切达干酪是世界上销量最大的硬质干酪，在国际干酪贸易中占很大比例[1]。切达干酪的品质和质量很大程度上取决于成熟过程中所形成的风味物质[2]。切达干酪的成熟是一个漫长且复杂的过程，时间从2个月到36个月不等[4]。干酪在成熟过程中，在一定的温度、湿度、pH值、水分及盐含量等条件下，蛋白质、脂肪及碳水化合物在微生物和酶的作用下分解，发生一系列复杂的生化反应，形成干酪特有的风味、质地和组织状态[3]。由于成熟时间对化学组分具有较大的影响，成熟度在切达干酪特征香气和风味的发展中起着至关重要的作用[5]。
JOYNER等[6]发现，随着干酪成熟时间的增加，蛋白水解的程度也相应增加，干酪的质地变脆。KARAMETSI等[7]发现，随着成熟期的延长，苦味肽增加，这些苦味肽主要来自β-酪蛋白C端区域的84～89和193～209。目前，对于不同成熟期切达干酪进行全成分、系统性分析以及通过确定成熟期及其特征的风味化合物来评估干酪品质的研究较少。
本研究以成熟期为6、12、24和36个月的市售切达干酪为研究对象，通过对不同成熟期切达干酪进行组分、氨基酸组成和挥发性风味物质及感官品质的比较分析，旨在阐明不同成熟期切达干酪的关键风味物质及特征，对不同成熟期切达干酪风味品质进行客观、准确的判别，为下一步加速切达干酪成熟及成熟产物特征提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金凯利白切达干酪(成熟期6个月)、成熟切达干酪(成熟期12个月)和陈年切达干酪(成熟期分别为24和36个月)，京东自营超市；无水醋酸钠、冰乙酸、三氯乙酸、磷钨酸、K2SO4、CuSO4、NaOH、正己烷、甲醇等,分析纯，永大化学试剂有限公司；海砂,分析纯，北京科奥科技有限公司；2-甲基-3-庚酮,色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司;C7～C40正构烷烃,色谱纯，美国Supelco公司。
1.2 仪器与设备
DELTA320型水浴锅，梅特勒-托雷多公司；KXL-1010型消化炉，北京思贝得研究所；KDY-9830型全自动凯式定氮仪，上海洪纪仪器设备有限公司；DELTA320型pH计，梅特勒-托雷多公司；气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪及电子轰击离子源，美国Agilent公司；固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)头(50/30 μm DVB/CAR/PDM)、色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm),美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 干酪基本成分的测定
水分含量的测定：参照GB 5009.3—2016[8]。脂肪含量的测定：参照GB 5009.6—2016[9]。干酪的蛋白质含量测定：参照GB 5009.5—2016采用凯氏定氮法[10]。干酪中的盐分含量采用硝酸银-硫氰酸氨法测定[11]。用pH计测定干酪的pH值。
1.3.2 干酪游离氨基酸含量测定
参照GB/T 5009.124—2016测定[12]。
1.3.3 干酪风味物质的测定
参考穆硕等[14]的方法，采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)与气相色谱质谱仪技术(GC-MS)测定干酪风味物质。GC条件：DB-WAX色谱柱,初始温度40 ℃，以3 ℃/min升至120 ℃，恒温保持2 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，恒温保持2 min；进样口温度230 ℃，载气为氦气,流速1 mL/min，不分流。MS条件：四极杆温度150 ℃；电子轰击(electron impact，EI离子化模式)离子源温度230 ℃。
定量分析：通过添加内标化合物2-甲基-3-庚酮(0.816 mg/L)在GC-MS上采集到的信息，根据半定量法计算各不同成熟期干酪的挥发性风味物质含量。
定性分析：根据质谱、保留时间(retention time,RT)、保留指数(retention index,RI)以及相关文献和网站(www.flavornet.org)鉴定挥发性的风味化合物，将文献报道的RI值与实际计算得出的RI值进行比较，选择RI值较接近的鉴定结果。其中，样品RI值为化合物和正构系列烷烃在同样的色谱和质谱条件下,通过保留时间按公式(1)计算得到。
(1)
式中：RIs，样品RI值；RTs，样品保留时间；RIn，正构烷烃Cn保留时间；n，碳原子个数。
1.3.4 干酪感官品质的评价
采用描述性感官分析法对干酪样品进行感官评价。参考DRAKE[15]的方法，首先由10名专业感官评定员品尝干酪样品，从干酪风味的角度，以不同的参照物作为其打分高低的依据，记录各个干酪的描述性感官评分。分数区间为0～5分，其中，“0分”代表没有风味特征，“5分”代表有最强的风味特征，以此为标准对不同成熟期切达干酪进行描述性感官评价。
1.3.5 数据统计与分析
每组实验3次平行，实验数据取平均值，采用Origin制图和SPSS 21.0软件进行分析，数值以“平均数±标准差”表示，以P<0.05作为判断标准描述差异显著性，运用SIMCA-P软件对挥发性风味物质含量进行主成分分析。
2 结果与分析
2.1 干酪的基本成分分析
不同成熟期(6、12、24、36个月)切达干酪的水分、蛋白质、脂肪、盐分和pH值测定结果如表1所示。
表1 不同成熟期切达干酪的基本成分
Table 1 Basic components of cheddar cheese at different maturity stages
成熟时间/月水分/%蛋白质/%脂肪/%盐分/%pH635.88±0.33a25.69±0.34a33.92±0.24a1.71±0.42a5.21±0.03d1235.69±0.12b25.18±0.28b33.02±0.17b1.70±0.26a5.29±0.02c2434.65±0.24c24.83±0.47c32.39±0.45c1.70±0.46a5.31±0.04b3634.12±0.28d24.50±0.31d32.08±0.16d1.70±0.45a5.34±0.02a
注：同一列内不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
由表1可知，不同成熟期切达干酪的水分、蛋白质、脂肪含量和pH值有显著性差异(P<0.05)，盐分含量无显著差异(P>0.05)。随着成熟时间的延长，由于蛋白质和脂肪的水解，蛋白质、脂肪的含量逐渐降低。在干酪成熟初期，乳酸菌活力较高，将干酪中乳糖发酵为乳酸，导致pH值较低；随着成熟时间的延长，乳糖水解逐渐减弱，蛋白质水解加剧，
大量增加，导致pH值逐渐升高。盐的主要作用是防腐、提供Na+来源、赋予风味等，在成熟过程中不发生化学变化。实验结果与HAILU等[16]研究得到的结果是一致的。
2.2 干酪中游离氨基酸含量分析
由图1可见，随着干酪成熟时间的延长，游离氨基酸含量显著增加(P<0.05)，主要增加的游离氨基酸是亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)，这一结果与LUO等[17]研究的结果相一致；其中亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)这4类氨基酸被用作衡量切达干酪成熟度的标志[18]。
支链氨基酸(亮氨酸Leu，异亮氨酸Ile，缬氨酸Val)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸Phe，酪氨酸Tyr，色氨酸Trp)以及含硫氨基酸(蛋氨酸Met，半胱氨酸Cys)是风味化合物的前体物质，对干酪风味的形成至关重要[19]。在支链氨基酸中，Leu经过转氨酶生物合成及Strecker降解产生3-甲基丁醛，赋予干酪坚果风味[20]。在芳香族氨基酸中，Phe可以经过Strecker降解产生苯乙醇和苯乙醛，会产生涩感和苦味。在含硫氨基酸中，Met经过Strecker降解产生二甲基砜，产生椰子味和奶油味[21]。部分游离氨基酸在成熟过程中含量处于动态平衡中，原因可能是乳酸菌产生的脱氨酶、脱羧酶、转氨酶及一些转氨基酸侧链的酶将所产生的氨基酸转化为胺和2-酮酸等[22]。
图1 不同成熟期切达干酪中游离氨基酸含量
Fig.1 Content of free amino acids in cheddar cheese
at different maturity stages
2.3 干酪风味物质的分析
成熟期为6、12、24、36个月的切达干酪的挥发性风味物质分析结果如表2所示。
表2 不同成熟期切达干酪挥发性风味化合物分析
Table 2 Analysis of volatile flavor compounds in cheddar cheese at different maturity stages
化合物风味RI挥发性风味物质/(mg·kg-1)6个月12个月24个月36个月乙醇甜味92914.47±0.18a11.29±0.04b7.64±0.53c6.12±0.13d3-甲基丁醇威士忌味、麦芽味、烧焦味1 2140.79±0.14a0.69±0.06b0.59±0.04c0.47±0.08d己醇树脂味、花香味1 3620.49±0.01a0.41±0.04b0.35±0.02c0.34±0.03c丁二醇水果味、洋葱味1 5760.597±0.05c0.94±0.03ab0.82±0.08b1.00±0.02a2-庚醇蘑菇味1 267—0.90±0.02——苯乙醇蜂蜜味、花香味1 9230.26±0.17a0.16±0.08b0.12±0.02c0.11±0.04c癸醇椰子味2 2211.29±0.035a1.01±0.03b——苄醇甜味、花香味1 867——0.96±0.10a0.78±0.07b反-2-己烯-1-醇树叶味、桃木味1 381——1.40±0.08a0.65±0.03b己酸乙酯果香味1 2380.07±0.01d0.08±0.02c0.093±0.02b0.101±0.01a丁酸戊酯香蕉味1 401—0.07±0.01b0.12±0.05a0.13±0.02a辛酸乙酯水果味、油脂味1 4380.02±0.03c0.04±0.01b0.09±0.01a0.09±0.01a丁酸乙酯苹果味1 024—0.02±0.003c2.08±0.08b2.39±0.06a癸酸乙酯葡萄味1 6290.09±0.03a0.09±0.02a0.09±0.01a0.09±0.01a乙酸丁酯梨子味1 023——0.03±0.16b0.42±0.06a3-羟基丁酸乙酯棉花糖味1 5170.06±0.01b0.70±0.02a——δ-十一烷酸内酯椰子味2 045———0.012±0.01δ-辛内酯桃子味1 925——0.027±0.01a0.028±0.01aδ-壬内酯坚果味2 0170.04±0.01d0.05±0.01c0.07±0.01b0.09±0.02a丁位十一内酯桃子味2 290——0.02±0.01—2-戊酮水果味9570.82±0.54lb1.10±0.03a1.13±0.02a0.76±0.04b2-庚酮甜味、霉味、油漆味1 1730.38±0.06a0.29±0.15b0.16±0.05c0.08±0.03d2-十一酮柑橘味1 5410.09±0.01a0.06±0.01b0.04±0.02c0.02±0.01d2-壬酮花香味、水果味、桃子味1 3890.09±0.02a0.09±0.03b0.08±0.01b0.07±0.02d3-羟基-2-丁酮黄油味、奶油味1 28310.22±0.14d17.11±0.43c26.62±0.62a21.13±0.31b2,3-丁二酮酸奶味、黄油味9740.99±0.24a0.43±0.03b0.21±0.01c0.15±0.03d乙酸酸味1 45110.60±0.06a4.93±0.06b3.36±0.03c3.03±0.02d丁酸汗臭味1 5894.98±0.016d9.03±0.08c11.40±0.23b11.99±0.49a己酸甜味1 8016.77±0.07d13.20±0.02b15.34±0.08a15.78±0.49a庚酸汗臭味1 9100.22±0.04d0.46±0.01c0.61±0.02b0.76±0.01a辛酸汗臭味、酸败味2 0063.10±0.04c5.29±0.09b5.87±0.39a5.85±0.09a癸酸酸败味、油脂味2 2861.29±0.01d2.76±0.07b2.74±0.01b3.21±0.05a丙酸金属味1 5210.34±0.01a0.23±0.01b0.24±0.10b0.22±0.33c壬酸酸败味2 2110.067±0.011d0.089±0.014c0.19±0.02b0.32±0.01a戊酸汗臭味1 0970.48±0.04d0.69±0.06c1.92±0.05b2.11±0.06a2-甲基丁酸奶酪味、甜味、油脂味1 6710.36±0.01b0.98±0.03a1.02±0.01a1.01±0.02a9-癸烯酸酸败味2 2760.18±0.03d0.26±0.02c0.44±0.01b0.92±0.04a苯甲酸坚果味2 324———0.09±0.01苯乙酸蜂蜜味、花香味2 251———1.08±0.082-甲基丁醛可可味、杏仁味9170.34±0.001d0.76±0.05c1.63±0.01b2.01±0.03a3-甲基丁醛坚果味、麦芽味9140.19±0.01c0.96±0.03b1.33±0.01b1.41±0.03a己醛牛油味、青草味1 0770.40±0.007c0.59±0.04c1.32±0.04b1.42±0.12a癸醛玫瑰味、梨子味1 4850.05±0.01a0.04±0.02b0.03±0.01c0.02±0.01d壬醛柑橘味、油脂味1 3840.11±0.015d0.29±0.04c0.32±0.07b0.53±0.02a苯甲醛杏仁味1 4930.35±0.02d0.41±0.03c0.68±0.04b0.79±0.05a苯乙醛蜂蜜味、甜味1 6480.07±0.001c0.09±0.008b0.11±0.01a0.10±0.01香兰醛香草味2 570——0.06±0.01—十六碳-2-烯醛炸物味、油脂味1 708——0.02±0.010.02±0.01乙偶姻黄油味、奶油味1 2462.40±0.03d3.38±0.06c4.02±0.02b4.92±0.03a
续表2
化合物风味RI挥发性风味物质/(mg·kg-1)6个月12个月24个月36个月甲苯涂料味1 0170.071±0.02d0.075±0.03c0.084±0.02b0.089±0.03a柠檬烯柠檬味、柑橘味1 1880.013±0.004d0.039±0.002c0.054±0.01b0.087±0.01a萘柏油味1 7370.17±0.01a0.08±0.03b——2,3-二甲基哌嗪坚果味、黄油味、可可味1 186———0.043±0.012-正戊基呋喃黄油味1 218———0.018±0.01二甲基砜椰子味、奶油味1 8380.024±0.01c0.031±0.01b0.032±0.01b0.044±0.01a
注：同一行内不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
通过NIST 14.0数据库和保留指数对比分析发现，可鉴定出切达干酪中的30多种风味物质，主要包括醇类、醛类、酸类、酯类、酮类、内酯类、其他类(苯类、萘类、酚类、哌嗪类、呋喃类、含硫化合物类)，共计7大类风味物质。挥发性风味物质的形成与干酪蛋白质的水解有很大的关系，成熟期越长检测到的挥发性风味化合物越多，这种趋势与2.2中干酪的游离氨基酸变化情况相一致。
醇类化合物作为干酪中重要风味化合物，其主要是通过乳糖代谢、甲基酮降解、氨基酸代谢及亚麻酸、亚油酸的降解等生物化学反应形成。从表2中可知，随着成熟时间的延长，醇类物质与酸发生反应生成酯类，醇类化合物含量降低，这与HAYALOGLU等[23]报道的醇类物质主要在储存期形成的结论基本一致。3-甲基丁醇由Leu经过转氨酶生物合成及Strecker降解产生，赋予干酪麦芽味和坚果味。苯乙醇由Phe经过Strecker降解产生，赋予干酪花果香；丁二醇由Ile经过Strecker降解产生，赋予干酪水果风味，二者均对干酪风味带来积极影响。
大多数酯带有花香味、水果味(低浓度)以及酵母发酵味(高浓度)，酯的风味可以削弱脂肪酸产生的刺激味和氨基产生的苦味[24]。特别是乙酯被公认为干酪中水果味的来源，己酸乙酯与切达干酪的成熟相关[25]，对干酪风味起到了重要作用。不同成熟期切达干酪中，己酸乙酯的含量差异显著(P<0.05)，随着成熟时间的延长，己酸乙酯的含量增加。在干酪成熟前期未检测到丁酸戊酯和乙酸丁酯，随着成熟时间的延长，丁酸戊酯和乙酸丁酯含量也呈现增加趋势。癸酸乙酯含量差异不显著(P>0.05)。内酯也是干酪中重要的风味组分，研究表明，干酪中内酯含量与干酪脂肪酸含量成正比[26]。随着成熟时间的延长，内酯类物质含量增加。其中，δ-辛内酯赋予干酪桃子味，δ-壬内酯表现出坚果味，阈值较小，对干酪风味的贡献较大。
酮类化合物是干酪中常见的风味化合物，风味特征典型，对干酪风味贡献很大。2,3-丁二酮赋予干酪令人喜爱的酸奶味；3-羟基-2-丁酮赋予干酪令人愉快的奶油味，在干酪成熟初期含量较高，主要通过柠檬酸盐代谢途径经双乙酰还原生成[27]。由于乳酸菌的代谢，2-壬酮赋予干酪花香味、水果味、桃子味；2-庚酮赋予干酪甜味。不同成熟期干酪中，2-庚酮和2-壬酮含量差异显著(P<0.05)，随着干酪成熟时间的延长，2-庚酮和2-壬酮的含量呈现增加趋势。成熟期较长干酪中，2-庚酮特有的霉味和油漆味，对干酪的风味带来不利影响。
酸类化合物是干酪风味化合物的主要成分之一，其主要来源于干酪成熟过程中的脂类降解、蛋白质水解和乳糖发酵。不同成熟期切达干酪的挥发性风味物质中均含有丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、2-甲基丁酸这6种酸类化合物，6种酸类化合物含量显著差异(P<0.05)。随着干酪成熟时间的延长，丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、庚酸、壬酸、2-甲基丁酸的含量均有所增加，对干酪的风味造成了很大的影响。丁酸和辛酸的阈值较低，在高浓度下具有令人不悦的风味，对干酪的风味品质带来不利影响。2-甲基丁酸赋予干酪奶香味和甜味，对干酪的风味带来积极影响。
醛类作为一类瞬时挥发性成分，性质较为活泼，能够被快速转化为醇类和酸类，但阈值较低，对干酪的风味影响较大[28]。4种不同成熟期干酪鉴定得到的醛类化合物均以己醛、辛醛和壬醛这几种直链醛类为主。2-甲基丁醛、3-甲基丁醛由Leu经过转氨酶生物合成及Strecker降解产生。其中，3-甲基丁醛是切达干酪中重要的干酪风味化合物，是切达干酪的主体风味，赋予干酪令人愉悦的坚果味和麦芽味，随着成熟时间的延长，3-甲基丁醛的含量逐渐增加，这与干酪成熟期间的脂肪代谢、蛋白质水解特征相一致。另外，壬醛呈玫瑰香味，阈值较低，对切达干酪的风味有很好的修饰作用。
为找出每种切达干酪中的主要风味物质，采用SIMCA-P软件对风味物质相对含量进行主成分分析(principal component analysis,PCA)，结果如图2所示。
图2 不同成熟期切达干酪的PCA图
Fig.2 PCA diagram of cheddar cheese at different
maturity stages
由图2可知，PC1的贡献率为76%，PC2的贡献率为14.2%。4种样品的距离都相对较远，比较分散，表明样品之间的挥发性成分存在一定的差异，可以很好地解释不同成熟度切达干酪挥发性风味物质的变化。从主成分的计算方法可以看出，载荷的绝对值越大，对主成分的影响就越大。乙醇、己醇、癸醇、2-庚酮、乙酸与成熟期6个月切达干酪成正相关，是成熟期6个月切达干酪的主要风味物质；3-甲基丁醇、癸醛、2-壬酮、2-十一酮与成熟期12个月切达干酪成正相关，是成熟期12个月切达干酪的主要风味物质；3-甲基丁醛、己酸、辛酸、己醛、丁酸戊酯、辛酸乙酯是成熟期24个月切达干酪的主要风味物质；戊酸、庚酸、壬酸、δ-壬内酯、乙偶姻、苯甲醛是成熟期3年切达干酪的主要风味物质。
2.4 干酪的感官品质评价
由图3可知，切达干酪的气味和滋味特征主要有坚果味、蒸煮味、乳清味、酸奶味、乳脂味、水果味、游离脂肪酸味、酸味、鲜味、甜味、苦味、咸味和涩味。随着成熟时间的延长，切达干酪的气味滋味特征呈现出乳脂味、坚果味、游离脂肪酸味、鲜味、苦味增加趋势；蒸煮味、酸奶味、乳清味、酸味、涩味降低趋势；水果味和甜味先增加后降低趋势；咸味则无明显变化。坚果味随着成熟时间的延长呈现增加趋势，与作为坚果味的主体成分3-甲基丁醛的变化趋势一致，并与江丽红[29]的研究结果一致。
图3 不同成熟度切达干酪的感官评价雷达图
Fig.3 Sensory evaluation radar chart of cheddar cheese
with different maturity
3 结论
4种切达干酪在成熟过程中，除盐分含量无显著变化外，水分、蛋白质、脂肪随着成熟时间的延长呈现降低趋势，pH随着成熟时间的延长呈现增加趋势。随着干酪成熟时间的延长，游离氨基酸含量呈增加趋势，主要增加的游离氨基酸是Leu和Phe(P<0.05)。
随着成熟时间的延长，己酸、丁二酸、己酸乙酯、δ-壬内酯、2-庚酮、2-壬酮、2-甲基丁酸和3-甲基丁醛等挥发性风味物质含量显著增加(P<0.05)。6个月切达干酪中主要风味化合物是乙醇、己醇、癸醇、2-庚酮、乙酸；12个月切达干酪中主要风味化合物有3-甲基丁醇、癸醛、2-壬酮、2-十一酮；24个月切达干酪中主要风味化合物有3-甲基丁醛、己酸、辛酸、己醛、丁酸戊酯、辛酸乙酯；36个月切达干酪中主要风味化合物有戊酸、庚酸、壬酸、δ-壬内酯、乙偶姻、苯甲醛。
随着成熟时间的延长，切达干酪的气味、滋味特征呈现出乳脂味、坚果味、游离脂肪酸味、鲜味、苦味、咸味增加趋势，蒸煮味、酸奶味、乳清味、酸味、涩味降低趋势，水果味和甜味呈先增加后降低趋势。
本研究阐明了不同成熟期切达干酪的关键风味物质特征，能够对不同成熟期切达干酪风味品质进行客观、准确的判别，对控制切达干酪的品质具有重要意义，为下一步加速切达干酪成熟及成熟产物特征确定提供数据支持。
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