酰胺类物质广泛应用于工业各个行业，其中丙烯酰胺及其聚合物主要应用于凝结剂、土壤改良剂及石油回收剂等行业，烟酰胺是VB族中的一员，广泛应用于医药，化妆品及食品等行业，具有重要的经济价值。目前，生物法生产酰胺类化合物正逐渐取代传统的化学合成法，相比较化学合成法，生物法具有经济、高效、绿色及副产物少等优点。
腈水合酶(nitrile hydratase，NHase，EC 4.2.1.84)是一类能够水合腈类物质生成酰胺类化合物的金属酶，根据其活性中心螯合的金属不同，可将腈水合酶分为铁型腈水合酶(Fe-NHase)[1]和钴型腈水合酶(Co-NHase)[2]。腈水合酶主要来源于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌(Rhodococcus)及假诺卡氏菌属(Nocardia)等原核生物，在植物病原菌和放线菌中也有发现[3]，真核生物邻鞭毛虫(Monosiga brevicollis)中腈水合酶的发现[4-5]，对NHase研究具有重要意义。最近，在基因库中很多嗜热菌来源的腈水合酶基因被注释却未被解析，新基因的挖掘对研究腈水合酶具有重要意义。
腈水合酶的热稳定性普遍较差，大部分腈水合酶在50 ℃下就丧失活性[6]。应用于工业生产的红球菌 R. rhodochrous J1来源的腈水合酶有2种：高分子量腈水合酶H-NHase和低分子量腈水合酶L-NHase，在催化丙烯腈过程中起主要作用的H-NHase在50 ℃处理10 min仅剩40%酶活[7]，所以在工业催化过程中，需要通过严格的控温来维持腈水合酶酶活，增加了能耗。提高腈水合酶的热稳定性，增加酶或菌体在催化过程中的重复利用率，一直是腈水合酶研究的热点。2015年，房月芹等通过计算机半理性设计，将热稳定性较好的来源于Pseudonocardia thermophila JCM3095的腈水合酶与来源于Psedomonas putida NRRL-18668腈水合酶的β亚基通过同源片段交换，提高了目标蛋白的热稳定性[6]。2015年，XIA等利用一段短肽将P. putida NRRL-18668腈水合酶的β亚基和α亚基进行融合，提高了其酶活和热稳定性[8]。2016年，张晓欢将工业应用菌株 R. rhodochrous J1中H-NHase的β和α融合，提高了其热稳定性[7]。2017年，XIA等根据自由能进行半理性设计对来源于P. putida NRRL-18668的融合型腈水合酶进行点突变，进一步提高腈水合酶的热稳定性[9]。PEI等发现在Aurantimonas manganoxydans ATCC BAA-1229腈水合酶的β亚基表面的一段α螺旋对热稳定性具有重要作用[10]。一方面，研究者们通过蛋白质工程技术，对已有的腈水合酶热稳定性进行了成功的改造；另一方面，在基因库中许多耐热菌及古菌来源的腈水合酶被注释，新型耐热腈水合酶的挖掘对工业应用及科学研究具有重要意义。
在工业生产中，第3代丙烯酰胺生产菌株R. rhodochrous J1发酵周期为100 h[11]，效率低下，且菌株中的酰胺酶会进一步将酰胺物质催化生成酸，导致产品纯度不高。目前，腈水合酶的异源表达已被广泛研究[12-13]，该酶已成功在毕赤酵母、大肠杆菌、红球菌表达系统中表达[14-17]。工业菌株R. rhodochrous J1的H-NHase和L-NHase，通过优化各亚基之间的SD序列，已成功在大肠杆菌中表达[18-19]。有研究已成功异源表达腈水合酶生产烟酰胺，最终产量为230 g/L[20]。王哲通过优化全细胞催化工艺，在分批添加底物的催化下，烟酰胺最终产量为390 g/L[21]。
本研究针对提高腈水合酶的热稳定性，在Genebank基因库中寻找到一种耐热菌Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1来源的腈水合酶基因，成功实现该腈水合酶的异源表达，通过在β亚基的C端添加strep标签成功纯化出该酶，研究其热稳定性，对其全细胞催化工艺优化，探寻其工业应用价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
大肠杆菌DH5α感受态、大肠杆菌BL21(DE3)感受态，通用生物系统(安徽)有限公司；质粒pET-24a(+),由本实验室保藏。
1.1.2 主要试剂
3-氰基吡啶和烟酰胺、脱硫生物素，Sigma公司；异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)和卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；基因和引物由苏州金唯智合成，本文所用引物和序列如表1所示；胰蛋白胨、酵母膏提取物，Oxoid公司；限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ，宝生物公司(大连)有限公司(Takara)。
表1 本文所用引物及其序列
Table 1 Primers used in this study
引物名称引物序列(5'-3')长度/bpsBA-upGCAAGCTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAGGGTGCAAATGGCATTCATGATTTAGGTGG59sBA-downTGCACCCTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGCTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAA-CAAAAT71Bs-A-upGCAAGCTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAGGGTGCATAAAAGGAGATATAGATATGAAAGATAA-CAACAAAG72Bs-A-downTGCACCCTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGCTTGCATGGCTAACCGGTTCCAGATAG58
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息分析
利用NCBI-blast工具，将来源于耐热菌株的腈水合酶(NHase)进行初筛，调查研究背景；利用DNAMAN比对酶活中心的氨基酸序列，对所选基因进行复筛；利用SWISS-MODEL对所选酶进行三维结构分析。最终选择来源于温泉热碱芽孢杆菌Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1的腈水合酶(Cal.t NHase)进行研究。
1.2.2 表达载体pET-24a(+)-Cal.t NHase 的构建及表达条件优化
将来源于温泉热碱芽孢杆菌的腈水合酶(Cal.t NHase)进行密码子优化，各亚基前面添加一段优化过的RBS序列(AAGGAGATATAGAT)以利于各亚基的表达[22]。将优化过的密码子序列送至苏州金唯智进行基因合成，连接的载体选择pET-24a(+)，选择的基因插入位置为NdeⅠ和EcoRⅠ2个酶切位点，保藏菌株选择E. coli DH5α。
将合成好的质粒pET-24a(+)-Cal.t NHase 转化到E. coli BL21(DE 3)，涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，37 ℃倒置培养过夜，挑取单菌落置于含有50 μg/mL卡那霉素的5 mL 2YT液体培养基的试管中，37 ℃，200 r/min培养8～10 h。将培养好的试管种子液以1%的接种量转接到含有50 μg/mL卡那霉素的2YT培养基摇瓶中，37 ℃、200 r/min培养至OD600=0.6～0.8时，添加不同终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 g/L Co2+的诱导剂，30 ℃，200 r/min诱导14 h，破碎上清通过聚丙稀酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyaclamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析蛋白表达情况。
1.2.3 Cal.t NHase的分离纯化及浓度检测
分别在β亚基的N端和C端添加strep标签,构建pET-24a(+)-sBA和pET-24a(+)-BsA表达载体，构建方法为以质粒pET-24a(+)-Cal.t NHase为模板，用表1的引物进行全质粒PCR，DpnⅠ消化质粒模板后，将构建好的质粒转入E. coli DH5α，送测序，将测序结果正确的质粒重新转入E. coli BL21(DE 3)，用上述培养方法进行诱导表达。
收集菌体，用缓冲溶液binding buffer(20 mmol/L Na2HPO4、280 mmol/L NaCl、6 mmol/L KCl，pH=7.4)浓缩5倍重悬浮后，置于冰盒中(冰水混合物)，用超声破碎仪开3 s停7 s破碎20 min，4 ℃、12 000 r/min、离心1 h，过0.22 μm膜后，strep亲和层析进行纯化。先用抽滤过0.22 μm膜的去离子水将柱子中保存的乙醇溶液至少以5倍体积冲洗干净；再以1 mL/min的流速，用binding buffer溶液平衡柱子；蛋白样品始终放在冰上，10 mL过柱子，流速为1 mL/min，再以binding buffer平衡柱子；待紫外吸收降到0后，用washing buffer (20 mmol/L Na2HPO4、280 mmol/L NaCl、6 mmol/L KCl、2.5 mmol/L脱硫生物素，pH=7.4)洗脱，收集蛋白。将收集到的蛋白用Brandford法测定蛋白质量浓度，SDS-PAGE分析测定，将蛋白稀释到0.5 mg/mL备用。
1.2.4 Cal.t NHase 水合活性的测定
单位酶活力定义为在30 ℃下1 min催化烟腈生成1 μmol烟酰胺所需要的酶量(U)；比酶活定义为1 mg 腈水合酶具有的酶活力(U/mg)。反应体系：10 μL质量浓度为0.5 mg/mL蛋白加入490 μL含有200 mmol/L烟腈的10 mmol/L H3PO4缓冲溶液中，30 ℃反应10 min，加入500 μL的乙腈终止反应。过0.22 μm的膜后，C18柱经HPLC测其酶活，流动相为乙腈和水[V(水)∶V(乙腈)=2∶1]的混合液，检测波长为210 nm，检测温度为40 ℃，流动相流速为0.6 mL/min，进样量10 μL，检测10 min,每组数据至少进行3次平行实验。
1.2.5 酶学性质研究
(1)最适温度
分别测定该酶在20、25、30、35、37、40、50 ℃下的酶活，将最高的酶活定义为100%。
(2)最适pH
配含有终浓度为200 mmo/L烟腈的不同pH梯度(pH=5、6、6.5、7、7.5、8、8.5)的10 mmol/L H3PO4缓冲溶液，测定该酶在各pH底物缓冲溶液下的酶活，将最高酶活设定为100%，分析其随pH的变化情况。
(3)热稳定性
将本实验室中研究保存的腈水合酶分离纯化，分别为来源于R. rhodochrous J1的H-NHase(BAG)和L-NHase(BAE)[23-24]、来源于Pseudonocardia thermophila JCM 3095的腈水合酶(Pt-NHase)[25]，来源于Pseudomonas putida NRRL 1886的腈水合酶(Pp-NHase)[26]。将酶质量浓度调到0.5 mg/mL，在金属浴65 ℃下处理0、0.5、1、2、3、4、5 h取样，测各腈水合酶的相对酶活，定义各酶处理时间为0 h的酶活为100%，分析其热稳定性情况。
(4)底物及产物耐受性
将诱导培养后的菌液收集菌体，将OD600=8的菌体分别置于烟酰胺浓度为0、1.5、1、1.5、2 mol/L以及烟腈浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的缓冲溶液中，30 ℃下孵育30 min，12 000 r/min、1 min离心弃上清缓冲液，用10 mmol/L的H3PO4缓冲溶液洗菌体2次，测其残余酶活，将未经处理的菌体酶活定义为100%。分析不同浓度底物和产物的耐受情况。
1.2.6 全细胞催化生产烟酰胺
将诱导培养后的菌体收集，10 mmol/L、pH=7.4 H3PO4缓冲溶液重悬浮，最终确定反应体系为OD600=8，50 mL，催化期间不断搅拌，控温在30 ℃左右。分批次将烟腈固体添加到菌液中，检测催化过程中烟腈的减少量和烟酰胺的生成量，优化补料间隔时间和补料浓度。
2 结果与分析
2.1 Cal.t NHase基因的异源表达及分离纯化
用限制性内切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ对含有目的基因Cal.t NHase的表达载体pET-24a(+)-Cal.t NHase进行双酶切，酶切结果通过琼脂糖核酸凝胶电泳进行验证(图1)。除了诱导剂IPTG影响蛋白表达之外，Co2+对于腈水合酶发挥活性具有重要作用，但过高的Co2+浓度会抑制菌体生长及蛋白表达，故分别对Co2+和IPTG浓度进行优化，结果如图2-a所示，从SDS-PAGE图中确定最佳诱导条件为Co2+0.1 g/L、IPTG 0.2 mmol/L。
1-pET-24a(+)-Cal.t NHase;2-双酶切质粒pET24a-Cal.t NHase
图1 Cal.t NHase基因电泳图
Fig.1 Electrophoretogramo of Cal.t NHase gene
通过strep亲和层析的方法对目的蛋白进行分离纯化。因为在腈水合酶中，活性中心位于α亚基上，故选择在β亚基的N端和C端融合strep标签，从SDS-PAGE(图2-b)中可以看出将标签加在β亚基的C端可成功纯化该酶，而strep标签融合于腈水合酶β亚基的N端时，影响腈水合酶β亚基的正确折叠，β亚基表达效果不佳，β亚基和α亚基无法正确形成α2β2四聚体，所以strep标签融合于腈水合酶β亚基的N端时无法对目的蛋白Cal.t NHase分离纯化，故在后续的研究中，标签均加在β亚基的C端。
a-优化诱导条件蛋白胶图;b-蛋白纯化蛋白胶图
图2 Cal.t NHase SDS-PAGE图
Fig.2 SDS-PAGE of Cal.t NHase
2.2 酶学性质的分析
不同的反应温度对Cal.t NHase酶活的影响如图3-a所示，该酶最适温度为37 ℃，且在35～40 ℃该蛋白酶活差异不大，在低温下该蛋白酶活较低；不同的pH对Cal.t NHase酶活的影响如图3-b所示，最适pH为7.0且在pH=6.0～7.5其比酶活变化不大。Cal.t NHase的热稳定性如图3-c所示，来源于工业应用菌株红球菌R. rhodochrous J1的腈水合酶(H-NHase)在65 ℃下处理30 min完全丧失活性，来源于嗜热假诺卡氏菌P. thermophila JCM 3095的腈水合酶(Pt-NHase)在65 ℃处理1 h残余酶活仅为10%，Cal.t NHase在65 ℃下处理3 h仍能维持50%的酶活，相较于其他腈水合酶具有较好的热稳定性，对研究腈水合酶热稳定性具有重要参考价值。此外，良好的热稳定性能够节约能耗、降低成本及提高菌体重复利用率，在工业应用中具有重要意义。
a-最适温度;b-最适pH;c-不同来源的NHase 65 ℃热稳定性
图3 Cal.t NHase的酶学性质
Fig.3 Characterization of Cal.t NHase
PEI等研究发现Pt NHase的β亚基第6个螺旋(Q111-G125)对腈水合酶热稳定性影响较大[10]，Cal.t NHase、Pt NHase、Pp NHase、L-NHase、H-NHase相对应的β亚基第六螺旋序列对比如图4所示，从序列对比中可以看到此螺旋序列不保守，但热稳定性相对较好的Cal.t NHase、Pt NHase和L-NHase的L115、Q121和G126相对保守，可能是影响热稳定性的关键位点。
图4 影响NHase热稳定性的关键区域的序列比对
Fig.4 Sequence alignment of heat-sensitive region of NHase from different sources
Cal.t NHase底物(烟腈)和产物(烟酰胺)耐受性如图5所示，用1 mol/L烟腈处理30 min后该酶仍能维持52.87%酶活，用2 mol/L烟酰胺处理30 min仍能维持53.32%酶活。在用底物处理的结果中可以看到，用0.4 mol/L底物处理能维持88.8%的酶活，0.8 mol/L底物处理时仍能维持69%的酶活，在后续的全细胞催化过程中，考虑到底物添加批次及底物浓度过高对酶活影响等因素，选定探索的底物浓度为0.4和0.8 mol/L。
a-底物耐受性;b-产物耐受性
图5 Cal.t NHase底物产物耐受性
Fig.5 Tolerance of Cal.t NHase to 3-cyanopyridine and nicotinamide
2.3 全细胞催化生产烟酰胺
根据王哲[21]的研究，底物分批补料合成烟酰胺工艺，对全细胞催化进行了优化，将底物固体底粉末分批次添加到50 mL，OD600=8的菌液中，不断搅拌，第1批底物反应完后，添加第2批，选择每批底物浓度为0.4 mol/L(图6-a)和0.8 mol/L(图6-c)，最终选定的底物添加浓度为0.4 mol/L对底物添加时间进行优化，如图6-a和图6-b所示，最终选定的时间间隔是6 min，后期可适当延长。催化生成烟酰胺的产量比相关文献报道以H-NHase催化提高了26.9%。
3 结论
本文成功实现了温泉热碱芽孢杆菌Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1腈水合酶(Cal.t NHase)的异源表达，通过在β亚基的N端添加strep标签，成功实现了Cal.t NHase纯化，其在65 ℃下的半衰期为3 h，较工业应用的来源于R. rhodochrous J1的H-NHase热稳定性高。其比酶活为395 U/mg，比H-NHase提高了60%。在全细胞催化生产烟酰胺过程中，通过对底物添加的优化，最佳方式是前期添加时间间隔为6 min，添加量为0.4 mol/(L·次)，最高产量(质量浓度)为495.04 g/L。相比之前全细胞催化研究中，其烟酰胺产量有一定提高，缩短了催化时间，有利于工业生产。
a-0.4 mol/(L·次)，最初间隔时间10 min;b-0.4 mol/(L·次)，最初间隔时间6 min;c-0.8 mol/(L·次)，最初间隔时间15 min
图6 底物分批补料催化工艺的优化
Fig.6 Optimization of substrate fed-batch reaction
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