask and Pls in flask fermentation
在大多数细菌中，L-Lys 是通过天冬氨酸途径合成的[30]，也有研究表明异源表达Ask可以提高L-Lys的产量[31]，而L-Lys 是S.diastatochromogenes 合成 ε-PL 的前体物。初始质量浓度为0.5 g/L更有利于Ask和Pls的表达，进而增加了ε-PL的产量。
质量浓度对5 L发酵罐生产ε-PL的影响为研究发酵罐水平下初始质量浓度对ε-PL产量的影响，以M3G培养基作为对照组，初始质量浓度为0.5 g/L作为实验组进行分批发酵，结果如图3所示。
图
质量浓度对5 L发酵罐分批发酵生产ε-PL的影响
Fig.3 Effect of concentration on the ε-PL production by batch culture in 5 L bioreactor
由图3看出，在发酵开始阶段实验组生物量增长速率略高于对照组，32 h时生物量增长速率降低，最终生物量仅为16.52 g/L，低于对照组(24.12 g/L)31.51%，这与摇瓶发酵一致； ε-PL产量的变化趋势两者一致，随着生物量的增加，ε-PL产量也逐渐增加，发酵前期实验组ε-PL的增长速率要高于对照组，最终产量只有2.61 g/L，与对照组(3.63 g/L)相比降低了28.10%，分析原因可能是随着发酵的进行，质量浓度逐渐降低，虽然在发酵过程中用于维持pH的NH3·H2O可以补充一定质量浓度的
但对于高菌体量而言，发酵液中的量不足以合成所需的前体物质，导致一部分细胞自溶，生物量较低，最终影响了ε-PL产量。
质量浓度对5 L发酵罐流加发酵生产ε-PL的影响5 L发酵罐分批发酵实验结果表明，由于发酵罐中菌体量高，0.5 g/L的不足以满足菌体生长和ε-PL生产的需要，因此在发酵过程中对质量浓度进行定量控制能够在某种程度上提高ε-PL的产量。以传统方法即碳氮源以一定比例混合一起，通过碳源的添加量进行流加，不控制质量浓度为对照，本文研究了2种流加方式：实验组A，初始质量浓度2.5 g/L，当发酵液中质量浓度降至0.5 g/L，通过流加(NH4)2SO4使质量浓度保持在0.5 g/L；实验组B，初始质量浓度0.5 g/L，发酵过程中控制质量浓度维持于0.5 g/L；分别进行流加发酵，结果如图4所示。
质量浓度;b-生物量;c-ε-PL产量
图
流加方式对5 L发酵罐流加发酵生产ε-PL的影响
Fig.4 Effect of Feeding Method on the ε-PL production by fed-batch culture in 5 L bioreactor
由图4-a看出，实验组A发酵80 h时质量浓度降至0.5 g/L，实验组B发酵过程中控制质量浓度维持在0.5 g/L，而对照组由于碳氮源混合同时流加，80 h 质量浓度达到了3.38 g/L，并且随着发酵时间的延长，对照组的质量浓度逐渐升高，直至发酵结束质量浓度达到5.78 g/L，远高于实验组A和实验组B；从菌体生物量(图4-b)可以看出，实验组B的生物量与其他2组相比始终处于较低水平，这与分批发酵结果一致(图3)，80 h生物量达到最大，为24.55 g/L，而实验组A和对照组生物量最大值分别为35.98和34.75 g/L，这可能是由于实验组B中质量浓度一直维持在0.5 g/L，发酵前期含量过低使细胞的生长受到较大限制；由图4-c可看出，实验组A发酵168 h ε-PL产量最高，达到27.67 g/L，与对照组相比提高了17.72%，实验组B发酵152 h ε-PL产量最高，为12.46 g/L，远低于实验组A和对照组，这可能是由于实验组B的菌体量处于较低水平(图4-b)，导致产量低于实验组A和对照组。
对实验组A与对照组发酵过程中细胞比生长速率、产物比合成速率及生长强度进行对比，结果如图5所示。
a-细胞比生长速率;b-ε-PL比合成速率;c-生产强度
图
流加方式对ε-PL合成效率的影响
Fig.5 Effect of feeding method on the ε-PL synthesis efficiency
由图5-a看出，实验组A和对照组的比生长速率曲线基本重合，可见改变了控制方式对整体细胞生长几乎没有影响，这与图4-b中细胞生物量的结果相符。图5-b是ε-PL比合成速率图，由图5-b中可以看出实验组A和对照组从40 h开始上升，大约在110 h达到最高，40 h后实验组A的ε-PL比合成速率始终高于对照组，这表明实验组A的菌体细胞合成产物能力较强。从图5-c可以看出，发酵40 h以后，实验组A的生产强度始终高于对照组，虽然二者的比生长速率相近(图5-a)，但实验组A产物合成能力明显高于对照组，使得ε-PL产量与对照组相比提高17.72%。
摇瓶发酵结果表明，初始质量浓度为0.5 g/L能够促进Ask和Pls的表达，进而提高ε-PL的产量，发酵96 h产量达到0.95 g/L，与对照组相比提高了15.13%。就5 L发酵罐水平而言，初始质量浓度为2.5 g/L，对发酵过程中碳、氮源分别流加，控制葡萄糖质量浓度维持在10 
质量浓度维持于0.5 g/L，保证了菌体正常生长，提高了细胞合成产物的能力，更有利于生产ε-PL。利用此工艺进行补料分批发酵，168 h ε-PL的产量达到26.67 g/L，与对照组相比提高了17.72%。发酵过程中控制质量浓度可以提高ε-PL产量。
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ABSTRACT ε-poly-L-lysine(ε-PL) is a new type of broad-spectrum natural food preservative. Because of its high cost and high price, its application in food industry is limited. In order to reduce the production cost, the effect of ammonia nitrogen concentration on the production of ε-PL by Streptomyces diastatochromogenes was studied. Results indicated that the yield of ε-PL was 0.95 g/L，improved by 15.13% compared with the control group and the activities of Ask and Pls were improved when the initial concentration of was 0.5 g/L fermented in shaking flasks for 96 h. An effective increasing ε-PL production method was verified by the batch and fed-batch fermentations: The initial concentration of was 2.5 g/L, ammonium sulfate maintains the concentration of 0.5 g/L in 5 L the fermenter by fed-batch. In this method, the final yield of ε-PL was 27.67 g/L, which was improved by 17.72% contrasting to the control group.
Key words Streptomyces diastatochromogenes; 
ε-poly-L-lysine; fed-batch fermentation