产酯酵母及其产酯关键酶的研究进展

彭立影1,刘功良1*,费永涛1,余洁瑜1,刘锐1,白卫东1,王莉嫦2,贾爱娟3

1(仲恺农业工程学院 轻工食品学院, 广东 广州,510225)2(广州鹰金钱食品集团有限公司,广东 广州,510655) 3(广东美味鲜调味食品有限公司,广东 中山,528437)

摘 要 产酯酵母是一类产酯类物质的微生物,在食品发酵行业中具有重要作用。该文综述了产酯酵母的选育方法,比较了总酯测定方法的优缺点,总结了酵母菌产酯关键酶及其编码的基因,对产酯酵母在食品发酵工业中的发展趋势进行了展望,为产酯酵母在食品发酵工业中的应用提供一定理论依据。

关键词 产酯酵母;选育;关键酶;发酵食品

产酯酵母是一类可产酯类物质的酵母菌。产酯酵母大多属于汉逊酵母(Hansenula),少数属于球拟酵母属(Torulopsis),具有较强的氧化特性和产酯能力。产酯酵母在发酵过程中产生醇类、酯类、酸类、烷烃类、芳香烃类、酮类等,这些物质含量各异,构成了不同酵母菌的独特发酵香气,已应用于白酒、葡萄酒及调味品等食品发酵行业中。

近年来,国内外对产酯酵母酯类物质的合成研究逐渐成为发酵食品行业的重要领域,产酯的关键基因和关键酶不断被深入挖掘。深入研究产酯酵母的产酯机制,能更好提高产品的品质,丰富产品口味。本文对国内外产酯酵母筛选及其产酯合成关键酶进行综述,以期为食品发酵行业发酵菌株的选择及合成酯类化合物提供一定的理论依据。

1 产酯酵母的种类

产酯酵母对发酵产品的风味具有重要作用,可改善风味、提质增香。目前,国内外已报道的高产酯酵母菌有鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyes rouxii)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)等。

1.1 毕赤酵母属

毕赤酵母属(Pichia)又为汉逊酵母属(Hansenula)。毕赤酵母是一类需氧性酵母,其细胞呈圆形或椭球形,多边芽殖,每个子囊含有1~4个表面光滑的子囊孢子。毕赤酵母在有氧条件下,可利用葡萄糖等碳源高密度发酵,在白酒、葡萄酒中均有发现该类酵母可产酯类物质,提高产品质量。于洋等[1]将霞多丽葡萄中分离得到的发酵毕赤酵母(P. fermentans)YF-19进行纯种发酵,采用气相色谱测定挥发性物质,发现该酵母产乙酸苯乙酯的能力最强。SYLVESTER等[2]筛选出17种非酿酒酵母并将其应用于啤酒发酵第1阶段产生风味酯和酚类化合物,发现毕赤酵母(P. kluyverii)可增加乙酸异戊酯(水果味、香蕉味),且所有的毕赤酵母属菌株可产生高浓度的乙酸乙酯。ZHANG等[3]从大曲中筛选出1株毕赤酵母(P. manshurica),并将其运用于醋中发酵,显著提高酸和酯的产量,使其具有浓郁的果味和浓郁的奶油和坚果味,从而提高醋的品质。陈嘉等[4]从传统山西老陈醋中分离出1株毕赤酵母(P. scaptomyzae),该菌株产乙酯类物质含量高,且低产高级醇。毕赤酵母与酿酒酵母在白酒酿造中进行混合发酵,可显著增加乙酸乙酯的含量,改善白酒的风味物质含量。这些研究结果可说明,将毕赤酵母运用于酒类发酵中可增加酒体中的酯类物质,丰富产品风味。

1.2 假丝酵母属

假丝酵母属(Candida)是一类通过出芽繁殖,可形成假菌丝、不产子囊孢子的酵母菌,其细胞形态呈球形、椭圆形、长条形等。假丝酵母发酵能力弱、可直接同化淀粉,在白酒、米酒、酱油、果酒中产风味物质。假丝酵母中可产酯类物质的主要有间型假丝酵母(C. intermedia)、热带假丝酵母(C. tropicalis)、克鲁斯氏念珠菌(C. krusei)、光滑假丝酵母(C. glabrata)等。平常假丝酵母(C. inconspicua) 菌株发酵苹果汁,可产生多种酯类物质,显著改善苹果汁发酵风味[5]。假丝酵母因自身可合成甘油,对高盐环境具有很强的耐受性。在酱油发酵后期,加入假丝酵母可显著提高酱油中挥发性风味物质如酯类、醇类等。冯杰[6]研究了耐高盐增香酵母——埃切假丝酵母(C. etchellsii)CICIM Y0600的代谢特性,系统性分析了其在酱油中的增香作用,发现该菌株的添加可提高酱油中的4-乙基愈创木酚和HEMF等典型风味物质。

1.3 其他酵母菌

产香酵母的类群多,目前在发酵行业中已有应用的有数十种。酱油发酵中,其产香酵母主要为鲁氏接合酵母(Z. rouxii)和球拟酵母(Torulopsis),具有优良的耐盐性能,对酱油特殊风味的形成具有重要的作用。球拟酵母属在酱香型白酒中已被广泛应用,且该类酵母的酯分解能力低,有利于酯类物质的合成。扣囊复膜酵母(S. fibuligera)和多株伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)在酱香型白酒固态发酵中可产大量的酯类和醇类等[7]。产酯酵母在酒类行业的应用,可以增酯降醇,提升酒的质量。酵母在发酵过程中,可通过代谢和自溶,参与风味物质的生成,丰富了酒体的香气,如有孢汉逊酵母(H. uvarum)、鲁氏接合酵母(Z. rouxii)等。葡萄中存在不同种类的产酯酵母,如耐热克鲁维氏酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、汉逊酵母(H. guilliermondiiH. evarum)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)等。由以上研究可知,产酯酵母对发酵食品的香气成分具有巨大的贡献。产酯酵母种类增加,可改善发酵食品的风味。

2 产酯酵母的选育

2.1 产酯酵母产酯能力的检测

产酯酵母所产酯类物质的种类较多,在初筛或选育过程中,通常以总酯含量为检测指标。筛选产酯酵母总酯测定中,指示剂法有皂化中和法、静置皂化法和微波皂化法。陆振群[8]利用皂化中和法测定发酵的豆芽汁培养基中总酯含量,从酒曲中筛选出1株高产酯酵母S8。待测溶液的颜色及浑浊程度对常规方法终点的判断具有较大的干扰,电位滴定法是通过电位pH值确定滴定终点,可避免此缺点。杨盛春等[9]采用自动电位滴定法测定3类6种酒中总酸与总酯的含量,对比国标法测定结果吻合度较好。该方法不仅操作简便,且精密度和准确度较好。

在分析测定还原糖类较高的酒类总酯含量中,还原糖对总酯的测定具有较强的干扰。在碱性条件和水浴加热下,葡萄糖会发生歧化、羟醛缩合等反应生成葡萄糖酸等羧基化合物,消耗一定的NaOH,从而影响总酯的测定[10]。同时,葡萄糖在强碱性条件下形成双键,在不同位置的烯醇式双键与碳链断裂分解为醛,醛聚合生成树脂状物质(羟醛缩合反应)使溶液变黄,从而影响指示终点的判断。微波皂化法在白酒和陈醋总酯测定中的应用已有相关报道。在微波作用下,发酵液中的酯类物质与碱的皂化反应在温度较低(<65 ℃)的条件下也可进行。微波的快速热效应可加快皂化反应,高效测定总酯含量。

指示剂法测定总酯较为繁琐,在检测大批样品时,需耗费大量的时间和水电资源用于回流。气相色谱法可减少工作量,降低能耗,但其定量酯需要各种标样定量。刘千等[11]采用气相色谱法测定229份原酒中4种主要乙酯含量的同时,计算样品中总酯含量。结果表明,对比GB/T 10345—2007标准测定方法,测定的总酯含量无明显差异;该方法具有快速、准确的优点。

表1 总酯测定方法优缺点
Table 1 The advantages and disadvantages of total ester determination method

方法优点缺点作者气相色谱法操作简便,结果准确未能测定全部的酯类成分;分析耗时长;仪器复杂、成本高刘千等[11]、TIAN[12]近红外光谱法简便、快捷、低成本、无污染及不破坏样品;检测一个样品约30 s仪器复杂、成本高;谱峰重叠、信号较弱不利于定量YE等[13]比色法操作简便、快速、节能需已知样品乙酸乙酯含量,只在0~500 μg有良好的线性关系LÖBS等[14]皂化回流法操作简便,总酯含量较为准确加热回流装置每次只能处理1个样品,耗时长;在高温下,葡萄糖在碱性条件下发生歧化等反应易新华[10]微波皂化法检测效率高皂化过程中沸腾具有一定的危险性张春杰等[15]静置皂化法节约水电,操作简便,适用于大批量检测分析时间长、受环境影响卢亭等[16]电位滴定法操作简便,精密度和准确度好耗时长杨盛春等[9]

2.2 自然选育

从酒曲、酒醪、酱油、豆瓣酱等传统发酵食品中可筛选产酯效果好的野生型菌株。从自然界微生物中筛选理想菌种的主要步骤为采集菌样→富集培养→纯种分离→性能鉴定。罗小叶等[17]通过可培养方法从酱香大曲中分离出1株主产果香味的酵母菌株,对其进行菌种鉴定生理生化特性分析,确定该菌株为扣囊复膜酵母(S. fibuligera)。ZHANG等[3]用孟加拉红培养基从大曲固态发酵酒醅中分离出19株酵母菌,通过产酯发酵培养基筛选出1株高产酯酵母菌株Y14,鉴定为盔状毕赤酵母(P. galeiformis)。以Y14强化大曲为发酵剂,在实验室规模发酵的蒸馏酒及醋具有浓郁的香气及悠长的口感。由于酯类物质极不稳定,蒸发快,GARAVAGLIA等[18]提出了一种简便、高效、快速的顶空-固相萃取法直接从萃取瓶中快速筛选产酯酵母。由于自然突变频率低,仅靠自然选育对于筛选优势菌种具有很大的局限性,这限制了产酯酵母的来源和使用。

2.3 诱变育种

诱变育种是微生物育种的主要方法之一,也是选育大多数优良高产菌株的首选方法。李锐利[19]采用原生质体紫外、化学、复合及再生诱变育种手段,对酒曲中分离筛选出的高产乙酸乙酯酵母菌株进行改造,提高了其产酯性能和耐温性能。陆振群[8]采用紫外照射,对酒曲中筛选得到的1株高产酯酵母S8,通过杜氏发酵管产CO2体积及发酵总酯测定筛选得1株优良菌株Y16,其发酵产总酯量可达3.21 g/L,诱变后产酯总量提高了75.28%。王春玲等[20]采用紫外及甲基磺酸乙酯诱变和原生质体融合筛选出1株耐盐性(质量浓度>180 g/L)酿酒酵母,有效提高了乙酸乙酯、乙醇、乳酸乙酯等风味物质的含量。尽管诱变育种可提高基因突变频率,但长期使用诱变剂处理菌株,会使菌株产生“疲劳效应”,同时影响菌种的生长代谢,不利于食品的发酵。

2.4 原生质体融合育种

原生质体融合是将遗传性状不同的2个细胞的原生质体进行融合, 以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。采用原生质体融合技术将性状优良的菌种进行融合,从而获得性状更好的菌株,是选育优良菌种的新途径。YE等[21]以苹果酒中分离出的克鲁斯氏念珠菌(C. krusei)PF14和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WF1为亲本菌株,通过超声波处理制备原生质体,紫外灭活法和热灭活法使原生质体失活,利用原生质体电融合构建了新的酵母杂交菌株R4,该菌株可用于发酵苹果汁,改善苹果酒的香气及风味多样性。林小江等[22]将低产甲醇酿酒酵母(S. cerevisiae)灭活的双亲单倍体原生质体与生香酵母进行融合,得到1株低甲醇与高产酯的酿酒酵母融合菌株。原生质体融合虽可突破种属限制,但所获得的融合子的遗传稳定性较差,常发生分离回复的现象,导致性能退化,并且原生质体融合后DNA交换和重组随机发生,缺乏遗传标记,增加了重组体分离筛选难度。

2.5 基因工程育种

随着现代分子生物技术的发展,利用基因工程选育具有优良性状的菌株已取得较大的进展。过表达产酯基因及敲除水解酶基因,可提高酯的生成。葛峻伶等[23]发现,敲除BAT2基因的同时过表达Lg-ATF1基因的重组菌株S5-Lg与亲本菌株相比,乙酸乙酯生成量提高了26.81%,同时,异丁醇和异戊醇皆下降近10%。CRISPR-Cas系统是操作细菌、酵母和人类细胞基因组简单高效方法的基础。LÖBS等[24]通过设计RNA聚合酶Ⅲ杂合启动子,将酿脓链球(Streptococcus pyogenes)中的CRISPR-Cas9系统应用于马克斯克鲁维酵母(K. marxianus),影响酵母菌细胞中乙酸乙酯和乙醇的合成。CRISPR-Cas9是一种RNA引导的DNA核酸内切酶,它利用RNA-DNA碱基配对来靶向外源目标基因。然而,CRISPR-Cas9系统的主要局限在于脱靶效应。为解决该问题,LI等[25]采用核酸内切酶I-SCEI的表达,建立了一个快速高效的系统,加快了白酒酿酒酵母无缝缺失的进度和效率。该研究在TEF1启动子控制下过表达PTEF1-ATF1-TPGK1基因片段中的ATF1基因,并将该片段插入氨基酸转氨酶中BAT2基因缺失的菌株中,构建BAT2基因缺失、ATF1基因过表达酵母菌Hα5。通过与亲本菌株比较,菌株Hα5乙酸乙酯浓度高出34.84倍。基因工程育种技术操作方法复杂,设备昂贵,且外源基因的安全性一直备受争议,但基因工程育种存在多方面的优势,如定向性明确,遗传稳定,基因工程改造可为选育产酯优良的酵母和改善发酵食品风味提供一定思路和参考。

3 酵母菌产酯的关键酶

酯类物质合成主要通过3个途径,包括酯化反应途径、醇酰基转移酶途径和醇脱氢酶途径。非酿酒酵母可生成多种醇类、醛类和酯类等香味物质。深入研究产酯酵母的产酯关键酶,有助于更好地阐述产酯酵母机制并促使其应用。目前,普遍认为是酵母菌在发酵过程中利用葡萄糖,经糖酵解(embden-meyerhof-parnas-pathway,EMP)途径代谢生成乙醇和乙酸,而后在酯酶的作用下生成乙酸乙酯。酵母胞内酶和胞外酶都具有酯化能力,且在酯化过程中,酵母可以通过酯酶的逆反应生成酯类物质。酒类中的酯类物质主要分为两大类,一类是乙酸酯,主要由醇乙酰基转移酶(alcohol-O-acetyltransferase)催化底物乙酰辅酶A和乙醇生成;一类是脂肪酸乙酯,主要由醇酰基转移酶催化相应的酰基辅酶A和乙醇合成。在白酒酿造微生物中,乙酸乙酯的生成主要由底物乙酰辅酶A(acetyl coenzyme A,acetyl-CoA)、乙醇浓度和醇乙酰基转移酶活性决定。酯类物质合成途径如图1所示。

图1 酯生成途径
Fig.1 The formation pathway of esters

3.1 乙酰辅酶A

酿酒酵母细胞中,乙酰辅酶A是含量最丰富的酰基辅酶A,分布于细胞核、细胞质、线粒体、过氧化物酶体等不同的亚细胞区域。丙酮酸代谢支路(pyruvate dehydrogenase,PDH旁路途经)是乙酰辅酶A主要形成途径,其次在线粒体中经丙酮酸脱氢酶途径形成,少部分由ATP直接激活乙酸经转酰基酶形成。在PDH旁路途径中,乙酰辅酶A合成酶(acetyl coenzyme A synthetase,ACS)是合成乙酰辅酶A的关键酶,由基因ACS1和ACS2编码。ACS1对酵母细胞中以非葡萄糖为碳源的代谢具有重要作用,缺氧和高浓度葡萄糖可抑制其表达;ACS2是酿酒酵母利用葡萄糖为碳源进行生长和繁殖所必需的基因[26]。酿酒酵母细胞中,过表达ACS1和ACS2可提高乙酰辅酶A含量。

有学者发现,泛酸激酶(pantothenate kinase,panK)中的pank基因也可促进酯类物质的生成。泛酸激酶是辅酶A生物合成途径中的关键调节酶,同时补充辅酶A前体泛酸,使得细胞内辅酶A和乙酰辅酶A水平升高。VADALI等[27]在此基础上,研究发现同时过表达ATF2基因和pank基因比仅过表达ATF2基因的菌株产乙酸异戊酯含量多6倍。CAB2基因编码磷酸泛酸半胱氨酸连接酶。在泛酸到辅酶A的代谢途径中,CAB2基因的表达可影响辅酶A的合成。DONG等[28]构建工程菌株,过表达基因CAB2ACS2ATF1,最后乙酸乙酯含量均有所提高。

乙酰辅酶A水解酶(acetyl coenzyme ahydrolase,ACH)由ACH1基因编码,参与细胞内acetyl-CoA的调节,催化acetyl-CoA水解为乙酸和HSCoA。郑楠等[29]通过敲除ACH1基因降低acetyl-CoA的降解,过表达ACS1ACS2基因得到工程菌株乙酸乙酯的生成量分别比亲本菌株提高26.12%和23.70%。有研究报道,乙酰辅酶A水解酶在葡萄糖的环境下受到抑制。PLATA等[30]研究了葡萄糖和氧对酿酒酵母酒精发酵生产乙酸乙酯和乙酸异戊酯的影响,同时测定乙醇乙酰转移酶和酯酶在体外的活性,发现葡萄糖浓度只影响AATase的最大活性,而氧对AATase的最大活性有轻微的抑制作用;酯酶仅在低或中等葡萄糖质量浓度(50或100 g/L)下催化乙酸乙酯的合成,并在固定生长期对乙酸异戊酯达到最大水解活性,在葡萄糖质量浓度为250 g/L和半厌氧条件下,培养基中乙酸乙酯和乙酸异戊酯的质量浓度最高。

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)系统对脂肪酸乙酯的合成具有重要作用[31]。乙酰辅酶A羧化酶可将乙酰辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A,脂肪酸合成酶复合体将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化为脂肪酰基辅酶。同时,乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸生物合成中的关键酶及限速酶,脂肪酰基辅酶可转化为游离脂肪酸。研究表明,脂肪酸合成基因如ACC1FAS1FAS2在转录水平受肌醇介导的负调控基因OPI1所抑制。CHEN等[32]利用酿酒酵母代替霉菌、细菌和产香酵母来提高己酸乙酯的产量,过表达ACC1FAS1FAS2基因的同时缺失OPI1基因,构建了3株重组菌株α5-ACC1ΔOPI1、α5-FAS1ΔOPI1和α5-FAS2ΔOPI1,发现重组菌株在浓香型白酒中能显著提高己酸乙酯的产量,且重组菌株α5-FAS1ΔOPI1也能提高乙酰辅酶A的含量。

3.2 醇酰基转移酶

醇酰基转移酶(alcohol acyltransferase,AAT)的活性是酯类合成的决定性关键因素。醇乙酰基转移酶主要由基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1编码,催化酵母中乙酰辅酶A和乙醇结合,生成乙酸酯。在acetyl-CoA含量增加的基础上,增强醇乙酰基转移酶的活性,可促进乙酸乙酯的生成。研究表明,过表达ATF1基因可显著提高乙酸乙酯的含量,且Lg-ATF1基因的作用弱于ATF1基因[33]。VERSTREPEN等[34]将实验室菌株及商业酿造菌株中敲除或过表达ATF1、Lg-ATF1和ATF2,通过顶空色谱和气相色谱-质谱联用技术对酯的形成进行监测,结果表明,ATF1和ATF2的表达水平对乙酸乙酯和乙酸异戊酯的形成有较大影响。基因ATF1和ATF2的表达可生成低挥发性酯如乙酸酯类,且基因ATF1和ATF2可调控其他醇酰基转移酶活性。同时缺失ATF1和ATF2基因的菌株不形成乙酸异戊酯,表明编码醇乙酰基转移酶的ATF1和ATF2基因共同调控酵母细胞内异戊醇转移酶的活性。ATF1的活性还受蛋白激酶Sch9p和蛋白激酶A(protein kinase,PKA)的调控,参与应激反应和营养传感信号通路[35-36]

氨基酸是发酵中的重要原料。酵母中高级醇的生物合成是由支链氨基酸(branched-china amino acid,BCAA)代谢途径中用于降解氨基酸的α-酮酸中间体合成。酵母中的BCAAs通过Ehrlich途径的转氨作用转化为α-酮酸。支链氨基酸分解代谢的第一步和限速步骤分别由BAT1BAT2编码的线粒体和胞质支链氨基酸转氨酶催化。BAT2缺失对高级醇的形成有显著影响。LI等[37]揭示了醇乙酰基转移酶基因(Lg-ATF1ATF2ATF1)过表达与BAT2缺失的相互关系,发现过表达ATF2且缺失BAT2的菌株可以显著增加酯的生成和降低酒精浓度,过表达ATF1且缺失BAT2的菌株能更大程度上进一步提高酯醇比,而Lg-ATF1过表达对酯和高级醇的生成没有影响。

酿酒酵母中的EHT1EEB1基因也可编码醇酰基转移酶,是合成中链脂肪酸乙酯的关键基因。李锋等[38]对酿酒酵母醇己酰基转移酶基因EHT1进行了过表达,发现过表达EHT1基因能提高酿酒酵母产酯性能,特别是对产己酸乙酯有显著作用。KRUIS等[39]在酵母中发现一个新的醇乙酰基转移酶家族Eat1,该酶在所有产乙酸乙酯的酵母中都存在编码基因序列,确定了Eat1是酵母合成乙酸乙酯的关键酶。在K. marxianus中,酯的合成可能是由乙醇与乙酰辅酶A通过ATF1活性缩合,也可能通过EAT活性缩合[23,40]。LÖBS等[41]研究EAT1作为酯生物合成的主要生化途径,并创建了一系列具有酯生物合成假定活性的基因敲除来确定和控制细胞内的定位,发现敲除EAT1的菌株其乙酸乙酯的生物合成几乎被消除,且乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯的合成量减少了88%。SAERENS等[42]评估了EHT1EEB1基因编码的醇酰基转移酶在体外的性能,发现对脂肪酸乙酯的合成及水解都具有酶活性。但通过构建过表达EHT1EEB1基因菌株,发现脂肪酸乙酯的合成并未显著增加。SAERENS等[43]再次研究,发现乙酯水平的变化不能用EEB1表达水平的差异进行解释,并且中链脂肪酸乙酯合成的主要限制因素并不是合成酶的活性,而是脂肪酸前体的含量。

3.3 醇脱氢酶

醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)是一类含锌或含铁的醇脱氢酶,可将醛或酮还原为醇,氧化半缩醛化合物,催化生物体内醇代谢。半缩醛是由醇和醛混合物形成的,在半缩醛羟基被氧化后,形成酯,该反应以NAD(P)+为氢受体。酿酒酵母ADH具有多种半缩醛脱氢酶活性,用于合成甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯和乙酸乙酯。ADH产生酯的机理基于半缩醛与仲醇的结构相似性,对体内酯的产生具有重要作用。在酿酒酵母中编码ADH的基因是adh1-adh7,ADH特异性决定了某些(高级)醇可用于酯的形成。因此,ADH可能对酵母的产酯有间接且显著的影响。

早有研究表明[44],染色体中缺失基因ADH1ADH2与缺失基因ADH1的酿酒酵母对比,前者酵母的乙酸乙酯生成量显著降低,但敲除ADH2的菌株产生乙酸乙酯的积累量没有变化。可见,基因ADH1可影响酿酒酵母中乙酸乙酯的合成。刘港等[45]用植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1构建L-乳酸酵母菌株,显著提高了乳酸乙酯的产量。YURIMOTO等[46]从波氏假丝酵母菌中克隆得到醇脱氢酶,由CbADH1CbAdh2CbAdh3基因编码,并通过基因干扰实验表明波氏假丝酵母菌中甲酸甲酯的合成由胞质基因ADH1控制。VANRIJSWIJCK等[47]研究Cyberlindenera fabianii 65、P. kudriavzevii 129和S.cerevisiae 131体外醇脱氢酶和醇乙酰转移酶的活性,发现它们与酯的形成没有相关性。相比之下,这3种酵母的乙酸酯水解酶活性与乙酸酯产量呈明显的负相关。如何在酯的合成和水解中达到平衡,使得酯的净积累量达到需要的目标,是下一步研究的重点方向。

3.4 水解酶

酯在合成的过程中发生酯的水解。早有研究发现,由IAH1编码的酶负责酯的水解。ATF1过表达和IAH1断裂突变菌株可显著提高黄酒中乙酸酯的含量,降低异戊醇的含量[48]。SCHNEIDERBANGER等[49]对德国小麦啤酒生产中最常用的5种小麦啤酒酵母菌株的乙酸酯生产能力进行测定,探讨小麦啤酒酵母在一次发酵过程中的基因表达,发现基因ATF1ATF2IAH1在初级发酵期间4 d内的表达水平与乙酸酯的形成紧密相关。大多数酵母菌株在24~48 h 出现了ATF1的表达,酯的产量也在增加。在同一时期,乙酸异戊酯和乙酸乙酯合成的同时也发生降解,IAH1的表达也在增加。IAH1N-末端附近具有明显的GDSL序列模体和4个保守的序列块,这是SGNH水解酶的一个特征,SGNH水解酶是水解酶/脂解酶的一个亚家族。IAH1的晶体结构在其催化三联体中有一个Ser12/Asp187/His190序列和2个残基,即Gly53和Asn83,它们充当稳定反应中间体的氧阴离子孔。Ser12位于b1末端的拓扑开关点,是亲核分子和氧阴离子空穴的第3个质子供体。His190作为一个碱基,通过去质子化羟基使活性位点Ser12更亲核。这一结构特征符合SGNH水解酶的亲核/酸/His规律。MA等[50]确定了由IAH1基因编码的酶的晶体结构,发现在底物结合区有一个额外的C-末端参与了同二聚体的形成,这种额外的C-末端限制了活性位点的进入,并且在确定底物特异性方面起着重要作用。可见,C-末端的缺失提供了更好的途径进入酶的活性位点,使得它能够容纳更长的酰基链。

4 结论与展望

非酿酒酵母主要产香、产酯等香味物质,对于改善白酒、啤酒、酱油等发酵食品的风味具有重要作用。酵母本身理化性质存在一定差异,在不同的环境中会呈现不同的特点,可筛选出具有特殊能力的产香酵母,应用于发酵食品、调味品等领域中。研究酵母菌的产酯过程及关键酶可为菌株选育及发酵食品风味的改善提供借鉴依据。在后续的研究工作中,一方面可进一步探究编码酯类合成关键酶的其他基因。另一方面,可将酯类物质合成中编码关键酶的基因整合到其他菌株基因组中,构建新的发酵菌株,从而提高酯类物质的含量。多项研究表明乙酸酯的合成很大程度取决于ATF1ATF2的表达,影响其表达的细胞因子都是调节乙酸酯合成的潜在靶点。同时,国内外对酯类物质的研究主要在于酯合成上,而在最终发酵产物中,对于酯水解的研究较少,如何在酯合成和水解之间找到平衡点,也是潜在的研究方向。

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Research progress of ester-producing yeast and its key enzymes for esters synthesis

PENG Liying1,LIU Gongliang1*,FEI Yongtao1,YU Jieyu1,LIU Rui1,BAI Weidong1,WANG Lichang2,JIA Aijuan3

1(College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China) 2(Guangzhou Eagle-coin Food Group Co., Ltd., Guangzhou 510655, China)3(Guangdong Delicious Fresh Seasoning Food Co. Ltd., Zhongshan 528437, China)

Abstract Ester-producing yeast is a kind of microorganism that can produce ester substances, and it plays an important role in food fermentation industry. In this paper, the breeding methods of ester-producing yeast were reviewed, the advantages and disadvantages of total ester determination method were compared, and the key enzymes and genes of yeast for esters synthesis were discussed. The screening and development trend of ester-producing yeast in food fermentation industry were also prospected. This paper provides theoretical basis for the application of ester-producing yeast in food fermentation industry.

Key words ester-producing yeast;breeding;key enzymes;food fermentation

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024198

引用格式:彭立影,刘功良,费永涛,等.产酯酵母及其产酯关键酶的研究进展[J].食品与发酵工业,2020,46(14):275-282.PENG Liying,LIU Gongliang,FEI Yongtao, et al. Research progress of ester-producing yeast and its key enzymes for esters synthesis[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(14):275-282.

第一作者:硕士研究生(刘功良副教授为通讯作者,E-mail:gongliangliu@126.com)

基金项目:广东省重点领域研发计划项目(2018B020206001);广东省2019年省级农业科技创新及推广项目(2019KJ101);国家重点研发计划专项(2018YFC1604105)

收稿日期:2020-04-15,改回日期:2020-04-23