苹果作为世界上最受欢迎的水果之一，据报道每年的消费量高达6 460万t[1]。果汁工业上通常使用浓缩方式制备苹果汁，以降低运输和贮存成本，同时提高营养物质的浓度。苹果中酚酸和类黄酮物质能够降低心脏病、糖尿病和癌症等疾病的发生率，因此促进了苹果的消费[2]，但其中功能成分酚酸和黄酮不稳定，容易受到温度的影响。
传统的蒸发浓缩由于热处理导致各种生化反应的发生，直接影响味道、香气、颜色和生物活性物质的含量。由此，非热技术的产生，如超滤[3]、反渗透和冷冻浓缩[4]被用来代替果汁的热浓缩。然而，膜浓缩的方法成本高仪器复杂，相比之下冷冻浓缩可较好地保留有价值的化合物[5]。冷冻浓缩虽很好地避免了热作用对果汁营养物质的破坏，但由于冰晶形成、生长和分离3个过程需单独进行，设备耗资大；此外，形成的冰晶仅为毫米级，分离操作仍较困难[6]。单一的冷冻浓缩设备的成本较高，限制了大规模产业化应用。近年来随着冰温技术的发展，其应用领域不断扩大，将冰温技术应用于果汁浓缩中成为了可能。冰温真空浓缩即真空状态下，将果汁的温度控制在零度以下冰点以上进行浓缩脱水[7]。到目前为止，已经确定冰温贮藏对水果品质的保持有显著的影响[8]。然而，关于冰温浓缩对苹果汁质量影响的报道非常有限。因此，本文采用真空加热和冰温真空2种方式对苹果汁进行浓缩处理，对比其贮藏过程中品质指标及抗氧化能力的变化，为冰温浓缩果汁实际应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苹果(红富士)，购于上海市浦东新区农工商超市1 1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)，上海吉至生化科技有限公司；总抗氧化能力(ABTS)检测试剂盒，总抗氧化能力 (FRAP) 检测试剂盒 上海茁彩生物科技有限公司；NaOH标准滴定溶液、福林酚、芦丁、水合硝酸铝、没食子酸、三氯乙酸、抗坏血酸、NaHCO3、酚酞、NaNO2、铁氰化钾、FeCl3、无水乙醇、甲醇，国药提供且均为分析纯。
1.2 仪器与设备
九阳全自动压榨榨汁机，九阳股份有限公司；冰温真空浓缩机[9]，本实验室自行研制；BPZ-系列真空干燥机，上海一恒科学仪器有限公司；UV-1102型紫外可见分光光度计，上海天美仪器有限公司；手持折光仪，杭州恒仪仪表有限公司；pHS-2C型精密酸度计，上海雷磁仪器厂；Agilent-34972A温度采集仪，美国安捷伦公司；CR-400型色彩色差计，日本柯尼卡美能达公司；GL-12A 型高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HH-4 型电子恒温水浴锅，常州金坛良友仪器有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱[温度：(-2±0.5) ℃]，上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 材料处理
材料处理流程：
苹果洗净榨汁(九阳全自动压榨榨汁机)→过滤(100目)→杀菌(90 ℃，30 s)→快速冷却→浓缩(冰温真空浓缩(-2 ℃，500～600 Pa)、真空加热浓缩(60 ℃，95 kPa)→-2 ℃贮藏 →指标测定。
1.3.2 指标测定方法
(1)可溶性固形物：手持糖度计直接测定。
(2)酸度测定：按照GB/T —12456《食品中总酸的测定方法》。
(3)pH测定：雷磁酸度计测定。
(4)色差：本试验中果汁色泽[10]的测定采用色差仪 (即L*、a*、b*数值模式) 进行测定和评价，测量 3 次，取平均值。
(5)云度值与云度稳定性：云度值借鉴ERTUGAY等[11]的方法，760 r/min离心10 min，取上清液在660 nm处测吸光度，即为其云度值。云度稳定性测定：在 4 200 r/min下离心15 min，上清液在 625 nm 处测定吸光值，云度稳定性(CS)表示如公式(1)所示：
(1)
式中：CA，离心后的吸光值；C0，离心前的吸光值。
(6)离心沉淀率：称量离心管的质量A及装果汁后的总质量B，每瓶果汁重复3次，并于 3 500 r/min离心15 min。取出后倒掉上清液，称量离心管及沉淀的质量C。由于误差因素相同，因此称取离心前后离心管的质量即可得到苹果浊汁的离心沉淀率，计算如公式(2)所示：
离心沉淀率
(2)
(7)冰点：于烧杯中称取50 mL果汁，温度采集仪的热电偶固定于果汁中心处，放入18 ℃冰箱，每10 s记录1次温度，至果汁完全结冰后，测定结束。
(8)总酚含量：福林酚法[12]测定。得到的回归方程为y=0.165 8x-0.024 2，R2=0.995 7。取各样品 1.00 g，80%乙醇溶液稀释20倍，50 ℃超声 30 min，结果以没食子酸含量计算，单位为mg/100g。
(9)总黄酮测定：参考陈志娜等[13]的方法。得到的回归方程为y=2.512 5x+0.007 3，R2=0.994 7。取2 mL待测液体，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，混匀，5 min后加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀反应 6 min，加入2 mL 4%NaOH溶液，反应15 min，在 510 nm处测定其吸光度。以每100 g 中含有芦丁毫克数计，单位为mg/100g。
1.3.3 抗氧化活性测定
(1)总还原力的测定：参考TAI等 [14]的方法，稍作修改。1 mL待测液与 2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.6)混合，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混匀后50 ℃恒温水浴锅20 min，加入2.5 mL10%三氯乙酸，3 500 r/min离心10 min。取2.5 mL 上清液，蒸馏水稀释至0.5 mL后与0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液混合，700 nm 测定吸光度。
(2)DPPH·清除率的测定：参考LUO等[15]的方法，2 mL果汁与2 mL 0.2 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液反应30 min，在517 nm 处测定吸光度A1，无水乙醇代替DPPH测定吸光度A2，无水乙醇代替样品测定吸光度 A0。DPPH·清除率的计算如公式(3)所示：
DPPH·清除率
(3)
(3)ABTS+·清除率的测定：ABTS+·清除率试剂盒。
(4)FRAP抗氧化能力的测定：FRAP抗氧化能力测定试剂盒。得到标准曲线方程为：y=0.314 6x+0.060 7(式中y为波长593 nm处的吸光度；x为FeSO4·7H2O浓度，μg/mL；R2=0.994 4)。
样品测定：0.5 μL的提取液与180 μL的FRAP工作液混匀37 ℃孵育5 min采用酶标仪在593 nm处测定其最大吸收值，结果以每100 mL鲜果汁中所含的FeSO4·7H2O当量表示，单位为mg/100g。
苹果汁初始可溶性固形物12 °Brix，经3倍浓缩后升为36 °Brix。其中可滴定酸、多酚、黄酮以及抗氧化能力指标均是经浓度还原后进行对比。所有实验重复3次，所得结果表示为均值±标准偏差。采用方差分析(ANOVA)进行显著性分析；各处理之间的差异分析采用SPSS 17.0统计软件进行检验。
2 结果与分析
2.1 果汁冰点温度的确定
果汁由室温放入-20 ℃冰箱中温度迅速下降，达到过冷点之前，果汁温度线性降低，水分开始结晶，温度降低到最低点出现小幅度上升。冰晶成核后释放结晶潜热，果汁的温度立即回升，跃迁至其冰点(温度)，如图1中大约163 min所处的位置。随后，果汁进入冷冻状态，温度变化相对平缓。由温度冻结曲线分析可知果汁的冰点是-2.6 ℃。而浓缩果汁其冰点为-4.7 ℃。果汁浓缩冰点降低，是因为浓缩果汁可溶性固形物含量上升，具有明显降低冰点的作用。本试验将两种浓缩果汁与原汁均贮藏于(-2.0±0.5)℃条件下，不会使其内部形成冰晶，导致果肉细胞纤维受到破坏。
图1 苹果汁冰点曲线
Fig.1 Freezing point of apple juice
2.2 苹果汁贮藏过程品质变化规律研究
2.2.1 可滴定酸和pH变化规律
2种浓缩苹果汁与原汁均贮藏-2 ℃，其中苹果原汁为空白对照。期间可滴定酸和pH变化规律如图2所示。其中冰温浓缩苹果汁的可滴定酸变化更稳定。贮藏期间pH变化规律与可滴定酸相反，加热浓缩果汁在贮存20 d后观察到可滴定酸降到最低点(0.171 mg/100g)和pH有所上升(3.85)。在贮藏期过程中，pH值的上升和酸度的降低的结果与YADAV等[16]对苹果汁定性分析的结果一致。酸度的降低可能由于苹果汁中酸类物质氧化聚合以及多糖的酸性水解，其中酸被用来将非还原糖转化为还原糖。
a-可滴定酸；b-pH
图2 苹果原汁及浓缩汁贮藏期可滴定酸、pH变化规律
Fig.2 Variation of acid and pH in apple juice during storage period
2.2.2 苹果汁色差的变化
颜色变化是评价苹果汁品质劣变的最明显的现象之一。色值的检测指标为L*、a*和b*。L*、 +a*、-a*、 +b* 和 -b*分别代表明度、红色、绿色、黄色和蓝色。由表1可以看出，贮藏第30天冰温与蒸发浓缩果汁L*值分别为40.59、36.42(P<0.05)，此时加热浓缩果汁已经发生褐变，冰温浓缩苹果汁在贮藏时L*值缓慢下降且最终高于蒸发浓缩果汁，果汁亮度更高。冰温浓缩果汁色值更稳定，
表1 苹果汁色差的变化
Table 1 Effect of different storage temperature and concentration technology on color value of juice
贮藏时间/d原汁冰温浓缩汁加热浓缩汁L*a*b*L*a*b*L*a*b*040.26±0.02-3.67±0.024.17±0.1246.97±0.25a-5.59±0.01b19.34±0.08a40.82±0.45bc-6.77±0.02a20.70±0.21ab539.09±0.03-3.21±0.045.77±0.0945.79±0.24ab-5.67±0.03ab20.03±0.06ab39.91±0.25de-6.05±0.06ab21.19±0.12bc1038.42±0.22-2.65±0.016.99±0.1543.31±0.15bc-5.53±0.04bc20.91±0.12bc39.62±0.27de-5.75±0.02bc21.99±0.24cd1537.38±0.04-2.55±0.037.96±0.2143.41±0.62b-4.49±0.02cd20.82±0.15b39.12±0.62de-4.80±0.07bc22.21±0.16d2036.04±0.51-1.93±0.028.76±0.2242.13±0.12bc-4.64±0.02c21.31±0.08bc38.62±0.32de-4.27±0.02cd23.68±0.09de2536.11±0.22-1.92±0.048.59±0.0240.50±0.37d-4.11±0.022d21.38±0.046c36.55±0.29e-3.75±0.03e23.72±0.32e3036.05±0.31-1.88±0.028.52±0.0140.59±0.35d-4.05±0.01d21.55±0.06c36.42±0.35e-3.24±0.04e23.80±0.11e
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著(P < 0.05)(下同)
L*值基本保持在40以上。加热浓缩果汁由于浓缩过程温度偏高果胶酶解后的寡糖、寡聚糖等组分与果汁中的酚类或者蛋白质组分结合，从而引起贮藏中色
值下降的问题。冰温浓缩果汁由于加工及贮藏温度处于冰点以下，还原糖的羟基与胺基的化合物进行缩合反应速率得到抑制，削弱美拉德反应的进程。由此表明冰温条件能更稳定地保护浓缩苹果汁的颜色、亮度。
2.2.3 苹果汁品质稳定性变化
苹果浊汁的云度值、云度稳定和离心沉淀率是反映整个体系稳定性的主要品质参数。云度稳定性表示在转速4 200 r/min 下离心 15 min后苹果汁的稳定性，这一强度离心后得到的沉淀，被认为相当于储存一年的沉淀量[11]。表2列出了不同浓缩工艺条件下苹果浊汁的稳定性参数，由表2可以看出，冰温浓缩果汁由于浓缩过程中温度偏低，贮藏期间苹果浊汁云度值增大，云度稳定性较高，体系更稳定。从贮藏期内离心沉淀率的变化可以看出，冰温浓缩汁离心沉淀率为5.33%～12.71%，而加热浓缩汁在9.66%～24.89%果汁更易形成沉淀，导致稳定性下降且差异显著(P<0.05)。此外由于温度的降低降低果胶的失活率，而果胶含量越高，果汁的黏度就越大，果汁的混浊稳定性就越好。果胶还可通过阻止悬浮颗粒尺寸的长大而进一步提高果汁的混浊稳定性[17]。
表2 苹果浊汁贮藏过程中云度值、云度稳定性、和离心沉淀率
Table 2 Cloudyness, cloudiness and centrifugal precipitation rate during storage of apple turbid juice
贮藏时间/d云度值云度稳定性/%离心沉淀淀率/%原汁冰温浓缩汁加热浓缩汁原汁冰温浓缩汁加热浓缩汁原汁冰温浓缩汁加热浓缩汁02.326±0.0032.644±0.002a2.608±0.002ab28.50±0.0590.66±0.01a88.23±0.02b1.59±0.0115.33±0.021a9.66±0.015bc51.97±0.0022.593±0.001b2.517±0.003c26.53±0.0289.85±0.01a85.45±0.01c2.13±0.0157.57±0.015ab11.6±0.025cd101.855±0.0012.552±0.003bc2.486±0.002d25.13±0.0289.26±0.01a81.85±0.02d2.55±0.0058.11±0.058b12.58±0.015cd151.823±0.0022.532±0.002bc2.453±0.004d24.57±0.0188.59±0.07b79.50±0.01de3.11±0.0269.54±0.011bc14.77±0.021d201.807±0.0022.504±0.002cd2.436±0.004de24.55±0.0188.26±0.01b77.22±0.03de3.24±0.03010.22±0.055c20.38±0.025de251.806±0.0022.496±0.002cd2.331±0.003de24.53±0.0188.11±0.02bc75.56±0.02de3.32±0.05511.07±0.036c24.89±0.013de301.804±0.022.489±0.001cd2.315±0.003e25.12±0.0287.55±0.01bc72.09±0.01e3.55±0.03412.71±0.022cd25.69±0.033de
2.2.4 总酚含量变化
酚类物质是一类存在于水果、蔬菜等植物体内的多羟基化合物的总称，也是决定果汁抗氧化能力的主要物质之一，2种浓缩方式生产的果汁经过30 d后总酚含量的变化情况如图3所示。
图3 苹果汁贮藏过程中总酚变化规律
Fig.3 Variation of polyphenols in apple juice during storage
在贮藏前期，总酚出现先降低后升高但含量总体呈降低趋势。5～10 d总酚含量略有上升，冰温浓缩果汁10 d达到峰值(50.86 mg/100g)，可能是多酚与果汁中其他大分子结合的非共价键发生变化，促使酚类物质从结合态中游离出来增加了含量[18]，或是贮藏期间蔗糖、有机酸含量降低会提供合成酚类物质的底物，促使总酚含量的升高[19-20]。随着贮藏时间的延长，总酚含量下降，是由于样品中少部分溶解氧所致，这些氧气在贮藏期间通过形成氧自由基而使酚类物质发生氧化导致含量下降[21]。第30天加热浓缩的苹果汁总酚含量(43.72 mg/100g)显著低于冰温浓缩果汁(47.82 mg/100g)。因为酚类物质是热不稳定性的，所以高温可能会使部分酚类物质降解。刘兴辰等[22]发现热处理使萝卜汁的总酚含量显著降低。由于具有显著的抗氧化能力，植物多酚经常参与自由基清除反应以降低生物体的氧化应激，因此多酚含量通常被认为是评估果汁营养价值的一个关键参数。真空加热浓缩处理后总酚含量损失程度达 11.27%，此外，综合2种浓缩方式对比发现浓缩时温度越低多酚降解速率越慢，这与KIM等[23]和TELESZKO等[24]的研究结果一致。
2.2.5 总黄酮变化
如图4所示，真空加热浓缩果汁整个贮藏期之内的黄酮由27.61 mg/100g降到19.14 mg/100g，而冰温浓缩果汁由29.55 mg/100g变为24.51 mg/100g，保留率高达82.94%，变化相对稳定，表明冰温浓缩果汁有利于总黄酮的保留。加热浓缩果汁可能在贮藏期黄酮类物质参与果汁形成沉淀导致变化不稳定[25]。SU等[26]发现由于热处理引起的黄酮类化合物的增加是不稳定的，并且温度越高黄酮类化合物越容易降解。冰温与加热2种浓缩方式中黄酮变化趋势不同的原因可能是黄酮类物质之间的聚合及降解、物质相互转化，以及果汁自身特性原因等。但曾庆帅[27]对荔枝果汁研究表明在25 ℃条件下总黄酮含量先降后升高，总体升高15.6%，因此果汁总黄酮含量的变化规律及机理还有待进一步研究。
图4 苹果汁贮藏过程中黄酮变化规律
Fig.4 Changes of flavonoids in apple juice during storage
2.3 苹果汁贮藏过程抗氧化能力的变化研究
2.3.1 总还原力的变化
苹果汁在贮藏期间总还原能力变化规律如图5 所示。不同浓缩工艺条件下苹果汁初始时刻总还原能力差异显著(P<0.05)，经冰温浓缩复原的果汁与未进行处理果汁的总还原能力接近。冰温浓缩果汁其保留率高到68.61%，相比之下，真空加热浓缩果汁的还原能力仅为51.41%，损失相对严重。
图5 苹果汁贮藏过程中值还原力变化规律
Fig.5 Variation of reducing force during storage of apple juice
果汁随贮藏时间的增加，总还原能力呈下降趋势，处理组间差异显著 (P<0.05)。冰温浓缩果汁总还原能力从最初的0.562 mg/100mL下降到0.411 mg/100mL，保留率为68.61%，加热浓缩汁由0.482 mg/100mL下降到0.308 mg/100mL，保留率为51.41%。整个贮藏期间，相比冰温浓缩处理，加热浓缩苹果汁对的还原能力损失较多可能是温度偏高造成苹果汁中活性成分发生降解，导致还原能力的下降。贮藏15 d后，还原力下降趋势平缓。
2.3.2 DPPH·清除率的变化
各样品对 DPPH·清除效果较好，均在77.00%以上。随贮藏时间的增加冰温条件下的苹果汁对DPPH·清除能力与对照组持平。冰温浓缩果汁、加热浓缩果汁贮藏到第30天的苹果汁对DPPH·清除能力分别为82.81% 和77.09%，冰温浓缩果汁清除效果最好且差异显著(P>0.05)，可能是冰温处理对 DPPH 单电子配对的抗氧化成分在两者中含量差异不大造成的，从而更好地保留活性成分，抗氧化能力会随之减弱缓慢，这与洪梅玲等[28]的研究结果相同。
图6 苹果汁贮藏过程中DPPH·清除率变化规律
Fig.6 Changes of DPPH· clearance rate during apple juice storage
2.3.3 ABTS+·清除率
各样品对ABTS+·清除率如图7 所示。在贮藏期间，浓缩苹果汁对ABTS+·清除率呈下降趋势。由于普通的热力杀菌不能保证将果汁中的内源酶(主要有多酚氧化酶、过氧化物酶、和果胶甲酯酶)完全钝化。加热浓缩过程由于温度相对偏高，使得内源酶氢键加强，蛋白结构发生重排，也可能出现内源酶酶活増强的现象。导致果汁抗氧化性降低。冰温浓缩果汁20 d后清除率趋于稳定。苹果原汁在贮藏30 d发现苹果原汁ABTS+·清除率为2.35，冰温浓缩与加热浓缩果汁分别为2.25和1.95，由此初步判定冰温贮藏有利于果汁的抗氧化性物质的保留。随着加热浓缩时间的延长，果汁抗氧化能力损失明显，其中加热浓缩贮藏30 d果汁的自由基清除率最低。
图7 苹果汁贮藏过程中ABTS+·清除率变化规律
Fig.7 Changes of ABTS+· clearance rate during apple juice
2.3.4 FRAP抗氧化能力
由图8所示，加热浓缩处理的果汁其初始FRAP值2.04 mg/100g显著低于冰温浓缩果汁2.41 mg/100g(P<0.05)。苹果原汁在贮藏30 d后FRAP清除率为1.73 mg/100g，2组浓缩果汁贮藏30 d的FRAP值为1.78、1.19 mg/100g，保留率分别为65.52%、46.25%，冰温浓缩组果汁保留率较高且变化比较明显。加热浓缩果汁贮藏10 d后FRAP值仅为1.83 mg/100g，与冰温浓缩汁2.19 mg/100g相比，降低了13.2%。这可能与浓缩过程温度相关，温度越低越有利于抗氧化活性物质的保存，这与王丽芳等[29]研究贮藏温度对双孢蘑菇抗氧化活性的变化趋势一致。
图8 苹果汁贮藏过程中FRAP抗氧化能力变化规律
Fig.8 Changes of antioxidant capacity of FRAP during storage of apple juice
2.4 抗氧化成分与抗氧化能力 pearson 相关性分析
如表3所示，对不同浓缩方式多酚、黄酮、总抗氧化能力、DPPH·清除率、ABTS+·清除率等参数进行相关性分析，发现多酚含量与总还原力和DPPH·清除率呈极显著的正相关，相关系数分别为0.940，0.881。
表3 抗氧化成分对抗氧化能力相关性分析
Table 3 Correlation analysis of antioxidant capacity.
类别多酚黄酮DPPH·清除率ABTS+·清除率总还原力FRAP多酚1黄酮0.800**1DPPH·清除率0.881**0.873**1ABTS+·清除率0.765*0.893**0.833**1总还原力0.940**0.817**0.865**0.922**1FRAP0.770**0.879**0.899**0.918**0.847**1
注：**表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05)
黄酮与总抗氧化能力、DPPH·清除率、ABTS+·清除率和FRAP抗氧化能力也呈显著的正相关，相关系数分别为0.817、0.873、0.893、0.879。多酚和黄酮是公认的抗氧化物质，它们与抗氧化活性的正相关关系也说明多酚和黄酮是影响苹果汁抗氧化能力的重要因素。总抗氧化能力、DPPH·清除率、FRAP抗氧化能力互相之间也表现出极显著的相关性，说明这3种评价苹果汁抗氧化活性的方法均能有效反映苹果汁抗氧化活性，具有互补作用。贮藏期间抗氧化活性的降低可能与氧化或者酚类化合物的降解有关[30-31]。另外，贮藏过程中，随着总酚的降低，果汁DPPH·清除率随之下降；浓缩时温度越低，DPPH·清除率的下降速度越缓慢，这与李印[32]给出的结果相似。
苹果汁中酚类成分和抗氧化活性物质具有相关性，因为酚类化合物直接有助于抗氧化活性[33]。IDRIS等[34]也证实了酚类含量的测定与样品的抗氧化能力有关。在本研究中， ABTS+·清除活性的降低与FRAP抗氧化能力降低是一致的。DPPH·清除率下降趋势的差异可能是由于食品的抗氧化活性取决于苹果中不同化合物之间的协同和氧化还原相互作用。
3 总结
通过对比冰温浓缩与加热浓缩果汁在冰温条件贮藏的品质变化，表明冰温浓缩果汁可延缓果汁理化性质和多酚含量的下降，对于浑浊果汁而言贮藏期沉淀率有所降低。此外，浓缩过程温度降低，更有利于保持果汁的原有颜色。随着贮藏时间的延长，多酚、黄酮整体呈下降趋势，最终趋于平缓。就浓缩果汁初始时刻各项品质而言冰温浓缩果汁较蒸发浓缩果汁有大幅度提升。进一步对比果汁抗氧化活性差异发现冰温浓缩果汁的总还原能力以及对 DPPH·和ABTS+·的清除能力的保留率更强，抗氧化活性的提高与总酚和总黄酮含量的变化显著正相关(P<0.05)。由此验证冰温浓缩果汁贮藏品质优良，可以促进果汁的商业流通。
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