红曲色素，是利用微生物发酵大规模生产的成功典范[1-2]。其中红曲红色素的生产及应用已经相当成熟[3-7]。近年来，人们对红曲黄、橙色素的研究正在不断深入，这包括对红曲黄、橙色素发酵、分离纯化及定性、定量检测方法的研究[8-13]。
红曲色素的分离、定性及定量检测工作，难度极大。原因是，首先，红曲发酵的色素产品，皆是多种色素与发酵基质残余物的混合物，纯色素的制备难度大。其次，红曲色素种类繁多[14-15]， 已有94种红曲色素被报导，其中有44种黄色素，8种橙色素以及42种红色素[16]。而且这些色素的分子结构式相近，采用一般的方法无法纯化，故定性及定量也就困难重重。色素含量的检测方法，国内外有研究者[17-18]曾经使用过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)法或色素的质量浓度法进行定量测定，但这需要预先获得纯色素，工作量巨大。
红曲产业界普遍采用分光光度计法，在特定波长下检测色素萃取物的OD值，计算色素的色价，并以色价值的大小作为色素含量高低的依据。例如，国家标准中，红曲红是在505 nm下检测；红曲黄在466～486 nm检测[19-21]。天然红曲黄色素，往往又在320～420 nm下测定。如果样品中含有众多红曲色素，分光光度计的检测方法也有缺陷，即在固定的波长下检测色价值，并不能精确地反映色素的种类及定量。因为众多色素的特征波长的数据还未测定过；而且多种色素混合物的扫描图谱中，峰值所对应的波长会发生移动。只有对高纯度的色素样品，才能用分光光度计法进行精确的定性和定量。诚然，用制备型高效液相色谱和质谱联用的方法可以彻底解决问题。但这也需要大量的分离纯化工作及高端仪器为依托。ZHENG等[22]的文献报道，采用HPLC-FD/PAD和MS联用的方法，研究红曲产品指纹特征性物质，据称检测到8种已知色素产品(红、橙色素各2种，黄色素4种)，还有2个未知产物。用该法可以确定色素的分子量，显然对于物质定性是有极大帮助的，但有不少红曲色素物质尚未分离纯化，其分子结构式未知，峰值波长也不确定，用HPLC法还是不够的。
本研究采用紫色红曲菌W-2发酵液为研究对象，采用板层析分离及分光光度计扫描检测相结合的方法，对红曲色素进行初步的分离定性和定量的研究，试图找出一种简单而实用的橙、黄色素的定性及定量检测方法，为进一步研究红曲色素的特性打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
紫色红曲菌W-2，由江南大学提供；红曲发酵液，由100 L机械搅拌通风罐生产，发酵液中包含菌体且富含各种色素，外观呈橙黄色。如图1所示。乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸，皆为分析纯。
1.2 仪器与设备
TGL-16M离心机,湖南湘仪；UV1600紫外-可见比例双光束分光光度计；P-1型 (200×200) cm层析缸,垒固科技有限公司；层析板：60 F254，25 Aluminium sheets (20×20) cm TLC 硅胶,Merck公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵液的萃取和离心分离
在发酵液中加入其体积15%的脂溶性萃取剂，离心分离，8 000 r/min，20 min；离心后发酵液分为上层相、中间层与水相3个不同层次。
1.3.2 用分光光度计检测红曲色素的特征波长及色价
色价定义为单位质量(g)或单位体积(mL)的色素样品，用合适的溶剂萃取并稀释后，在分光光度计中，用1 cm比色皿，在一定波长下测得的吸光度值(OD)乘以其稀释倍数。色价单位分别是U/g或U/mL。
上层萃取相色素：取上层相1 mL，加49 mL无水乙醇萃取色素，8 000 r/min，离心10 min后，用无水乙醇稀释后在300～600 nm扫描，确定波峰所对应的波长，并计算萃取相色价。
中间层色素：同上层相的方法。
下层水相色素：用移液枪，取离心管下层水相2 mL置于50 mL比色管中，用无水乙醇稀释，8 000 r/min，10 min离心后在300～600 nm扫描，确定波峰值所对应的波长，并计算下层水相色价。
色价的计算如公式(1)、公式(2)所示：
上层/中间层萃取相色价/(U·mL-1)=ODmax×总稀释倍数
(1)
式中：引入萃取相体积/水相体积这个系数，是要将萃取相中的色价统一折算为水相的色价。
水相色价/(U·mL-1)=ODmax×总稀释倍数
(2)
1.3.3 色素萃取液的薄层层析分离方法
乙醇萃取的色素样品，用毛细管点样，层析板置于层析缸中展开，展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=7∶3∶1(体积比)。层析板(20×20) cm,展开后，溶剂前沿离层析板顶端2 cm左右时取出层析板，记录展开剂前沿的位置，将板晾干后在可见光下观察。比移值(Rf值)计算方法如公式(3)所示：
Rf值
(3)
2 结果与分析
2.1 发酵液及其离心处理
红曲发酵液外观如图1所示。发酵液稀释后，用分光光度计在300～600 nm扫描，扫描图谱如图2所示。发酵液黄色素的最高色价 531 U/mL(406 nm)；橙色素色价(466 nm)439 U/mL。从图2中的2个波峰对应的波长可看出，色素中主要含有黄色素和橙色素。
图1 紫色红曲菌W-2发酵液外观
Fig.1 Fermentation broth of Monascus purpureus W-2
图2 发酵液乙醇提取物的分光光度计扫描图
Fig.2 Scanning curve of ethanol extract of fermentation broth
在发酵液中加入脂溶性萃取剂(占发酵液体积的15%～30%)，离心后，呈现上、中、下三相。如图3所示，上部为萃取剂层，色素含量高，为非水溶性色素；下层为水相层，所含色素主要是水溶性色素；中间层含有菌体，其中夹杂有大量的色素。
图3 发酵液离心后的分层情况
Fig.3 Three phases are shown in the fermentation broth after centrifugation
注：上层为萃取相；下层为水相；中间层为菌体及其所含的色素
图4分别是上层萃取相、中间层和下层水相用乙醇稀释后液体的外观。从其颜色来看，上层相的和下层相的乙醇稀释液呈黄色，中间层的则呈橙色。
图4 上层萃取相、中间层和下层水相用乙醇稀释后的外观
Fig.4 Diluted solution of the three phases with ethanol
2.2 三相色素300～600 nm可见光范围内的扫描图及其特征
发酵液离心分离后所展示的3个层相，分别取样，用乙醇萃取或稀释后，用分光光度计在300～600 nm进行扫描，如图5所示。
图5 红曲色素提取液在300～600 nm的扫描图
Fig.5 Scanning curves of the ethanol extracts of the pigments from the three phase
注：水相层峰值波长，332 nm； 中间相层峰值波长408、468 nm；萃取相层峰值波长，391、468 nm
由图5可知，上层萃取相层色素的波峰对应波长是391 nm，说明是黄色素；在468 nm处有一转折峰，说明萃取相中有少量橙色素；在中间层，2个峰所对应波长分别是408和468 nm，色价几乎相同，说明中间层相中主要是黄色素和橙色素。下层水相中主要是黄色素，但其波峰所对应波长是332 nm，该色素和上层相及中间层的黄色素有所不同；在468 nm处，有一转折峰，说明水相中也有少量橙色素；据图5扫描图中的3条曲线，可以初步认为，发酵液中至少有3种黄色素：其波峰所对应波长分别在332、 391和408 nm。发酵液中也有橙色素，其特征吸收峰所对应的波长在468 nm处，而且橙色素主要分布在中间层。
图5所显示的3种红曲色素提取液在300～600 nm的扫描图谱的峰值所对应的特征波长，进一步证实了图4所显示的3种红曲色素提取液外观颜色。依据色素产品的外观颜色及扫描图形特征，可以大体上判断其色调的类型(红、黄、橙、紫等色调)，即对色素的色调进行初步定性。但从外观颜色及扫描图均无法准确得知是哪种色素。
2.3 色素萃取液的板层析分离
用板层析法对图3所示的三相色素提取液进行了展开。同时做了1种红曲米萃取液。如图6所示,条带1的上层萃取相和条带2的中间相的色素条带很多，橙、黄、红三类色素都有，但主要是橙色素和黄色素。条带3的下层水相主要是黄色素，但相对含量均较低，下层水相中没有红色素，但有水溶性橙色素(未上移)。红曲米的萃取液中含有大量的红色素或紫红色素条带，同时含有橙、黄色素。
纵观层析板上的色带，紫色红曲菌W-2发酵液中至少有橙色素10种，黄色素13种。图6所示的上层萃取相的色素种类最多，在可见光下其肉眼可见的色素条带至少有20种;中间层相的色素条带至少有13种；上层萃取相和中间相，相对含量较多的是2种橙色素，即编号为21和23的色素条带，其Rf值分别为0.604和0.642(表1)。
1-上层萃取相色带； 2-中间层相色带;3-下层水相色带；4-红曲米萃取液色带
图6 红曲色素的板层析
Fig.6 Thin layer Chromatography of the Monascus pigments
表1 色素板层析分离的有关数据
Table 1 Rf values of the pigments in the thin layer chromatography
条带颜色颜色深浅距离/cmRf值编号萃取相中间相水相古田红曲米萃取相中间相水相古田红曲米1红色+0.6-2黄色+0.9-3红色+1.21.20.075 -- 0.075 4黄色+1.35- 0.085 --5红色+++++1.65--- 0.104 6黄色+++2.052.052.052.050.129 0.129 0.129 0.129 7红色+++++2.3--- 0.145 8黄色+++2.72.72.70.170 0.170 0.170 -9红色+3.15- 0.198 --10橙色+3.90.245 ---11橙色+4.30.270 ---12黄色+4.454.45-- 0.280 0.280 13黄色+4.74.70.296 0.296 --14橙色++5.80.365 ---15黄色++6.40.403 ---16橙色+6.80.428 ---17黄色++7.37.30.459 0.459 --18黄色++7.77.70.484 0.484 --19橙色+8.20.516 ---20黄色+++9.19.19.19.10.572 0.572 0.572 0.572 21橙色+++++9.69.60.604 0.604 --22黄色++9.8--- 0.616 23橙色+++++10.210.20.642 0.642 --24橙色+++11.111.111.10.698 0.698 - 0.698 25黄色+++11.811.80.742 0.742 --26橙色++12.212.20.767 0.767 --27黄色+1312.40.818 -- 0.780 28橙色+13.50.849 ---29黄色+140.881
注：“+”越多代表颜色越深
3 结论
根据上述实验结果，可以得出以下结论：
(1)无论是固态还是液态发酵，红曲菌产生多种色素。有水溶性色素，更多的则是油溶性色素，本实验紫色红曲菌的发酵液中含有较丰富的黄色素，其次是橙色素，大多是醇溶性。
(2)当色素稀释后可根据肉眼观察色素的颜色，并初步判断其色调(红、橙或黄色)。
(3)根据可见光300～600 nm光谱扫描图的特征，可大致区别色素的种类，并可以对色素的相对含量作出计算，但严格来说想要用分光光度计法来进行准确的定性和定量检测，是不够的。
(4)板层析法可以直接观察到样品中色素的类型(色调)及其种类，并可计算其比移值，从而对每一种色素进行初步的定性，并对每一种色素的相对含量作出评估。
(5)板层析法和分光光度计法相结合，也许是目前对色素进行初步定性及定量的较简便实用方法。
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