青稞(Hordeum vulgare Linn.)属于禾本科大麦属农作物，主要分布在西藏、青海、四川等高原地区，是青藏高原地区的主粮品种[1]。有关青稞的研究主要集中在青稞多肽、β-葡聚糖[2]等功能性成分提取，发酵青稞酒[3]，青稞育种[4]等方面。青稞具有“高蛋白、高纤维素、高维生素、低脂肪、低糖”的营养特点，符合当下人们健康的饮食结构[5]。淀粉是青稞主要成分，含量在64%(质量分数)左右，其中支链淀粉含量占70%(质量分数)以上[6]。目前，有关谷物淀粉的报道多集中在淀粉含量、结构及直/支链淀粉比例对淀粉溶解度、膨胀力、糊化特性及加工特性的影响[7-9]，而通过发酵技术改善谷物淀粉品质的研究较少，主要是通过发酵技术来提高谷物类产品的营养品质和感官特性[10-11]。PRANOTO等[12]研究发现，经植物乳杆菌发酵的高粱粉，体外淀粉消化率、峰值黏度和热糊黏度增加，糊化温度降低。因此通过发酵改善青稞淀粉品质，有望进一步提高青稞营养品质及口感。
嗜酸乳杆菌作为益生菌，产酸能力强，耐酸性高，能产生细菌素、乳酸及过氧化氢等物质，抑制胃肠道中有害微生物的生长，且具有多种药理功能[13]。目前嗜酸乳杆菌多用于奶制品、果汁、酵素产品的发酵[14]及微胶囊制备等[15]，由嗜酸乳杆菌发酵的产品不仅口感好，且营养价值相对较高，应用前景相当广阔。有关嗜酸乳杆菌在青稞发酵中的研究较少，由于在发酵过程中其自身代谢产酶能力不足，不能直接利用谷物中大分子营养物质，单独发酵效果不佳[10]。因此，本试验以脱皮青稞粉为原料，通过酵母及嗜酸乳杆菌复合发酵达到改善青稞淀粉理化特性的目的，为青稞类产品的开发利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脱皮青稞，青海新丁香粮油有限公司；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，BNCC138598)，北纳创联生物技术有限公司；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，安琪酵母股份有限公司；直链淀粉含量试剂盒、支链淀粉含量试剂盒，南京建成生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1780紫外可见分光光度计，岛津企业管理有限公司；NDJ-1B旋转黏度仪，上海昌吉地质仪器有限公司；HJ-4A数显恒温多头磁力搅拌器，常州峥嵘仪器有限公司。
1.3 实验方法与设计
1.3.1 菌种活化
菌种活化参照张杰等[16]的方法。
1.3.2 青稞粉发酵工艺
青稞粉发酵工艺流程如下：
脱皮青稞→粉碎灭菌→加无菌水→酵母发酵→乳酸发酵→发酵青稞粉→淀粉提取
将脱皮青稞于粉碎机中打碎后过100目筛，分装于锥形瓶中，在121 ℃灭菌15 min，灭菌后的青稞粉以1∶15(g∶mL)的料液比加入无菌水；接种体积分数3%的活化后酿酒酵母，于28 ℃下恒温发酵2 h；酵母发酵后，接种体积分数5%的活化嗜酸乳杆菌，于37 ℃下恒温发酵1.5 d；利用碱提醇洗法提取淀粉。
1.3.3 单因素试验
在接种酿酒酵母发酵的基础上以直链淀粉含量、支链淀粉含量、淀粉溶解特性及糊化特性为指标，分别考察嗜酸乳杆菌发酵时间(1、1.5、2、2.5、3 d)、发酵温度(27、32、37、42、47 ℃)和接种量(1%、2%、3%、4%、5%)对青稞淀粉品质的影响。
1.3.4 正交试验
为得到发酵最佳工艺参数，在单因素试验基础上，选择发酵时间、发酵温度和接种量为因素，设计L9(34)正交表，以直链淀粉含量和峰值黏度为指标确定最佳发酵工艺条件。因素水平表如表1所示。
表1 复合菌种发酵青稞粉正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermenting highland barley flour by compound strains
水平因素A(发酵时间)/dB(发酵温度)/℃C(接种量)/%11.52712232332.5375
1.3.5 青稞淀粉的提取
参照张慧娟等[17]方法提取发酵前后青稞淀粉。
1.4 主要指标测定方法
直、支链淀粉含量的测定：发酵前后青稞直、支链淀粉含量采用试剂盒法测定。
淀粉糊化特性的测定：参照ZHANG等[18]方法测定。
淀粉溶解特性的测定：参照王佩佩[19]的方法测定。计算如公式(1)、公式(2)所示：
(1)
(2)
式中：S，溶解度，%；B，膨胀力，%；A，烘干后上清液质量，g；W，淀粉干重，g；P，离心后沉淀质量，g。
1.5 数据处理
使用Excel 2010进行数据统计分析。试验结果用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 发酵时间对青稞淀粉品质影响
发酵时间对青稞直、支链淀粉含量的影响如图1所示。随发酵时间的延长，青稞直链淀粉含量呈波动变化趋势，发酵2 d时，青稞直链淀粉含量最低为 8.47%(质量分数)；支链淀粉含量在发酵过程中变化较小，在发酵2 d时支链淀粉含量最高为44.77%(质量分数)。原因可能是，随发酵时间延长，乳酸菌产生的酸性物质积累，抑制微生物自身生长，且酸性条件下代谢酶类影响支链淀粉结构，使部分支链淀粉降解形成直链淀粉[20]。
A-直链淀粉；B-支链淀粉
图1 发酵时间对青稞淀粉含量的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on content of highland barley starch
发酵时间对青稞淀粉糊化性质的影响如图2所示。由图2-A可知，发酵使青稞淀粉起始糊化温度降低，发酵1 d时，起始糊化温度最低为39.33 ℃。由图2-B可知，发酵使青稞淀粉的回生值增大，峰值黏度降低，对崩解值影响较小，在发酵2 d后峰值黏度和崩解值基本稳定。发酵过程中微生物作用使淀粉的无定形区结构破坏，增强与水的结合能力，从而使起始糊化温度和峰值黏度降低[21]。发酵初期，酵母菌首先利用青稞提供的营养物质，使青稞中淀粉含量及结构受到影响。发酵后期，嗜酸乳杆菌较强的产酸能力使微生物在酸性环境中逐渐进入衰亡期，淀粉糊化特性处于稳定状态[22]。这与寇芳等研究结果相似[23]。
A-起始糊化温度；B-黏度
图2 发酵时间对青稞淀粉糊化性质的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on gelatinization characteristics of highland barley starch
发酵时间对青稞淀粉溶解特性的影响如图3所示。由图3-A可知，随发酵时间延长，青稞淀粉的膨胀力增加，且发酵2 d的青稞淀粉在低于90 ℃时膨胀力均高于未发酵的青稞淀粉。由图3-B可知，发酵后青稞淀粉的溶解度明显增大，发酵时间低于1.5 d青稞淀粉溶解度在70 ℃以下时较高，发酵时间为2 d时，青稞淀粉溶解度在80 ℃下较高。原因是酵母菌在发酵过程中产生的酶类使青稞粉中的大分子蛋白和脂肪水解，促进淀粉溶出，使淀粉更易与水结合，使膨胀力和溶解度增大[20]。研究发现直链淀粉和支链淀粉含量同样也会影响淀粉的膨胀力和溶解度[24]，该现象符合前面的研究结果。
A-膨胀力；B-溶解度
图3 发酵时间对青稞淀粉溶解特性的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on dissolution characteristics of highland barley starch
分析发酵时间对青稞淀粉品质的影响可知，发酵时间应控制在2 d。
2.1.2 发酵温度对青稞淀粉品质的影响
发酵温度对青稞直、支链淀粉含量的影响如图4所示。青稞直链淀粉和支链淀粉含量整体上随温度的升高呈先升高后降低的趋势，直链淀粉含量在42 ℃时达到最大值10.99%(质量分数)，支链淀粉含量在32 ℃时达到最大值50.79%(质量分数)。由于温度在升高的过程中逐渐达到微生物生长和代谢酶类的最适温度，使酶类活动增强，影响青稞中直支链淀粉含量。
A-直链淀粉；B-支链淀粉
图4 发酵温度对青稞淀粉含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on content of highland barley starch
发酵温度对青稞淀粉糊化性质的影响如图5所示。由图5-A可知，当发酵温度高于37 ℃时，青稞淀粉起始糊化温度趋于稳定。由图5-B可知，温度对发酵青稞淀粉的回生值影响最大，其次是峰值黏度，对崩解值影响较小。青稞淀粉的回生值在32 ℃达到最高为1 761.67 mPa·s，峰值黏度和崩解值最低，分别为910.00和98.33 mPa·s。发酵温度的升高，使支链淀粉链长和聚合度降低，减小淀粉之间空间位阻，使淀粉的起始糊化温度和峰值黏度降低，同时发酵作用使淀粉降解为小分子的过程中有序结构被破坏，因此回生值增加[25]。
发酵温度对青稞淀粉溶解性质的影响如图6所示。由图6-A可知，当发酵温度低于37 ℃时，青稞淀粉膨胀力在低于90 ℃时相对较高。由图6-B可知，发酵后青稞淀粉溶解度显著升高，在27 ℃的发酵条件下，青稞淀粉在60 ℃时溶解度最高，而发酵温度高于42 ℃时溶解度降低。可见，当发酵温度超过42 ℃时，青稞淀粉的溶解特性较差。
A-起始糊化温度；B-黏度
图5 发酵温度对青稞淀粉糊化性质的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on gelatinization characteristics of highland barley starch
A-膨胀力；B-溶解度
图6 发酵温度对青稞淀粉溶解特性的影响
Fig.6 Effect of fermentation temperature on dissolution characteristics of highland barley starch
分析发酵温度对青稞淀粉品质的影响可得，当发酵温度过高时，青稞淀粉的品质下降，因此发酵温度应控制在32 ℃。
2.1.3 接种量对青稞淀粉品质的影响
接种量对青稞直、支链淀粉含量的影响如图7所示。随着接种量的增加，直链淀粉的含量呈先降低后升高趋势，接种量为3%时达最低值7.79%(质量分数)，支链淀粉的含量整体呈平缓下降趋势。随着接种量增加，微生物生长所需的营养物质需求更高，因此直链淀粉被大量降解。SASAKI等[26]研究发现链长较短的支链淀粉更易被酶解，因此当嗜酸乳杆菌接种量增加时，部分支链淀粉降解并重排形成直链淀粉，使后期直链淀粉含量升高。
A-直链淀粉；B-支链淀粉
图7 接种量对青稞淀粉含量的影响
Fig.7 Effect of inoculation amount on content of highland barley starch
接种量对青稞淀粉糊化性质的影响如图8所示。由图8-A可知，当菌种的接种量超过3%时，青稞淀粉的起始糊化温度保持恒定。由图8-B可知，随着接种量的增加，青稞淀粉峰值黏度呈缓慢下降后上升的趋势，当接种量为4%时，峰值黏度最低为946.67 mPa·s；崩解值随接种量的增加呈波动变化，当接种量超过2%时，崩解值相对稳定；青稞淀粉的回生值变化较小。这可能是由于当接种量超过3%时，发酵底物中的营养物质有限，不利于微生物的生长，因此对结果无较大影响。
A-起始糊化温度；B-黏度
图8 接种量对糊化性质的影响
Fig.8 Effect of inoculation amount on gelatinization characteristics of highland barley starch
接种量对青稞淀粉溶解特性的影响如图9所示。由图9-A可知，当接种量超过3%时，青稞淀粉膨胀力均有不同程度的下降。由图9-B可知，当接种量为3%时，青稞淀粉在60～80 ℃溶解度较大，同样当接种量超过3%时，青稞淀粉的溶解度有不同程度的下降。研究表明直链淀粉的含量与淀粉膨胀力和溶解度呈负相关，溶解度和膨胀力之间呈正相关[27]，这与之前的研究结果一致。
A-膨胀力；B-溶解度
图9 接种量对青稞淀粉溶解特性的影响
Fig.9 Effect of inoculation amount on dissolution characteristics of highland barley starch
由接种量对青稞淀粉品质的影响可知，持续增加菌种接种量并不能更好地改善青稞淀粉的品质，接种量应控制在3%时比较合适。
2.2 正交试验结果
正交试验结果如表2所示。由直链淀粉含量极差分析可知，发酵时间、发酵温度和接种量对青稞直链淀粉含量的影响大小为rA>rC>rB，最优组合为A1B3C3，即发酵时间1.5 d，发酵温度37 ℃，嗜酸乳杆菌接种量5%；各因素对青稞峰值黏度的影响大小为RA>RB>RC，最优组合为A1B1B1，可见对青稞峰值黏度及直链淀粉含量影响最大的因素均是发酵时间，而发酵温度及接种量对2个指标的影响大小不同，且最优组合不同。研究表明，直链淀粉对谷物类产品的口感、质地等有较大的影响，且当直链淀粉含量较高时，峰值黏度相对较低，因此综合试验结果分析选择直链淀粉含量较高的组合作为最优发酵工艺，即发酵时间1.5 d，发酵温度37 ℃，嗜酸乳杆菌接种量5%，此时直链淀粉的含量最高，为10.21%(质量分数)，淀粉的峰值黏度相对较低，为1 063.67 mPa·s。
表2 发酵条件优化正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization
指标试验编号因素水平时间(A)/d温度(B)/℃接种量(C)/%直链淀粉含量(质量分数)/%峰值黏度/(mPa·s)11119.81±0.42856.33±57.27212210.12±1.071 083.33±30.55313310.21±1.181 063.67±109.4142128.22±0.351 116.67±65.0652239.76±0.961 141.67±90.0562319.18±1.161 070.00±78.1073139.15±0.701 091.67±53.4683218.54±0.391 165.00 ±73.6593328.22±0.611 094.33 ±74.27k110.059.069.18直链淀粉k29.069.488.86含量/%k38.649.219.71r1.410.410.85K11 001.111 021.561 030.44峰值黏度/K21 109.441 130.001 098.11(mPa·s)K31 117.001 076.001 099.00R115.89108.4468.56
3 结论
本试验探讨了乳酸菌发酵时间、发酵温度及接种量对青稞直链和支链淀粉含量、糊化特性和溶解特性的影响。青稞粉通过发酵后，直链淀粉含量升高，支链淀粉含量下降，起始糊化温度和峰值黏度降低，回生值升高，对崩解值影响较小，膨胀力和溶解度均升高。通过正交优化试验，得出最佳发酵条件为发酵时间1.5 d、发酵温度37 ℃、嗜酸乳杆菌接种量5%，此时青稞直链淀粉含量为10.21%(质量分数)，淀粉的峰值黏度相对较低，为1 063.67 mPa·s。试验过程中，在发酵前期接种酿酒酵母，使其首先利用青稞中的营养物质进行生长繁殖，为嗜酸乳杆菌的生长提供厌氧条件的同时产生相关的代谢酶类，降解青稞蛋白质和脂肪，暴露出淀粉分子，使青稞淀粉更易降解，利于青稞淀粉品质的改善。嗜酸乳杆菌将产生的低分子糖类转化为酸类物质，降低了发酵青稞粉的pH值，抑制基质中其他微生物生长的同时影响青稞淀粉的相关品质特性。发酵时间、温度和接种量在一定范围内均能够改善青稞淀粉品质，该试验结果对青稞类产品的深加工具有一定的参考价值。
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