郫县豆瓣甜瓣子发酵阶段蛋白质组分及降解规律研究

郫县豆瓣是中国四川地区一种传统发酵调味品，主要原料为红辣椒和蚕豆，加上面粉和食用盐等辅料发酵而成，具有味辣香醇、红棕油亮、酱香浓郁等特点，被誉为“川菜之魂”[1]。特殊的酿造工艺、原料及环境因素造就了郫县豆瓣独特的风味，郫县豆瓣生产工艺主要分前发酵及后发酵2个阶段，前发酵阶段主要包括蚕豆瓣的制曲(下文称曲瓣子)、甜瓣子的发酵及辣椒醅的预处理，其中甜瓣子是接种米曲霉制曲后的蚕豆瓣辅以一定比例盐水混合发酵而成的郫县豆瓣半成品；后发酵阶段主要将成熟甜瓣子与辣椒醅按比例混合，在工业条池或陶缸中，通过特殊的“翻、晒、露”生产工艺及陈化，最终得到风味独特的郫县豆瓣成品[2-3]。甜瓣子发酵阶段利用制曲阶段积累的蛋白酶、淀粉酶等酶系对原料中大分子物质进行分解，产生多肽、氨基酸、糖、有机酸和各种挥发性风味物质，郫县豆瓣前发酵阶段是风味形成的关键阶段[4-6]。而蛋白质是发酵调味品中风味物质的重要来源，蛋白质逐步水解释放出的呈味肽及游离氨基酸等小分子物质赋予了调味品独特的滋味[7-8]，同时部分氨基酸是许多挥发性风味物质形成的前体物质。廖顺等[9]从白腐乳中分离出3条肽链，其中2条分别呈鲜味和鲜酸味，另1条在味精溶液中呈现明显增鲜作用。林洪斌等[4]对后发酵阶段郫县豆瓣氨基酸呈味效果进行评价，认为谷氨酸是郫县豆瓣鲜味的主要来源，氨基酸进一步降解形成乙醛、乙醇和酯类等小分子挥发性香气物质[10]。近年来，研究人员在提高郫县豆瓣蛋白利用率等方面做了较多研究，主要集中在筛选高产蛋白酶菌株、提高成曲酶活力、优化生产工艺等方面。陈廷廷等[11]通过米曲霉与黑曲霉共培养复合制曲提高成曲中蛋白酶活力，比单一菌株发酵酶活力提升1倍。李由[12]通过优化蛋白水解工艺条件来提高氨基酸态氮含量，但关于郫县豆瓣中蛋白质组成及降解变化规律的研究却鲜见报道。

本研究从郫县豆瓣分级蛋白组分出发，根据蛋白质溶解性，采用Osborne分级提取法对郫县豆瓣甜瓣子发酵过程中的蛋白质进行分类，分析各组分蛋白在甜瓣子阶段降解变化规律及多肽、游离氨基酸等降解产物变化情况，为改进郫县豆瓣生产工艺，指导曲料酶系构建，提高蛋白质利用率，提升产品风味提供理论依据与指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料取自成都市旺丰食品有限公司生产车间，取制曲0、3、7 d曲瓣子及盐水发酵15、30、45、60、90 d的甜瓣子，其中m(曲瓣子)∶m(食盐)∶m(水)=100∶38∶75，分别编号Q0、Q3、Q7、T15、T30、T45、T60、T90，样品经冷冻干燥后粉碎，过40目筛备用。

乙醇、NaOH、三氯乙酸、NaCl、浓H2SO4、CuSO4、硼酸、HCl、十二烷基硫酸钠、甘油、三羟甲基氨基甲烷,分析纯,成都科龙化工厂；牛血清蛋白、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250,上海源叶生物科技有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，北京金克隆生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

KH3200E超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；TD-5M型离心机，四川蜀科仪器有限公司；日立L-8900型全自动氨基酸分析仪，日立高新技术公司；MVS-1旋涡混合器，北京金紫光科技发展有限公司；BSA224S分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；K9840型自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；Spectra Max i3x型多功能酶标仪，美谷分子仪器 (上海) 有限公司；凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司; DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 总蛋白含量测定

自动凯氏定氮仪法，参照GB 5009.5—2010。

1.3.2 Osbrone法分级蛋白提取工艺

水溶蛋白提取[13]：称取5 g样品，以蒸馏水为提取剂，加入50 mL蒸馏水于40 ℃下浸提1 h，8 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液；沉淀用蒸馏水冲洗3次，所得上清液与第1次上清液混合，定容至100 mL，即得水溶蛋白溶液。

盐溶蛋白提取：取第一步操作所得沉淀，以5% NaCl溶液为提取剂，参照第一步工艺条件，收集上清液，即得盐溶蛋白溶液。

醇溶蛋白提取：取第一步操作所得沉淀，以75 %乙醇溶液为提取剂，参照第一步工艺条件，收集上清液，即得醇溶蛋白溶液。

麦谷蛋白提取：取第一步操作所得沉淀，以0.1 mol/L NaOH溶液为提取剂，参照第一步工艺条件，收集上清液，即得麦谷蛋白溶液。

1.3.3 各组分蛋白质含量测定

采用Boardford法测定蛋白质含量[14]。以牛血清蛋白浓度为横坐标，595 nm处吸光值为纵坐标，得到牛血清蛋白标准曲线为Y=0.006 1X+0.015 6(R2=0.998 9)，该标准曲线具有良好线性关系。

1.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳分析

提取的蛋白溶液，各自加不同比例缓冲溶液稀释，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的蛋白溶液，加入等量5×上样缓冲液(内含100 g/L SDS、5 g/L溴酚蓝、体积分数的50%甘油、5%巯基乙醇、0.25 mol/L pH 6.8 Tris-HCl)，沸水浴中加热5 min。配制质量浓度为120 g/L分离胶和50 g/L的浓缩胶，上样量10 μL，开始电压80 V，进入分离胶后电压120 V，条带至分离胶底端后电泳结束，经考马斯R250溶液染色后脱色，采用凝胶成像系统拍照。

1.3.5 多肽含量测定

参考夏蓉等[15]的方法。称取2 g样品放入研钵研磨粉碎，加入0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.8)定容至10 mL，4 ℃浸提1 h，8 000 r/min离心15 min取上清液。上清液与等体积15%(体积分数)三氯乙酸混合均匀后4 ℃静置30 min，8 000 r/min离心15 min以去除大分子蛋白质，取上清液为肽提取液，参照1.3.3方法测定多肽含量。

1.3.6 氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸含量

标准溶液的制备：根据国标GB/T 30987—2014，配制20种游离氨基酸，浓度为1.25 μmol/mL，作为母液。

流动相的配制：根据国标GB/T 30987—2014中相关要求配制流动相B1-6及R1-3。

样品的制备：将待测液于4 ℃下1 000 r/min离心15 min，取上层清液过0.22 μm微孔滤膜后备用。

色谱条件：日立生理体液分析柱PF (4.6 mm l.D.×60 mm)；反应柱温度135 ℃；流动相流速为0.35 mL/min，反应液流速为0.30 mL/min；分离梯度条件及反应液梯度条件见GB/T 30987—2014，检测器检测波长为570和440 nm。

1.3.7 数据处理与分析

每个样品重复3次，结果以

表示，采用Origin 9.1 进行数据处理统计。

2 结果与分析

2.1 甜瓣子制备过程中总蛋白质含量变化

甜瓣子阶段总蛋白含量变化结果如图1所示。由图1可以看出，制曲0 d时蛋白质含量为31.25 g/100 g，在制曲阶段先略微上升，因为在制曲前期微生物开始生长繁殖，由于孢子萌发的需要，部分糖类等通过呼吸作用转化成CO2及水分释放到环境中，而含氮代谢物积累到曲料中，导致总蛋白的少量升高[16]。甜瓣子发酵阶段，总蛋白含量呈现显著下降趋势，发酵15 d，总蛋白含量快速下降到25.31 g/100 g，由于一方面曲料与盐水混合，在渗透压作用下部分可溶性蛋白与盐水发生物质交换，溶解到池底发酵液中，另一方面蛋白质在蛋白酶的作用下开始降解成多肽、氨基酸等小分子物质，同时美拉德反应也会消耗部分蛋白，转化为挥发性物质，从而导致总蛋白含量的减少。发酵后期蛋白质降解速率减缓，发酵90 d结束后，总蛋白质含量为19.17 g/100 g，总体下降38.78%。

2.2 甜瓣子发酵阶段各组分蛋白含量变化

甜瓣子发酵阶段，不同蛋白组分含量变化如图2所示。由图2可以看出，制曲开始前，原料中水溶、盐溶、醇溶和麦谷蛋白质含量分别为6.64、9.06、0.63、9.20 g/100 g。醇溶蛋白主要来自于原料中面粉，整个甜瓣子发酵阶段，醇溶蛋白含量极低，且没有显著变化，所以醇溶蛋白降解对郫县豆瓣风味品质影响较小。而水溶、盐溶及麦谷蛋白在制曲阶段含量均有部分升高，制曲7 d后分别达到8.18、 10.05和9.28 g/100 g，可能是部分不溶性氮被分解成肽、氨基酸等可溶性氮，同时微生物在大量繁殖的过程中也会产生菌体蛋白和各种酶[17]。甜瓣子发酵阶段前期，盐溶蛋白含量快速下降，发酵15 d时含量下降到1.35 g/100 g，这是由于盐溶蛋白在水中溶解度极低，但受NaCl浓度升高的影响，蛋白质表面电荷增加，增强蛋白质分子和水分子间相互作用力，促进盐溶蛋白的盐溶、盐析反应[18-19]，导致甜瓣子阶段盐溶蛋白大量溶出沉淀至发酵池底部的盐水环境中，对甜瓣子蛋白降解贡献较小。而甜瓣子发酵前期水溶蛋白含量有明显增加，发酵15 d后增长到12.26 g/100 g，一部分来源于微生物菌体自溶，另一部分来自于微生物所产蛋白酶对蛋白质的降解，原料中难溶的大分子质量蛋白质被转化为可溶性小分子蛋白[20-21]，发酵后期开始逐步下降并趋于稳定，发酵结束时其含量为7.72 g/100 g。麦谷蛋白在甜瓣子发酵阶段一直保持明显下降趋势，随着发酵的继续进行，酸性物质的积累导致环境pH不断降低，碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶活力逐渐减弱，麦谷蛋白降解作用被进一步抑制，发酵结束后其含量下降到6.54 g/100 g。

2.3 甜瓣子发酵阶段各组分蛋白质SDS-PAGE电泳分析

根据前述分析，甜瓣子发酵阶段主要降解蛋白质为水溶蛋白和麦谷蛋白，而SDS-PAGE能直观反映甜瓣子发酵阶段蛋白亚基间发生的聚集、降解等情况。对2种蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析，如图3所示，2种蛋白亚基在制曲阶段分布各有异同，但分布范围均集中在20～60 kDa之间。制曲阶段各组分蛋白亚基均无明显变化，水溶蛋白在30和20 kDa处有1条明显条带，而麦谷蛋白在30～40 kDa间有1条较粗条带，甜瓣子发酵开始后2种蛋白质降解反应剧烈，由大分子蛋白质降解为小分子蛋白亚基或者更小的肽段等。水溶蛋白在发酵15 d后,30 kDa以上蛋白条带逐渐变浅，大分子蛋白发生降解，并降解成1条集中在20 kDa附近的明显条带，但30～50 kDa之间仍存在部分条带，说明在甜瓣子发酵阶段后期水溶蛋白酶解不彻底。而麦谷蛋白则在发酵前30 d快速降解，甜瓣子发酵15 d时大分子蛋白条带逐渐变浅，发酵30 d后30 kDa以上条带已基本消失，20 kDa附近蛋白质亚基条带逐渐加深，可以看出在发酵前30 d水溶蛋白和麦谷蛋白均发生明显降解，由大分子蛋白降解生成小分子蛋白亚基或者多肽及氨基酸，在发酵过程后期小分子蛋白亚基呈不断积累的趋势。由此可知，郫县豆瓣甜瓣子发酵阶段水溶蛋白和麦谷蛋白降解显著，说明此2种蛋白是郫县豆瓣风味物质形成的关键蛋白。

2.4 甜瓣子发酵阶段多肽含量变化

由图4可以看出，制曲开始时多肽含量为1.29 mg/g，制曲阶段多肽含量没有明显变化。从总蛋白质含量变化及SDS-PAGE电泳分析可以看出，蛋白质在甜瓣子发酵前期降解作用剧烈，但甜瓣子发酵15 d时多肽含量快速下降到0.96 mg/g，可能是部分多肽快速降解生成氨基酸等小分子物质，还有部分多肽释放到发酵环境中。刁文睿等[22]发现在醋渍花生多肽含量变化中也出现相似情况。而后随着发酵过程的进行，多肽含量开始逐渐上升，并在后期趋于稳定，说明在甜瓣子发酵后期，随着蛋白酶活性的降低和蛋白质降解作用的减弱，多肽被更多地分解成游离氨基酸，多肽的形成速率与消耗速率实现相对平衡，发酵结束后含量达到1.31 mg/g。

2.5 甜瓣子发酵阶段游离氨基酸含量

甜瓣子阶段游离氨基酸含量变化趋势如表1所示。游离氨基酸由蛋白质及多肽降解产生，是郫县豆瓣的一种重要呈味物质，对郫县豆瓣风味构成起到重要作用[4]。由表1可以看出，制曲阶段共检出19种氨基酸，且该阶段总量变化不明显，而甜瓣子发酵15 d后游离氨基酸总量迅速上升到30.987 mg/g，说明甜瓣子发酵前期蛋白降解作用剧烈，蛋白质在蛋白酶、肽酶的作用下快速水解，生成大量氨基酸，同时此阶段美拉德反应等消耗氨基酸的反应程度较弱，从而导致氨基酸含量的快速增长。随后甜瓣子发酵中期游离氨基酸含量增长缓慢，并逐渐趋于稳定，此时受发酵环境影响，蛋白酶活性被抑制，蛋白质降解作用减弱，氨基酸更多地参与美拉德反应及分解生成其他小分子风味物质，氨基酸的积累速率与消耗速率达到平衡状态。而发酵后期随着酸性物质的积累，发酵环境pH不断下降，酸性蛋白酶活力更高，促使更多的多肽分解成氨基酸，到甜瓣子发酵90 d结束后游离氨基酸总量积累到50.219 mg/g。

参考PARK等[23]将游离氨基酸据呈味特性分为5类，即甜鲜味、鲜酸味、苦甜味、苦味、咸味。其中呈甜鲜味、鲜酸味和苦味游离氨基酸含量最高，并且甜瓣子发酵90 d时呈甜鲜味和鲜酸味氨基酸总量接近其发酵30 d时的2倍，增长的绝对量最大。结合SDS-PAGE电泳结果分析推测水溶蛋白与郫县豆瓣风味形成关系更加密切，同时本研究也从分子层面解释了甜瓣子发酵90 d以上才能达到甜瓣子的成熟度，即具有醇厚味和浓郁酯香。除精氨酸外大部分游离氨基酸呈总体上升趋势，谷氨酰胺仅在制曲阶段检出，含量较高(≥1 mg/g)的游离氨基酸有丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸，呈鲜酸味的谷氨酸和天冬氨酸增长率最高，发酵结束后分别增长5.60和7.81倍。在发酵前期各类呈味氨基酸总量差异不大，而发酵90 d结束后含量最高的呈味氨基酸依次是鲜酸味、苦味和甜鲜味氨基酸，总量分别达到16.140、14.652及11.829 mg/g。

3 结果与讨论

研究发现甜瓣子中水溶蛋白和麦谷蛋白在发酵前30 d快速降解，所以多肽含量呈现不断上升的趋势，而游离氨基酸含量在发酵前期增长缓慢，发酵结束时快速达到峰值50.219 mg/g。

郫县豆瓣甜瓣子发酵阶段主要是水溶蛋白和麦谷蛋白在甜瓣子发酵前期发生快速降解，发酵结束后仍有部分蛋白降解不彻底，原因是甜瓣子发酵后期由于高盐环境的胁迫、酸性物质的积累和某些微生物代谢物质的产生，抑制其蛋白酶酶活力，蛋白质降解作用减弱并趋于稳定[24-25]。多肽的生成依赖碱性及中性蛋白酶等蛋白内切酶的作用，而酸性蛋白酶等肽酶将多肽分解成氨基酸[26]，随着发酵环境pH不断降低，后期酸性蛋白酶活力更高，促使多肽分解成游离氨基酸，导致在发酵后期多肽含量增长缓慢。游离氨基酸含量在甜瓣子发酵阶段呈现上升的趋势，但在甜瓣子发酵中期增长缓慢，可能是部分游离氨基酸参与美拉德反应或作为前体物被消耗生成小分子风味物质，其生成速率与消耗速率相持平，到发酵后期随着酸性蛋白酶占据主导地位，游离氨基酸总量有显著提高，与后期多肽含量增长速率减缓相印证。根据呈味特性对氨基酸进行分类，含量最高的游离氨基酸依次为鲜酸味、苦味和甜鲜味氨基酸，说明随着发酵的长时间进行，不仅会使郫县豆瓣鲜味提高，赋予它丰富醇厚的口感，同时也会积累大量苦味氨基酸，进而产生苦味衍生物，影响郫县豆瓣的风味[27]。所以要提高郫县豆瓣甜瓣子发酵阶段蛋白质利用率，一方面要提高发酵后期蛋白酶活力，减缓其在高盐环境中的失活速率，另一方面还要加强米曲霉等微生物分泌酶系研究，根据产品品质需要，适当补充相关酶，满足不断变化的发酵环境需求。同时在后期发酵中也要关注游离氨基酸的构成，不能一味延长发酵时间，避免产生令人不悦的风味。

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