白兰地是葡萄经过酒精发酵、蒸馏、橡木桶储藏、调配而成的葡萄蒸馏酒，位于世界六大蒸馏酒之列。而香气则是白兰地质量评价中最重要的标准之一，不同的香气表现，反映了一款白兰地的原料品种、风土条件、酿造工艺等，其决定着白兰地的风格和典型性，所以探究产区白兰地的香气特征一直是白兰地风味研究领域的热点之一。法国[1-3]、德国[4]等国家地区已经对其白兰地的香气特征有了较为深入的研究与分析，而国内对白兰地香气特征的研究近年来也逐渐开展，但是研究大都集中在检测方法的优化[5-6]和成分分析方面[7-8]，我国白兰地区别于其他国家地区白兰地的典型特征香气尚未明晰。
目前，风味研究主要包括仪器和感官分析2个方面。在香气的仪器分析中，一维气相色谱质谱技术是最常见的检测分析方法，而随着全二维气相色谱-飞行时间质谱技术的快速发展，相比于普通的一维气相色谱质谱技术，其有着高峰容量、高灵敏度、检测物质多等优点[9]。对于一些在一维色谱柱上通常会共流出的化合物，可以通过第二根柱子进行再次分离，从而大大改善了峰掩映的问题，目前已广泛应用于酒类香气的研究中。如WELKE等[10]用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱(headspace solid-phase microextraction with comprehsive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectromtry，HS-SPME-GC×GC-TOFMS)鉴别了霞多丽葡萄酒中243种挥发性化合物，同时测定了挥发性化合物的气味活度值和相对气味贡献，发现辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和β-大马酮与其他43种化合物对葡萄酒香气具有较大的贡献潜力；陈双等[11]用HS-SPME-GC×GC-TOFMS在芝麻香型白酒中解析了340种挥发性化合物并首次鉴定11种硫化物和12种萜烯类化合物，对芝麻香型白酒的风味贡献和生理功能的都具有重要意义；张小倩等[12]用HS-SPME-GC×GC-TOFMS比较了4种不同酵母发酵的冰葡萄酒中的挥发性化合物，共解析了156种香气成分，发现不同的酵母对不同种类化合物的代谢具有明显的差异。
感官评价方面，定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)是一种常见的分析方法，其使用一个经过高度训练的评价小组来描述和量化某个产品或者某类产品的感官属性，可以很好的表征产品的特征和属性强度[13]。但是由于时间和人力成本的提高，越来越多的感官实验趋向于简单，快速，准确的感官分析方法[14]。Napping®是一种根据产品相似性对其进行摆放的快速感官分析方法，最早应用于葡萄酒的感官实验中[15]。相比较于QDA，Napping®节省了大量的时间和人力，可以快速获得产品的特定感官属性信息和关键特征的描述概况[16]。如OLIVER等[17]对草莓进行感官测评，对比了Napping®与QDA之间的准确性，发现Napping®结合Ultra Flash Profiling (UFP)，可以达到QDA的近似效果，2种感官分析方法得到的结果具有很好的一致性。
本研究以中国烟台地区和法国干邑地区的白兰地为研究对象，通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS仪器分析和Napping®感官分析相结合，探究不同产区白兰地的香气特征。研究不仅可以丰富我国白兰地的风味化学理论体系，同时对于进一步调控我国白兰地的生产也提供重要的风味导向依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
实验选取了9款白兰地作为样品，均由烟台张裕集团有限公司提供。具体信息如表1所示。
表1 白兰地样品信息
Table 1 Brandy sample information
酒样编号样品产地级别酒度/%vol1张裕可雅白兰地中国烟台VSOP402张裕可雅白兰地中国烟台XO(10年)403张裕可雅白兰地中国烟台XO(15年)404轩尼诗白兰地 法国干邑VSOP405轩尼诗白兰地 法国干邑XO406马爹利白兰地 法国干邑VSOP407马爹利白兰地 法国干邑XO408人头马白兰地 法国干邑VSOP409人头马白兰地 法国干邑XO40
1.1.2 试剂
NaCl(分析纯)，上海国药集团；C7～C30直链正构烷烃、4-甲基-2-戊醇(色谱纯)，Sigma-Aldrich；超纯水。
1.1.3 感官实验材料
40 cm×60 cm的白纸，铅笔，橡皮，上海晨光文具股份有限公司。
1.2 仪器与设备
纯水仪，美国Millipore公司；Agilent 7890B 气相色谱，一维色谱柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司；KT-2001冷喷调制器，美国Zoex公司；Pegasus® 4D 飞行时间质谱仪，美国Leco公司；DVB/CAR/PDMS三相萃取头(2 cm 50/30 μm)，美国Supelco公司；MPS2多功能自动进样系统，德国Gerstel公司；二维色谱柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Restek公司。
1.3 实验方法
1.3.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析
1.3.1.1 顶空固相微萃取(HS-SPME)方法
取0.5 mL白兰地样品，4.5 mL超纯水置于20 mL顶空样品瓶中，加入1.5 g NaCl，10 μL 4-甲基-2-戊醇(质量浓度为103.4 mg/L)作为内标[3]，由MPS2系统进行HS-SPME自动进样。参考实验室之前建立的方法并加以改进，萃取温度50 ℃，样品平衡5 min，萃取45 min，转速为400 r/min。萃取结束后，将萃取头置于GC进样口，在250 ℃下解析附5 min，不分流进样，每个样品重复3次。
1.3.1.2 全二维飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)方法
参考实验室之前建立的方法并做优化[18]。GC×GC条件：起始温度45 ℃保持3 min后，以4 ℃/min升温至150 ℃并保持2 min;以6 ℃/min升温至200 ℃，然后以10 ℃/min升温至230 ℃并保持10 min。第2个烘箱的温度全程保持比一维烘箱高5 ℃。调制补偿温度为20 ℃，调制周期为4 s(热脉冲时间 0.8 s)。样品运行采用恒流模式，载气为高纯He(纯度>99.999 5%)，流速为1 mL/min。
TOFMS条件：离子源电压为70 eV，温度为230 ℃，传输线温度为240 ℃，检测器电压为1 430 V，采集质量数为35～400 amu，采集频率为100 spectra/s。
1.3.2 感官分析
1.3.2.1 感官小组的建立与培训
实验采用自愿报名的方式进行品评员的招募，通过填写问卷的形式，对符合标准(无吸烟史，无过敏史，身体健康，有空余时间)的67人进行基本嗅觉及味觉等感官灵敏度测试，筛选出24人。对选出的24人进行为期1个月(每周1次)的基本感官培训，通过香气识别检验、差别检验、分类标尺使用检验，复筛出15人组成感官小组。对感官小组的15名品评员进行为期3个月(每周1次)定期针对性培训，最终通过香气辨别能力及描述测试，进行后续试验。实验前要让品评员熟悉样品，并了解Napping®及UFP的实验方法。
1.3.2.2 Napping®
将9个白兰地样品放入品评杯中并标注3位随机编码，一次性提供给感官小组品评员。品评员要根据酒样香气特征的相似性及差异性，将样品放置在40 cm×60 cm的白纸上进行摆放。样品间的摆放距离越近，表明样品的相似度越高；样品间的摆放距离越远，表明样品间的差异性越大。当全部酒样摆放完成后，再将样品的对应位置标记圆点，并标注样品编号。以白纸的长和宽作为横轴和纵轴，统计样品位置的坐标信息。
1.3.2.3 Ultra Flash Profiling (UFP)
在品评员完成Napping®后，要求其在每个样品的对应位置旁边写出3～5个具有特征性和典型性的香气描述词。对每个样品香气特征描述词进行归类并统计出现频次。
1.4 数据处理
1.4.1 GC×GC-TOFMS数据处理
白兰地中挥发性化合物的定性：用LECO公司软件ChromaTOF处理试验采集的数据。自动识别信噪比(S/N)>200的色谱峰，然后进行自动解卷积和质谱库(NIST 2014和Wiley 9)比对。运用软件的数据比较功能(statistical comparison)自动匹配相似度(similarity)≥800且3个平行样品中至少出现2次的峰作为该酒样中存在的组分。系统通过同条件下进样的正构烷烃(C7～C30)和样品中化合物的出峰时间，自动计算每个化合物的保留指数(retention index，RI)，经过文献比对，筛选RI相差30的化合物作为最终的定性结果。
白兰地中挥发性化合物的半定量计算如公式(1)所示：
化合物质量浓度
(1)
式中：化合物和内标物质量浓度的单位为μg/L。
1.4.2 感官实验数据处理
采用 R 语言 3.4.3 进行普氏多维向量分析(procrustes multiple factor analysis，PMFA)。
2 结果与分析
2.1 GC×GC-TOFMS分析
2.1.1 白兰地挥发性化合物组分分析
通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析，在中国和法国白兰地中共鉴别出512种挥发性化合物(表2)。其中酯类化合物占21.88%，是鉴别出来的数量最多的一类化合物，也与之前的研究结果相一致[6]。其次是醇类、芳香族和羰基类化合物，分别占15.04%、16.80%、16.21%。
表2 中法白兰地HS-SPME-GC×GC-TOFMS中鉴定的挥发性化合物
Table 2 Volatile compounds identified in Chinses and French brandies by HS-SPME-GC×GC-TOFMS
名称张裕VSOP张裕XO(10年)张裕XO(15年)轩尼诗VSOP轩尼诗XO马爹利VSOP马爹利XO人头马VSOP人头马XO总计酯928498919586889389112醇64526054555871716577芳香族52536762464155765486羰基化合物59586364575359695983萜烯类46374341363441483953含氧化合物25172524251824292436酸17191716141417181824酚类16152112131014181422含硫化合物3354443436含氮化合物4410981612913总计378342409377353319378438374512
醇类是白兰地中一类很重要的香气化合物，主要生成于白兰地的第1次蒸馏过程[2]，表现为果香和花香，可以给酒带来积极的香气特征。而含硫化合物的种类较少，这是由白兰地特殊的生产工艺决定的。其在发酵前不能添加SO2，并且在大多数的白兰地生产时采用铜制的壶式蒸馏器，铜离子可以与硫化物发生反应，因此2次蒸馏后，酒中硫化物会大大减少[19]。
2.1.2 白兰地挥发性香气组分分析
在所有样品中定性出的挥发性化合物中，并非都具有香气特征，风味的研究则更关注具有香气特征的化合物。因此对于已经定性的数据，又通过Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2个香气数据库进行筛选，最终锁定157种具有香气特征地挥发性化合物进行半定量计算，进一步采用单因素方差分析，筛选42种具有显著差异(P≤0.05)的香气化合物，制作热图(图1)。热图分析结果可以看出，中国烟台的白兰地较好的聚为一类，法国干邑的白兰地聚为一类，并且法国干邑地区3款VSOP单独聚为一类，3款XO单独聚为一类，中法白兰地根据化合物的种类和含量具有较为明显的产地及等级特征性。
此外，热图可以将化合物的含量通过颜色的变化直观展现出来。由图1可知，组分A是中国张裕白兰地中质量浓度含量较高的化合物，主要是酯类和萜烯类化合物。酯类物质主要表现为水果香、花香，如庚酸乙酯，丙酸乙酯，壬酸甲酯等。萜烯类化合物主要来源于葡萄果实[20]，橙花醇表现为花香，黄樟醚表现为甜香，而松油醇，β-松油醇则表现为松柏，肉豆蔻的香气。组分B是法国6款白兰地中质量浓度较高的化合物。其中庚酸以蘑菇和生青味为香气特征，MALFONDET等[21]也曾解析出该化合物为法国白兰地中比较重要的香气成分。组分C是张裕XO级别白兰地中浓度含量较高的化合物。其中丁子香酚是橡木桶陈酿的典型产物之一，具有丁香和香料的特征香气，随着陈酿时间的增加，丁子香酚在酒样中的含量也逐渐增加[22]。丁子香酚在相同品牌下XO级别的白兰地比VSOP级别的白兰地含量明显要高，这一结果也与前人研究的结果相一致[22]。
图1 中法白兰地的显著性差异香气组分热图分析和HCA聚类分析
Fig.1 Heat map and hierarchical clustering analysis(HCA) of aroma compounds with a significant difference in Chinese and French brandies
2.2 感官分析
除了化学分析，感官分析也是对白兰地香气评价的一个重要手段，特别是跟化学分析相结合，可以更加全面地认识白兰地的香气特征。LABLANQUIE等[23]采用GC-MS和气相色谱-嗅闻法(gas chromatography-olfactometry，GC-O)相结合，用20个香气描述词建立起了白兰地的香气轮廓；
等[24]运用定量描述分析，绘制了不同白兰地样品的感官图谱并根据香气与风味的平衡程度来评价白兰地的品质，从感官方面研究分析了白兰地的活性芳香物质。
Napping®作为最早应用于葡萄酒中的快速感官分析方法，也被应用于白兰地的感官之中。LOUW等[25]采用Napping®，对白兰地视觉、前鼻香和口腔感觉(包括基本味觉、口感和后鼻嗅)这3种特征进行评估和测试，发现颜色和后鼻嗅的感知与否对小组成员在味觉和口感中的评估并无影响，同时成功地捕捉白兰地之间的口感差异，也为后面白兰地的Napping®感官研究提供了更多的科学依据。
为深入探究中法白兰地的香气特征的差异，本文采用快速感官分析方法Napping®进行实验。在感官数据收集整理后，采用R语言的PMFA算法，对数据进行处理，分别生成评价小组对产品的聚类特征图和香气特征相关性图。由图2可知，中国与法国白兰地明显分为2类，中国烟台的3款白兰地单独聚为一类，主要集中在第4象限；法国干邑的白兰地则聚为一类。其中香料、焦糖、干果、奶油为中国烟台白兰地区别于法国干邑白兰地的主要香气特征。
a-香气特征相关性图；b-聚类特征图
图2 中法白兰地Napping®结合 UFP 的普氏向量分析
Fig.2 Procrustes multiple factor analysis of Napping® with UFP between French and Chinese brandies
3 结论
采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析中国烟台地区和法国干邑地区的9种白兰地，共鉴定出512种挥发性化合物，其中酯类化合物种类最多。通过香气数据库进一步筛选后经过热图分析，结果表明根据香气组分种类和含量差异，可以明显区分中国和法国的白兰地。Napping®结合UFP感官分析结果可以看出，香料、焦糖、干果、奶油是中国烟台白兰地区别于法国干邑地区的主要香气特征。本研究丰富了我国白兰地的风味化学理论体系，也为进一步开展我国白兰地的风味研究提供借鉴依据。
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