随着人们生活质量提升，枸杞等药食兼用的特色高值农产品开始进入大众视野。枸杞中含有丰富的多糖、氨基酸、黄酮类化合物、甜菜碱、维生素和微量元素等营养成分[1-2]，具有提高机体免疫力、改善视力、调节血糖、血脂、血压、延缓衰老、抗癌抑制肿瘤等效用[3-5]，已经成为生活中常用的养生滋补佳品。但随着科研深入，人们已经不满足单纯对枸杞的营养成分、药理作用[6]进行研究，更倾向于枸杞产地、来源等真实性信息探究，这也是消费者直接关心的问题。
目前常用的食品产地溯源的方法有稳定性同位素技术、近红外光谱技术及矿物元素分析技术等。稳定性同位素技术在谷物溯源时使用较多，CHUNG等[7]和RASHMI等[8]曾应用稳定性同位素技术分别对来自不同地域的水稻以及小麦进行溯源。近红外光谱技术在鱼类和肉类中应用广泛[9]，OTTAVIAN等[10]利用近红外光谱技术对野生和饲养的海鲈鱼进行区分；孙淑敏[11]和史岩等[12]利用近红外光谱技术对肉类进行溯源。矿物元素溯源技术较为常用，在肉类[13]、鱼类[14]、酒类[15]及谷物类[16]均有应用。比较国内外溯源技术发现，矿物元素分析技术通过元素差异鉴别食品产地，操作简单且更加快速准确，是食品产地溯源的关键[17-18]。
枸杞原本为野生资源，从20世纪60年代开始广泛种植，如今枸杞在我国主要有宁夏、青海、甘肃、内蒙及新疆等几大产区。目前宁夏枸杞、中宁枸杞已经注册为地理标识，价格昂贵[19]但深受大众喜爱；青海地区由于其地理位置优越，污染较少，已经发展为我国枸杞的第2大产区，种植面积达到了43.9万亩，成为后起之秀[20]，但在价格和影响力方面仍不及宁夏枸杞。由于两大产区的枸杞相似性很高，不法商贩为了谋取利益，经常利用消费者心理虚构产地，导致枸杞市场混乱。因此，关于宁夏和青海两大产区的枸杞鉴别技术亟待发展。
本文应用电感耦合等离子体-质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)测定了宁夏地区和青海地区共180种枸杞中44种元素含量，首次通过测定元素含量结合化学计量学方法，包括偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)和反向传输人工神经网络(back propogation artificial neural network, BP-ANN)，建立了宁夏和青海枸杞产地的溯源模型，并考察模型的特异性和灵敏度，为枸杞溯源及产地鉴别提供技术支持。
1 实验部分
1.1 仪器于设备
超微量天平,梅特勒-托列多仪器上海有限公司；Milli-Q超纯水系统,美国Millproe公司；Agilent 7700x电感耦合等离子-质谱仪,美国Agilent Technologies；CEM MARS 6 微波消解仪,美国CEM公司。
1.2 试剂和材料
浓HNO3、H2O2，均为MOS级，北京化学试剂厂；超纯水(18.2 MΩ·cm)：由Milli-Q超纯水系统所制，用于定容样品溶液和配制标准溶液；稀土元素标准储备液(10 μg/mL)、多元素标准储备液(10 μg/mL)、内标液(100 μg/mL)、调谐液(10 μg/L), 美国Agilent Technologies；Rh单元素标准溶液(1 000 μg/mL), 国家有色金属及电子材料分析测试中心；国家标准物质胡萝卜(GSBW10047)。
2018年在宁夏玉门、瓜州、惠农等地区收集地理信息可靠的枸杞样品99个，在青海都兰县、诺木红等地区收集地理信息可靠的枸杞样品81个。
1.3 溶液配制及样品前处理
标液制备：将稀土元素标准储备液和多元素标准储备液逐级稀释至适当浓度；内标液：将100 μg/mL的标准液用10% HNO3(体积分数)稀释成1 mg/L，Rh标准液用于稀土元素分析；调谐液：将10 μg/L调谐液用10% HNO3稀释成1 μg/L。
取适量枸杞放入烘箱，在65 ℃条件下烘烤48 h，冷却后研磨至粉末状态，过60目筛，装入100 mL样品瓶贴签备用。
用超微量天平称取0.2 g粉末状样品，精确至0.000 1 g，放入洁净干燥的聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL浓HNO3，室温下放置过夜，次日加入2 mL H2O2，室温下反应20 min，将聚四氟乙烯消解罐加盖后放入微波消解仪按照表1设定好的程序进行消解。
表1 微波消解工作参数
Table 1 Conditions for microwave digestion ofL. barbarum L.
步骤最大功率/W爬行时间/min控制温度/℃保持时间/min11 60010120521 6005160531 600518010
消解完成后，冷却至室温后打开消解罐，用超纯水洗涤消解罐3次，定容至50 mL，混匀。
1.4 ICP-MS测定条件
ICP-MS测定的参数均由仪器自动调谐给出，每次测定前均进行调谐，根据仪器的状态对参数进行调整，以满足灵敏度、氧化物、稳定性等各项指标。射频功率1 550 W，射频电压1.66 V，载气流量1.00 L/min，蠕动泵采集样品时转速0.1 r/s。
1.5 数据处理
在与测定实验样品相同的仪器条件下连续测定试剂空白6次，以试剂空白检出限的3倍为定量限(limit of quantitation, LOQ)浓度，10倍为检出限(limit of detection, LOD)浓度。应用安捷伦Mass hunter软件进行数据处理，所有元素含量统一浓度后(μg/kg)直接导入Mass Profiler Professional软件应用单边方差分析(P<0.05)，并应用该软进行PLS-DA和BP-ANN分析。
2 结果与讨论
2.1 元素含量分析
对宁夏和青海2个地区枸杞的稀土元素和矿物元素含量进行统计，结果见表2，枸杞中元素含量存在明显差异。从表2可以看出，在稀土元素中，除宁夏地区La的平均含量>1 mg/kg，两地其余稀土元素含量均处于较低水平，宁夏地区枸杞样品稀土元素的平均含量均高于青海地区；微量元素测定结果显示，两地区K、Na、Mg 3种元素含量较高，宁夏地区其平均含量分别为15 697、5 867、1 057 mg/kg，青海地区平均含量分别为15 361、3 969、809 mg/kg；其次是宁夏地区Al、Ca、Fe、Sb、Zn、Mn、Cu、Sr、Cr、Rb、Ba 11种元素和青海地区Al、Ca、Fe、Sb、Zn、Mn、Cu、Sr、Rb 9种元素，这些元素的平均含量均高于1 mg/kg；两地其余元素均处于较低水平，对比发现，Sb在宁夏地区枸杞中含量仅为27.963 mg/kg，而青海地区高达71 094 mg/kg，是青海地区唯一高于宁夏地区的元素。
表2 宁夏和青海地区枸杞元素含量 单位：mg/kg
Table 2 Results of elements of Lycium barbarum L. from Ningxia and Qinghai
注：*表示μg/kg，LOD表示检出限
元素宁夏青海最大值最小值平均值最大值最小值平均值La625.13812.098*18.84278.202*2.688*19.175*Ce261.905*5.381*76.561*159.286*5.613*40.589*Pr27.612*0.748*8.681*18.497*0.588*4.615*Nd108.660*2.795*33.380*71.983*2.294*17.941*Sm20.831*0.684*6.765*14.472*0.552*3.533*Eu4.448*0.240*1.315*2.560*0.181*0.753*Gd19.337*0.442*5.553*15.433*0.464*4.317*Tb9.670*
将两地枸杞样品平均值进行统计分析，所测44种元素中Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se 9种元素存在显著性差异(P<0.05)。这些结果可能与枸杞生长的地理环境、气候条件息息相关。
2.2 模型的灵敏度和特异性
对于只含有2类样品判别的模型，可以采用灵敏度和特异性这2个参数对其进行评价。灵敏度是指在模型中某类样品被识别为该类样品的百分比，特异性是指其他类样品不被判别为该类样品的百分比。对于该类模型，存在4种情况，即真阳性(true positive, TP)，真阴性(true negative, TN)，假阳性(false positive, FP)和假阴性(false negative, FN)，用TP/(TP+FN)×100来表示模型灵敏度，用TN/(TN+FP)×100来表示模型特异性[21]。
2.3 主成分分析
所有枸杞样品中的元素含量统一为质量分数后(μg/kg)直接导入软件，Mass Profiler Professional (MPP，version B. 15.0)进行分析。应用MPP对宁夏和青海枸杞中44种元素含量进行统计分析，以宁夏枸杞样品为中心，按照不同样品间元素含量倍数2倍对元素进行过滤，将具有显著差异的9种元素(Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se)进行主成分分析(principal component analysis, PCA)。图1给出了99个宁夏枸杞和81个青海枸杞样品在前2个主成分的得分分布图，除个别样品外，青海和宁夏枸杞样品基本可以分开。宁夏枸杞位于第1主成分的负半轴，青海枸杞位于第1主成分的正半轴，前2个主成分可以解释64.2%的变量，这表明，宁夏和青海枸杞中元素含量存在着一定的差异，基于多种元素对宁夏和青海枸杞进行判别是可行的。
宁夏(■);青海(▲)
图1 宁夏和青海枸杞PCA得分2D分布图
Fig.1 2D distribution of PCA score of Ningxia and QinghaiLycium barbarum L.
2.4 模型建立与预测
2.4.1 PLS-DA模型
基于前述9种元素，应用PLS-DA算法建立青海和宁夏枸杞的判别模型，采用多重交叉检验的方式进行模型验证，重复10次。在模型确认和模型训练中宁夏枸杞样品判别的灵敏度均为100%，而青海枸杞则均有2个样品被判别为宁夏枸杞，模型的特异性为97.5%。为了进一步验证模型的可靠性，分别从青海和宁夏枸杞中随机选出75%的样品建立模型，剩余25%的样品则用于对模型进行确认。结果表明，应用75%的枸杞样品建模时，74个宁夏枸杞和61个青海枸杞均分别有1个样品被误判，模型的识别灵敏度和特异性分别为98.6%和98.4%，见表3。应用该模型对剩余25%的枸杞样品进行判别，25个宁夏枸杞和20个青海枸杞均能被准确预测，模型预测的准确率为100%。
表3 PLS-DA和BP-ANN模型灵敏度和特异性比较 单位：%
Table 3 Sensitivity and specificity of PLS-DA and BP-ANN models
建模类型PLS-DABP-ANN灵敏度特异性灵敏度特异性全部样品建模10097.510010075%样品建模98.698.4100100
2.4.2 BP-ANN模型
基于前述9种元素，应用BP-ANN算法建立青海和宁夏枸杞的判别模型，采用分层人工神经网络模型，输入层含有7个神经元，隐层含有3层,每层含15个隐含节点，输出层为2个节点；迭代层数为100；验证类型为留一法。在模型确认和模型训练中青海和宁夏枸杞样品判别的灵敏度和特异性均为100%，即在该模型中青海和宁夏枸杞均能完全区分。
与PLS-DA模型类似，采用75%的样品建模，25%的样品预测的方式对BP-ANN方法建立的青海和宁夏枸杞判别模型的可靠性进行验证。结果表明，应用75%的枸杞样品建模时，74个宁夏枸杞和61个青海枸杞均能准确分类，模型的灵敏度和特异性均为100%，应用该模型对剩余25%的枸杞样品进行判别，25个宁夏枸杞和20个青海枸杞均能被准确预测，模型预测的准确率为100%，见表3。
这表明，相比于PLS-DA模型，基于多种微量元素建立的宁夏和青海枸杞BP-ANN模型具有较强的判别能力。
3 结论
本文应用微波消解结合ICP-MS测定了来自宁夏和青海共180个枸杞样品中44种微量元素含量。结果显示，2个地区枸杞中Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se 9种微量元素存在显著差异，对9种差异性成分进行PCA分析识别，前2个主成分可以解释64.2%的变量，基本可以区分宁夏和青海2个地区的枸杞样品。利用PLS-DA算法和BP-ANN算法建模，发现BP-ANN模型的灵敏度和特异性均为100%，优于PLS-DA模型。总而言之，本文首次建立的基于多元素分析、结合模式识别快速判别宁夏和青海枸杞的溯源技术，可以快速实现两地枸杞的判别。
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