玉米是一种营养价值很高的粮食作物，含有丰富的氨基酸、维生素、纤维素以及钙、镁、锌、铜等微量元素[1]，堪称“五谷之首”[2]，据统计，全球有1/3人口以玉米作为主食[3]，但是玉米中缺乏赖氨酸和色氨酸，营养结构不均衡，同时玉米中缺乏面筋蛋白，淀粉被蛋白质包裹，不易形成网络结构，导致玉米粉口感粗糙、黏弹性差、柔韧性差、不易形成面团、易失水龟裂，这极大限制了玉米粉的加工及应用[4-5]。为改善玉米营养及加工方面的缺陷，利用微生物发酵技术改良玉米粉品质的加工技术受到广泛关注。许梅等[6]利用4种不同的乳酸菌发酵玉米粉，使玉米粉的黏度、保水力、凝胶特性等加工特性得到改善；刘红艳等[7]利用双孢菇(Agaricus bisporus)固态发酵玉米，淀粉、总糖等大分子物质被降解，含量降低，氨基酸种类更丰富，蛋白质营养价值提高；REYES等[8]研究了米曲霉(Aspergillus oryzae)固态发酵对玉米粉物理化学性质的影响，随发酵时间延长，淀粉的理化性质发生了很大的变化。前人研究结果表明，经过微生物的发酵作用可以使淀粉颗粒变小，充分暴露，糊化温度和糊化时间均有一定提高。发酵改性玉米粉制作的玉米面团更加柔软，且弹性、内聚性、胶着性、延展性、拉伸耗能、拉伸阻力以及拉伸比等方面均有明显提高，使得发酵改性玉米面团具有更好的加工性能，更适合于加工成各类面制品[9]。然而，目前发酵玉米所用的菌种主要是酵母菌和乳酸菌，利用食用真菌进行玉米发酵鲜有研究。
猴头菌(Hericium erinaceus)是一种药食两用真菌，富含多糖、低聚糖、萜类、甾体类等功能活性成分，具有良好的抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、保肝护肝、降低血糖和血脂的作用[10]。有研究发现，猴头菌接种玉米固体培养基，可提高淀粉降解率，提高蛋白中赖氨酸和色氨酸含量，提升玉米的营养价值[11-12]。然而，未见菌粮营养及加工特性的系统研究。
因此，本实验以玉米为原料，研究经过猴头菌固体发酵后得到的玉米猴头菌菌粮，在营养成分，氨基酸评分、淀粉结构以及加工特性方面的变化，以期为食用菌发酵改良玉米淀粉技术的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 实验材料
农大猴头 Hericium erinaceus,北京吉蕈园科技有限公司；黄玉米、郑单958，中国农业科学院种子公司。
1.1.2 实验试剂
马铃薯肉汤葡糖糖培养基(potato dextrose broth，PDB)，北京奥博星生物技术有限责任公司；浓盐酸、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、浓H2SO4、乙醇、甲醇、苯酚、香草醛-冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醚等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；淀粉试剂盒、直链淀粉试剂盒、支链淀粉试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
AB265-S十万分之一电子天平，瑞士梅特勒托利多公司；SKY-200B摇床，上海苏坤实业有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；RS-FS1401研磨机,荣事达公司；Spark多功能微孔板检测仪，瑞士Tecan公司；DK-S22恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；MCR-301流变仪，奥地利Anton Paar有限公司；H2050R高速冷冻离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；DSC-Q200差示扫描量热仪，美国TA仪器公司；GZX-9076MBE鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 实验方法
1.3.1 菌粮制备
1.3.1.1 菌种活化
称取35 g PDB培养基于锥形瓶中，加入1 000 mL蒸馏水，充分搅拌使其完全溶解，用4 mol/L的HCl滴定至pH为4.5，121 ℃高压灭菌30 min，冷却至室温备用。在无菌条件下，用接种环从斜面菌种上轻轻刮取1～2环，接种到液体培养基中，并摇晃均匀。在25 ℃下，140 r/min摇床培养3～4 d。
1.3.1.2 玉米固体培养基的制备
将玉米清洗干净，沸水浸泡2 h，加入质量分数为3%的葡萄糖，0.2%的MgSO4·7H2O，0.1%的KH2PO4，30%去离子水。121 ℃高压灭菌2 h，冷却至室温。
1.3.1.3 固态接种
在超净工作台中，用移液枪吸取的活化菌种，按5%～10%的接种量接种到固体培养基上，并搅拌均匀，放入恒温培养箱中25 ℃培养。
1.3.1.4 菌粮制备
待菌丝长满后取出，50 ℃烘干磨粉，过60目筛，得到玉米猴头菌菌粮。
1.3.2 菌粮营养成分测定
1.3.2.1 粗纤维的测定
粗纤维含量采用GB/T 5515—2008介质过滤法测定[13]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有粗纤维的质量。
1.3.2.2 膳食纤维的测定
膳食纤维含量采用GB 5009.88—2014酶重量法测定[14]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有膳食纤维的质量。
1.3.2.3 粗脂肪的测定
粗脂肪含量采用GB 5009.6—2016索氏抽提法测定[15]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有粗脂肪的质量。
1.3.2.4 碳水化合物的测定
碳水化合物采用ASTM E1758—2001(2007)高效液相色谱法测定[16]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有碳水化合物的质量。
1.3.2.5 灰分的测定
灰分含量采用GB 5009.4—2016高温马弗炉法测定[17]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有灰分的质量。
1.3.2.6 蛋白质的测定
总可溶性蛋白质含量采用GB 5009.5—2016凯氏定氮法测定[18]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有蛋白质的质量。
1.3.2.7 维生素含量的测定
维生素含量采用高效液相色谱法测定[19-23]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有的维生素的质量。
1.3.2.8 氨基酸的测定
氨基酸含量采用GB 5009.124—2016氨基酸分析仪测定[24]，所得数据为每100 g菌粮干粉中含有氨基酸的质量。
1.3.2.9 氨基酸评分
氨基酸评分(amino acid score，AAS)参考BANO等[25]的方法，计算每克玉米及菌粮蛋白质中，某种必需氨基酸的含量占FAO/WHO评分模式中该氨基酸含量的百分比，即为AAS。
1.3.3 菌粮淀粉结构测定
淀粉、支/直链淀粉采用淀粉、支/直链淀粉试剂盒测定，所得数据为每单位菌粮干粉质量含有的百分比。
1.3.4 菌粮加工特性
1.3.4.1 黏度的测定
黏度的测定参考赵志浩等[26]的方法，样品经105 ℃干燥至恒重，冷却至室温，称取 20 g，加入80 mL 80 ℃热水，玻璃棒缓慢搅拌至均匀，制得质量分数为20%的淀粉糊。使用装备40 mm直径铝平板夹具的AR-1500ex流变仪，设置夹具与样品台的间距为 1 mm，温度25 ℃，角频率范围0.01～200 rad/s。取适量样品于样品台上，静置10 min，操作流变仪下压夹具，并移除夹具边缘溢出的样品，启动程序进行测定。
1.3.4.2 水溶性指数(water solubility index,WSI)和吸水性指数(water absorption index,WAI)
参考ANDERSON等[27]的方法并稍加改进。准确称取2.5 g样品，置于100 mL离心管中，加入去离子水30 mL，适当混匀至所有样品浸润，275 r/min振摇30 min，然后3 000×g离心15 min，分离上清液和沉淀物。上清液倒入预先干燥至恒定质量的铝制扁形称量瓶中，105 ℃蒸发至恒定质量。WSI和WAI的计算如公式(1)、(2)所示。
(1)
(2)
1.4 数据处理
每个试验至少进行3次平行操作，试验结果以平均值表示。采用SPSS 20.0软件进行显著性分析，以P<0.05 表示差异显著，采用Origin 9.0作图，Excel 2019做表。
2 结果与分析
2.1 菌粮营养成分分析
如图1所示，相比于发酵前的玉米，菌粮中总膳食纤维含量降低了15.4%，粗纤维和不溶性膳食纤维含量分别降低了23.9%和20.0%，由于这2种物质不易被人体消化吸收,会阻碍消化酶与食物接触，降低肠道对小分子营养物质的利用率，因此经过发酵，菌粮中的营养物质更易被人体消化吸收，利用率更高，同时也改善了玉米粉的适口性；与未发酵的玉米相比，菌粮中可溶性膳食纤维含量提高了15.7%，菌粮具有更高的生物活性，对预防心血管疾病、糖尿病以及抗肿瘤的作用更强；菌粮蛋白质的含量减少了23.5%，可能是由于发酵过程中猴头菌分泌的多种酶对蛋白质发生不同程度的降解，使大分子蛋白部分降解为小分子蛋白或多肽以及氨基酸等[29]，导致与蛋白质结合的淀粉颗粒得到释放，纯化了淀粉分子，使菌粮的亲水性和凝胶性得到改善[9]；同时粗脂肪含量减少了50.4%，而碳水化合物和灰分含量没有显著变化(P>0.05)。
图1 玉米及菌粮中的营养成分含量
Fig.1 Nutrients in corn and fungus fermented cereal(FFC)
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
刘红艳等[7]研究表明，食用菌在发酵过程中能够产生α-淀粉酶、纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶，将谷物中的大分子物质水解为小分子物质。化雪艳等[28]分别用猴头菇、金针菇和平菇固态发酵杜仲，发现3种食用菌对杜仲叶渣和杜仲皮的半纤维素、纤维素和木质素均有显著的降解作用(P<0.05)，与本实验结果相似。
2.2 菌粮维生素含量分析
玉米中VC、VE含量高，但是缺乏VB1,VB1摄入不足易得脚气病。国内在乳酸菌产B族维生素方面的研究有报道，其中有研究表明[30-32]定植于肠道中的益生菌能产生维生素B1、B2、B6等各种维生素；常若毅等[33]研究发现10种乳酸菌在发酵鲜牛乳以及5种蔬菜时均能产生维生素B1和B6；FIELDS等[34]利用米曲霉、大肠杆菌、酵母菌等混合发酵玉米粉时，得到了玉米粉中VB1、VB2以及VB3含量显著提高的结果(P<0.05)，但是食用菌发酵谷物对维生素的影响却鲜有研究。如表1所示，经过发酵以后，玉米中缺乏的VB1在猴头菌粮中含量很高，VB2、VB3的含量也显著提高(P<0.05)，表明利用食用菌对谷物进行发酵也能达到增加维生素种类，提高维生素含量的效果。
表1 玉米及菌粮中维生素含量 单位：mg/100 g
Table 1 Vitamin content in corn and FFC
分析物VCVB1VB2VB3VB6VE玉米5.17±0.03a未检出(<0.12)0.72±0.015b10.23±0.36b0.48±0.01a3.08±0.02a猴头菌粮5.09±0.025b0.61±0.08a1.50±0.07a11.74±0.16a0.45±0.005b1.60±0.05b
注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.3 菌粮氨基酸评分
表2为玉米和菌粮中氨基酸评分与FAO/WHO推荐值的比较，由此看出，发酵后的菌粮中蛋白质的氨基酸评分均明显高于未发酵的玉米。发酵前，只有亮氨酸的评分大于100，赖氨酸的评分只有27.84，低于FAO/WHO推荐值，为第一限制性氨基酸，第二限制性氨基酸为色氨酸，氨基酸组成比例不均衡，营养价值较低；发酵后，菌粮中异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸的评分均高于100，赖氨酸评分提高到58.16，所有必需氨基酸评分均高于FAO/WHO推荐值。蛋白质的营养价值不仅取决于蛋白质的含量，还与氨基酸的种类、必需氨基酸的组成及比例、限制氨基酸的最低含量等有关[35]。AAS值越接近100，食物蛋白与人体蛋白越接近，蛋白质的营养价值也就越高[36]。以上结果说明接种猴头菌发酵，弥补了玉米中赖氨酸不足的缺陷，菌粮中氨基酸含量更加丰富，蛋白质的氨基酸构成比例更合理，营养价值更高。
表2 玉米及菌粮氨基酸评分比较
Table 2 Comparison of amino acid scores of corn and FFC
必需氨基酸FAO/WHO推荐值玉米中氨基酸含量/(mg·g-1蛋白质)AAS猴头菌粮中氨基酸含量/(mg·g-1蛋白质)AAS异亮氨酸4032.1580.3845.80114.5亮氨酸70104.60149.43131.12187.31赖氨酸5513.9227.8431.9958.16蛋氨酸+半胱氨酸3512.4835.6615.0643.03苯丙氨酸+酪氨酸6059.5099.1774.65124.42苏氨酸4025.4363.5833.2583.13缬氨酸5036.4772.9445.1790.34色氨酸102.8828.807.5375.30
2.4 菌粮淀粉结构分析
经过发酵以后，菌粮的营养成分发生了很大的变化，其本质是玉米粉内部分子结构的变化[9]。如图2所示，发酵后，菌粮中淀粉质量分数由86.58%下降到70.66%，直链淀粉质量分数由32.59%上升到50.11%。刘红艳等[7]利用双孢菇固态发酵玉米，发现淀粉含量从 57.64 g/100 g 降到 49.93 g/100 g，与本实验结果一致。猴头菌在发酵玉米的过程中产生的α-淀粉酶，使淀粉分子发生水解，这一过程主要发生在支链淀粉的长链部分[11,37]，使其分解为直链淀粉或者葡萄糖等小分子物质，导致支链淀粉含量减少，直链淀粉含量升高。研究表明[38]，发酵使淀粉破碎、颗粒变小、相对分子质量减小、直链淀粉含量上升,一部分支链淀粉在微生物的作用下断链和脱支，支链淀粉含量下降。REYES等[8]在用米曲霉固态发酵玉米粉时发现，随着发酵时间的延长，直链淀粉与支链淀粉的比例呈现先下降后上升的趋势，前期下降是因为直链淀粉链结构更简单，更易于酶解，后期支链淀粉短链脱支，转化为直链淀粉，使其比例升高。淀粉的结构以及支链、直链淀粉的比例是加工特性提高的主要原因，研究发酵前后玉米粉淀粉结构的变化对研究其加工特性的变化具有十分重要的意义。
图2 玉米及菌粮中的淀粉结构物质含量
Fig.2 Contents of starch structural substances in corn and FFC
2.5 菌粮加工特性分析
2.5.1 黏度
糊化淀粉表现出的表观黏度在很大程度上取决于沥滤淀粉链的链长和分枝度[39]。玉米及菌粮在不同剪切速率下的黏度如图3所示，剪切速率在1～100 s-1，未发酵的玉米面在剪切速率最小时黏度最大，发酵后菌粮黏度在剪切速率6.31 s-1时达到最大值。同时，菌粮的黏度在任何剪切速率下均低于未发酵玉米粉，表明猴头菌发酵会使玉米粉黏度降低。这可能是由发酵后淀粉结构改变以及蛋白质含量降低导致，使菌粮粉具有更好地冲调特性，适宜作为代餐粉等产品的配料。REYES等[8,40]分别用米曲霉和酵母菌对玉米淀粉进行发酵，发现随发酵时间的延长，玉米淀粉黏度与未发酵相比呈显著降低趋势(P<0.05)，分析原因为淀粉酶水解使淀粉链部分断裂，玉米粉凝胶强度减弱，黏度降低。
图3 不同剪切速率下玉米及菌粮黏度变化
Fig.3 Viscosity changes of corn and FFC at different
shear rates
注：同一曲线上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
2.5.2 WSI和WAI
WSI和WAI分别反映淀粉的持水性和大分子降解程度[41]。吸水性指的是淀粉的吸水膨胀能力。如表3所示，经过发酵以后，菌粮的水溶性显著提高(P<0.05)，吸水性显著降低(P<0.05)。研究表明，蛋白质是主要的吸水位点[42]，同时，淀粉的吸水膨胀能力与淀粉支链、直链的比例也有很大关系[9]。发生上述变化的原因可能是蛋白质在发酵过程中被水解为小分子物质，吸水能力降低，另外发酵产生的α-淀粉酶使部分淀粉分子降解，小分子糖类等可溶性物质含量增加，淀粉结构被破坏，直链淀粉含量升高，从而抑制了淀粉的吸水膨胀能力，使淀粉吸水和持水性能下降[26]。RICHARD等[43]对谷物的支链、直链淀粉和脂类对淀粉吸水膨胀能力的影响做了研究，发现吸水膨胀是支链淀粉的特性，而直链淀粉会对其产生抑制作用。经发酵后，菌粮中淀粉含量降低，颗粒结构松散，大分子物质被降解为小分子亲水性物质，水溶性提高，菌粮粉在水中更易分散；吸水性降低，菌粮粉形成凝胶的能力下降，使其在水中不易结块，易于冲调，这与2.5.1中黏度变化规律相符，证明发酵可改善玉米粉的冲调特性。
表3 玉米及猴头菌粮WSI、WAI值
Table 3 WSI，WAI of corn and FFC
分析物WSI/%WAI玉米8.56±0.18b3.15±0.03a猴头菌粮16.23±1.34a2.74±0.07b
3 结论
随着经济发展和人们生活水平的提高，以及亚健康人群的增多，更多的人开始注重健康饮食，减少精白米面的摄入，以五谷杂粮代替，弥补膳食纤维、维生素等摄入不足。玉米作为“五谷之首”，深受居民的青睐，但是由于玉米中粗纤维含量高，使营养物质难以吸收，同时赖氨酸、色氨酸含量低，导致其营养结构不均衡，利用率低。
与玉米原粮相比，经猴头菌固态发酵玉米后得到的玉米猴头菌菌粮，粗纤维和不溶性膳食纤维的含量显著降低，可溶性膳食纤维的含量显著升高，玉米中缺失的硫胺素，核黄素和烟酸的含量也显著提高，色氨酸、赖氨酸含量增加，营养结构更加均衡。同时淀粉颗粒变小，直链淀粉增多，黏度降低，水溶性提高，吸水性降低，加工特性得到改善。本研究为谷物营养和加工特性改善及开发新型食用菌配料提供了理论依据。
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