益生菌是摄入一定量后，能对人体产生确切健康功效的一类有益活性微生物的总称[1]。益生菌能够通过调节机体中的神经传递介质来预防老年痴呆症等病理性衰老[2-3]，其特有的胞外蛋白酶、肽酶通过水解作用，将食物蛋白中具有降压作用的肽片段释放，达到降血压效果[4-5]。同时，益生菌自身也可通过分泌具有抗菌、抗炎特性的次级代谢产物和激活免疫细胞等多种方式，促进宿主肠道菌群健康、提高免疫力[6-7]。随着对益生菌认识的不断深入，益生菌在多个领域尤其是在食品中被广泛研究、应用。目前，常见的益生菌载体主要有微胶囊[8]、豆乳[9]、发酵乳[10]以及果蔬汁饮料[11]等，而发酵乳作为益生菌良好的来源和绝佳的载体，因其丰富的营养和独特的口感受到众多消费者的青睐[12]。因此，近年来市场上的发酵乳产品种类不断增加，其中不乏含有添加多种益生菌的发酵乳制品[13-14]。有研究表明[15-16]，多种益生菌混合制备的发酵乳不仅发酵速度快、风味佳，其抗氧化能力、抑菌能力更优于单一益生菌发酵乳。而复合益生菌发酵乳效果虽好，但这些益生菌相近的生理生化特征使其在同一载体中很难区分[17]。为了克服这一缺陷，有研究在培养基中添加抗生素类抑菌物质对目的菌株进行选择性计数[18]。但同时有报道称，添加的抑菌物质同样会抑制目的菌株正常生长，导致计数结果偏低[19]。我国目前并无明确的益生菌发酵乳生产标准，对发酵乳中益生菌数量尚无明确规定。不够完善的市场监管体系和技术上的困难，造成了市场上该类产品质量参次不齐的现象。产品包装虽然标识含有高菌量益生菌，但有无添加、数量是否达标，都是厂家自说自话。为防止此类现象的发生，建立一种科学合理地对混合菌株发酵乳中益生菌定性、定量的检测方法具有重要意义。
近年来，国内外利用分子生物学手段快速鉴定物种的研究越来越多[20-22]。其中，实时荧光定量聚合酶链式反应(qualitative real time polymerase chain reaction，QPCR)[23]因其高特异性、无污染性的优点被广泛应用于食品检测中，也逐渐应用至益生菌检测领域。因此，本研究通过设计干酪乳杆菌LTL1361和罗伊氏乳杆菌LTR1318的种属特异性引物，建立发酵乳中干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，以期能够为益生菌混合发酵相关制品中菌株的定性、定量检测提供新的计量方法。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LTL1361、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LTR1318分离纯化自广西巴马瑶族自治县一位身体健康、年龄超百岁的老人的粪便，已保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏号：干酪乳杆菌LTL1361：CCTCC M 2019018，罗伊氏乳杆菌LTR1318：CCTCC M 2019017。大肠杆菌DH5α，本实验室保藏；载体pucm-T、T4 DNA Ligase、Taq酶、Wide Range DNA Marker，TaKaRa公司；细菌DNA提取试剂盒、SYBR qPCR Master Mix，南京诺唯赞生物科技有限公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。
实时荧光定量PCR仪器(LightCycler®96)，Roche公司；Infinite MP200连续波长多功能微孔检测器，瑞士TECAN；BIO-RAD伯乐凝胶成像仪、BIO-RAD电泳仪、梯度PCR仪，MJ Bio Rad。
1.2 实验方法
1.2.1 乳酸菌及样品DNA的提取
干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验》[24]培养后，采用细菌DNA提取试剂盒提取，具体操作按说明书进行。
益生菌发酵乳DNA的提取，参考吴燕涛等[25]方法并改进：称取100 mg发酵乳于2 mL离心管，加入750 μL去离子水、100 mL质量分数18% 柠檬酸钠和50 μL 1 mol/L NaOH，4 ℃ 2 000 r /min 离心5 min，弃上清液，保留沉淀。向沉淀中加入200 μL溶菌酶，37 ℃孵育1 h，再使用细菌DNA提取试剂盒提取益生菌DNA。
1.2.2 引物的设计
从Genbank中分别下载干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌不同菌株及其他乳酸菌标准株的16S rDNA序列，然后利用DNA Star中MegAlign进行序列比对，寻找种内保守区域，利用Primer 5.0进行引物设计。并通过GenBank中Blast检测引物特异性，获得干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的种属特异性引物。引物序列如下,干酪乳杆菌 F:5′-GATGATGTTGGGGATTTTGCG - 3′，R:5′-TATCATAAACCGGGAGATCCCA-3′;扩增片段为149 bp。罗伊氏乳杆菌 F:5′-GCGTTGATGTTGTTGAAGGAATGAGCTTTG-3′，R:5′-CATCAGCAATGATTAAGAGAGCACGGCC-3′;扩增片段为200 bp。引物均由北京擎科生物有限公司合成。
1.2.3 PCR反应条件
普通PCR:反应体系包括12.5 μL TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye，10 μmol/L上下游引物各1 μL，去离子水补齐至20 μL，每个体系中再添加2 μL DNA模板。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 12 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。
PCR产物检测方法：取5 μL PCR产物，使用质量浓度10 g/L琼脂糖凝胶和1×TE缓冲液中电泳30 min,电压100 V,然后采用凝胶成像系统拍照存档。
实时荧光定量PCR:实时荧光定量PCR反应体系为20 μL，其中SYBR qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，DNA模板2 μL，去离子水补足至20 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。
1.2.4 引物特异性的验证
分别提取随机抽查的市售样品1、样品2、样品3及自制益生菌发酵乳(干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318及传统发酵剂发酵)的DNA作为PCR反应模板，利用1.2.2中设计合成的种属特异性引物进行PCR扩增，普通PCR反应体系和反应条件均按照1.2.3中所述条件进行，同时将扩增得到的PCR产物使用质量浓度10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318的16S rDNA基因克隆
采用细菌DNA提取试剂盒分别提取干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318的基因组DNA。并以基因组DNA作为 PCR反应模板扩增，将扩增后的PCR反应产物纯化后与pucm-T连接并转化至DH5α感受态细胞，经过PCR鉴定并送去生工生物工程(上海)股份有限公司测序，检测正确获得的阳性克隆子分别命名为puc-LTL1361、LTR1318。
1.2.6 外标准品的制备及标准曲线的建立
分别提取质粒标准品puc-LTL1361、LTR1318 DNA，酶标仪测定A值后，按照公式(1)计算出拷贝数并做10倍系列稀释，将不同浓度标准品作为模板进行荧光定量PCR反应：
(1)
式中：K，拷贝数，copies/mL；ρ，标准品浓度，g/mL；MW为相对分子质量，dolton。
以不同浓度标准品拷贝数的对数作为横坐标，以荧光定量PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标绘制标准曲线，为待测样品提供定量检测参照标准。并通过使用曲线的斜率以及应用公式(2)来确定扩增效率：
(2)
式中，E表示扩增效率；slope表示斜率。
1.2.7 不同浓度益生菌的检测
为验证建立的荧光定量PCR检测方法是否可以在实际样品中进行检测以及检测结果的准确性，同时利用平板计数法和荧光定量PCR检测方法对不同浓度益生菌进行检测，并对分析结果进行比较。分别将干酪乳杆菌LTL1361和罗伊氏乳杆菌LTR1318培养至1010 CFU/mL，再以10倍梯度法稀释菌液浓度至1010～10 CFU/mL作为待检样品，每个样品平行测定3次。
使用GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌计数》[24]对乳杆菌总数进行计数，参考RAVULA等[26]的方法使用LC琼脂培养基对干酪乳杆菌计数，罗伊氏乳杆菌计数为两者相减后所得。
荧光定量PCR检测：分别提取不同浓度菌液核酸，并以该核酸为模板进行实时荧光定量PCR反应。
1.2.8 实际市售样品的检测
按建立的实时荧光定量PCR方法对随机抽查的市售样品进行检测，每个样品平行测定3次。同时对反应系统特异性及荧光定量PCR检测时间进行分析。
1.3 数据与图像处理方法
采用LightCycler®96 SW1.1软件进行荧光定量PCR图谱解析；采用GraphPad Prism 8用于统计学分析和作图。
2 结果与分析
2.1 质粒标准品的鉴定
构建的质粒标准品PCR鉴定结果见图1。由图1-a可知,泳道1、2分别在149 bp大小处得到单一条带，其大小与目的片段相同；由图1-b可知,泳道1、2分别在200 bp大小处得到单一条带，其大小与目的片段相同；同时将puc-LTL1361、puc-LTR1318测序结果与目的片段基因序列对比，得到结果完全一致。上述结果表明：阳性克隆子puc-LTL1361及LTR1318构建成功，可用于后续实验。
M-marker DL500；a：1和2-puc-LTL1361；b：1和2-LTR1318；
a-puc-LTL1361标准品鉴定;b-puc-LTR1318标准品鉴定
图1 质粒标准品的PCR鉴定结果
Fig.1 PCR identification results of plasmid standard
2.2 引物特异性验证
如图2所示，使用1.2.2中设计的干酪乳杆菌特异性引物对市售样品进行PCR扩增，将扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检验。结果表明，泳道2、泳道3在149 bp处未出现特征条带，结果显示为阴性，表明样品1、样品2不含干酪乳杆菌；泳道4、泳道5分别在149 bp处出现特征条带，与泳道6阳性对照一致，表明样品3及泳道5自制益生菌发酵乳中含有干酪乳杆菌。根据样品标签信息标识：市售样品1、样品2中仅含嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌，样品3含有干酪乳杆菌，自制益生菌发酵乳中含有干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌及传统发酵剂。使用该引物扩增，仅能特异性扩增出含有干酪乳杆菌基因片段样品，说明引物特异性良好，能够对样品中的干酪乳杆菌准确定性检测。
M-Marker DL500;1-阴性对照；2-样品1; 3-样品2; 4-样品3;
5-自制益生菌发酵乳；6-LTL1361
图2 样品中干酪乳杆菌的定性检测
Fig.2 Qualitative detection of L. casei in samples
如图3所示，使用1.2.2中设计的罗伊氏乳杆菌特异性引物对样品进行PCR扩增，将扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检验。结果表明，泳道2、泳道3在200 bp处未出现特征条带，结果显示为阴性，表明样品1、样品2、样品3中不含罗伊氏乳杆菌；泳道5在 200 bp大小处出现特征条带，与泳道6阳性对照一致，表明泳道5自制益生菌发酵乳中含有罗伊氏乳杆菌。根据样品标签信息，使用该引物扩增，仅能特异性扩增出含有罗伊氏乳杆菌基因片段样品，说明引物特异性良好，能够对样品中的罗伊氏乳杆菌准确定性检测。
M-Marker DL500;1-阴性对照；2-样品1；3-样品2；
4-样品3；5-自制益生菌发酵乳；6-LTR1318
图3 样品中罗伊氏乳杆菌的定性检测
Fig.3 Qualitative detection of L. reuteri in samples
2.3 标准曲线方程的建立
以不同浓度标准品拷贝数的对数作为横坐标，以荧光定量PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标绘制标准曲线。其中，干酪乳杆菌标准曲线方程为：y=-3.264x+38.604，相关系数R2=0.995 9，扩增效率102%；罗伊氏乳杆菌标准曲线方程为：y=-3.363x+40.594，相关系数R2=0.995 7，扩增效率98%。上述结果表明,所建立的标准曲线方程，线性相关系数达到0.99以上，扩增效率在90%～110%，均符合实时荧光定量PCR的定量要求，可对待检测样品初始浓度进行精确定量。
2.4 不同浓度益生菌的检测
利用荧光定量PCR检测方法测定不同菌液Ct值并代入2.3所建标准曲线方程中计算得到PCR检测结果，同时使用平板培养法对样品进行计数，所得结果见表1。
表1 荧光定量PCR检测结果与平板计数结果的比较
Table 1 Comparison of fluorescence quantitative PCR test results and plate count results
菌液浓度(CFU/mL)干酪乳杆菌罗伊氏乳杆菌荧光定量PCR检测(copies/μL)对数结果平板计数 (CFU/mL)对数结果荧光定量PCR检测(copies/μL)对数结果平板计数(CFU/mL)对数结果101UD-65.00±2.651.81UD-57.33±0.421.76102UD-(5.23±0.35) ×1022.72UD-(6.13±0.32) ×1022.79103UD-(5.63±0.45) ×1033.75UD-(7.33±0.25) ×1033.88104(4.11±0.33)×1044.61(4.43±0.12) ×1044.65(4.94±0.17) ×1044.69(5.33±0.42) ×1044.73105(5.41±0.19)×1055.73(5.83±0.23) ×1055.77(6.82±0.24) ×1055.83(7.13±0.40) ×1055.85106(5.46±0.19)×1066.74(5.77±0.31) ×1066.76(7.83±0.28) ×1066.89(7.50±0.03) ×1066.88107(6.41±0.08) ×1077.81(5.93±0.31) ×1077.77(6.93±0.48) ×1077.84(6.23±0.15) ×1077.79108(8.26±0.22) ×1088.92(7.80±0.02) ×1088.89(7.83±0.28) ×1088.89(7.07±0.40) ×1088.85
注：UD表示未检出;-表示无
由表1可知，当菌液浓度为10～104 CFU/mL时，荧光定量PCR均没有明显的扩增信号，检测结果记为阴性；当菌液浓度为104～108 CFU/mL时，可测得Ct值计算拷贝数。将荧光定量PCR检测结果与平板计数结果进行比较，检测结果并无显著性差异(P>0.05)，其结果对数值均在一个数量级上，与菌液实际浓度相符。以上结果表明，所建立的实时荧光定量PCR检测方法检测限为104 CFU/mL,能够满足国标GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》中对发酵乳乳酸菌含量检测的要求，并且所建立的荧光定量PCR检测方法能够准确反映益生菌含量。
2.5 市售样品的定性、定量检测
2.5.1 实时荧光定量PCR检测结果分析
根据新建立的实时荧光定量PCR检测方法对市售样品进行检测，通过观察PCR扩增结果即可对样品进行定性检测。同时得到对应的样品Ct值(y)，将其代入2.3中所建标准曲线方程计算，即可对样品初始浓度(x)进行定量。所得结果见表2。
表2 市售样品的实时荧光定量 PCR 检测结果
Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR test results of commercial samples
样品标识菌株信息扩增结果Ct值菌含量×10-9/(copies·μL-1)干酪乳杆菌罗伊氏乳杆菌干酪乳杆菌罗伊氏乳杆菌自制益生菌发酵乳嗜热链球菌-干酪乳杆菌+10.84±0.143.2±0.35罗伊氏乳杆菌+11.49±0.114.5±0.36保加利亚乳杆菌-市售样品1嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌-市售样品2嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌-市售样品3干酪乳杆菌≥+12.02±0.221.3±0.25108 CFU/mL+
注：+表示有荧光扩增信号；-表示无荧光扩增信号；空白表示未检出
市售样品1、样品2在扩增时均没有显著荧光信号，无Ct值检出，即无阳性扩增曲线形成，表明样品中均不含有干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。样品3中形成干酪乳杆菌阳性扩增曲线，同时检出Ct值为12.02±0.22，将其代入干酪乳杆菌标准曲线方程y=-3.264x+38.604计算，得到干酪乳杆菌含量为(1.39±0.2)×109 copies/mL。其中，样品3并无罗伊氏乳杆菌阳性扩增曲线形成，说明样品3并未添加罗伊氏乳杆菌。自制益生菌发酵乳中分别形成干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌阳性扩增曲线，同时检出干酪乳杆菌Ct值为10.84±0.14，将其代入方程中计算得到干酪乳杆菌含量为(3.2±0.35)×109 copies/mL。检出罗伊氏乳杆菌Ct值为11.49±0.11，代入罗伊氏乳杆菌标准曲线方程y=-3.363x+40.594中计算，可得罗伊氏乳杆菌含量为(4.5±0.36)×109 copies/mL。检测结果均与样品标签中标识菌株种类及数量信息一致，同时与2.2中样品定性检测结果一致。由此可知，所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够对益生菌发酵乳中干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌同时定性、定量检测。姜凯等[27-29]使用流式细胞术测定酸奶中的乳酸菌，单个样品耗时40 min。但流式细胞术却无法对乳酸菌进行特异性检测，检测结果可能包含了除乳酸菌以外的其他微生物。陈臣等[30]采用普通PCR方法结合琼脂糖凝胶电泳图谱分析对发酵乳中植物乳杆菌进行检测，操作方法繁琐且不能对益生菌定量。而本技术对目的菌株构建质粒标准品，建立了益生菌标准曲线方程，通过选取目的菌株的特异性基因序列设计引物，使目的菌株能够进行特异性扩增从而实现对混合发酵乳中特定益生菌的定性检测，同时检出样品Ct值并代入方程中计算即可对益生菌进行定量检测。所建方法不仅克服了流式细胞术和传统平板法很难对发酵乳中同一菌属乳酸菌特异性检测的困难，还在普通PCR定性检测的基础上实现了对益生菌的定量检测。
2.5.2 荧光定量PCR反应检测系统的特异性分析
通过解读扩增产物的溶解曲线可对荧光定量PCR反应检测的特异性进行评价，不同扩增产物下的溶解曲线不同，可通过观察溶解曲线排除引物二聚体等非特异性干扰[31]。由图4可知,扩增产物的溶解曲线皆呈单一峰型且空白对照无起峰现象，表明定量体系特异性良好，所用引物及PCR反应条件都适合进行荧光定量PCR反应。
2.5.3 实时荧光定量PCR检测时间统计
实时荧光定量PCR检测时间统计见表3。采用实时荧光定量PCR技术对发酵乳中益生菌进行检测。为有效提取样品DNA，对发酵乳中乳蛋白及脂肪进行酶解处理，此过程需要时长为1 h。将处理后样品使用细菌DNA提取试剂盒提取发酵乳中DNA作为PCR反应模板，提取时间通常为1 h。将得到的DNA作为PCR反应模板，按照1.2.3中确定的实时荧光定量PCR体系和反应程序使用PCR仪扩增检测,需要时间约为1.5 h。因此，本方法的整个检测过程所需时间一般约为3.5 h。而使用传统平板培养法检测乳酸菌所需时间长达2～3 d[32]，相比之下，实时荧光定量PCR检测技术显著提高了检测效率。
图4 实时荧光定量PCR溶解曲线
Fig.4 Real-time fluorescence quantitative PCR dissolution
curve
表3 实时荧光定量PCR检测时间表
Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCR
detection schedule
检测步骤时间/h样品前处理1.0提取样品DNA 1.0PCR扩增1.5
3 结论
本研究通过干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌种属特异性引物进行扩增，建立了双重实时荧光定量PCR检测方法。其中，所建干酪乳杆菌标准曲线方程为：y=-3.264x+38.604，罗伊氏乳杆菌标准曲线方程为：y=-3.363x+40.594，相关系数R2均在0.99以上。使用传统平板计数法对其验证，发现2种检测方法对菌液计数结果并无显著性差异。对市售样品进行随机抽样检测，通过观察扩增结果和检测样品Ct值即可对市售产品中干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的有无和含量进行定性和定量检测，经过对比可知检测结果与所知的益生菌种类及数量信息相符。因此，本研究所建立的技术方法能够比较快速、准确地对益生菌发酵乳中的干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌进行定性、定量检测，对有关制品的质量检测和控制具有一定的指导作用。
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