青梅是药食两用水果，含有丰富的有机酸、多酚、多糖和萜类物质[1]，以及多种维生素和微量元素，特别是含有17种氨基酸，其中有8种人体必需氨基酸[2]。以青梅果发酵酿造而成的青梅酒酒体呈金黄色,果香悦人,可开胃生津、改善肠胃功能[3]。然而,由于青梅酒含有蛋白质、单宁和有机酸等成分,在贮存过程中容易产生沉淀,稳定性受到破坏[4]，因而发酵结束后的澄清工艺显得尤为重要。
近年来，微滤技术由于其过程温和、无相变和化学添加剂的特点，在酿酒工业中得到了广泛的应用，已被证明是一种有效的澄清和除菌技术[5]。但是目前有关果酒澄清的研究绝大多数针对葡萄酒[6-8]，对于青梅酒等小众果酒涉及甚少。对于青梅酒微滤过程的过滤行为和膜污染特征，微滤对青梅酒特性的影响，尚未见报道。
本研究采用2种不同孔径的陶瓷膜对发酵型青梅酒进行微滤澄清，分析微滤过程中膜的污染机制，并对微滤后青梅酒的基础特性、有机酸含量和挥发性组分的变化进行了分析，为发酵型青梅酒的生产提供理论支撑和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青梅，四川省大邑县；蔗糖，本地市场购买；酿酒酵母(SY)，安琪酵母股份有限公司；生香酵母(Zymaflore Alpha)，拉氟德公司；所有标准品，包括辛酸甲酯(内标)，有机酸均由Aldrich-Sigma公司(上海)和阿拉丁试剂公司(上海)提供。
NaCl、NaOH、NaHSO3、(NH4)2HPO4、壳聚糖、硅藻土，成都科隆化学品有限公司；CuSO4、HCl、次甲基蓝、葡萄糖，成都金山化学试剂有限公司；果胶酶，天津科密欧化学试剂有限公司。所有化学试剂均为分析级。
1.2 仪器与设备
CS501超级恒温水浴锅，上海浦东荣丰科技仪器有限公司；BS100S分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；CX31显微镜，日本奥林巴斯有限公司；FEB-85恒温磁力搅拌器，上海双捷有限公司；PHS-3C pH计，WZS-186浊度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；IR200手持式折光仪，上海仪迈仪器科技有限公司；GL-20G立式高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器有限公司；HPLC高效液相色谱和1260紫外检测器，美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取头，美国Supelco公司；Trace GC Ultra-DSQ Ⅱ气相色谱-单冲四级杆质谱仪，美国Thermo Fisher Electron公司；CeraMem-0 025陶瓷膜微滤设备，厦门福美科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 青梅酒的制备
选择成熟度一致、健康无病斑的新鲜青梅，糖渍3 d。在10 L不锈钢发酵罐中发酵，加入60 mg/kg的NaHSO3和(NH4)2HPO4抑菌及提供氮源。调整糖含量后，按一定比例加入生香酵母/酿酒酵母，并置于25 ℃静置发酵，定期搅拌，每隔2 d检测总糖、酒精度，并适当补充糖。当乙醇体积分数达到12%，残余糖含量下降到5%以下时，停止发酵，倒罐去皮渣。在17 ℃后发酵10 d，粗滤后放入4 ℃冰箱备用。
1.3.2 青梅酒的澄清
本研究涉及3种澄清工艺，除了微滤澄清之外，还采用了自然澄清和澄清剂澄清作为参照对象。
1.3.2.1 自然澄清和澄清剂澄清
澄清实验在避光静置1周的条件下完成。在澄清剂实验前期，进行了单一澄清剂对青梅酒的澄清效果实验。在此基础上设计了一种复合澄清剂的最佳配方，即果胶酶(EX-V)质量浓度1.4 g/L、壳聚糖质量浓度1.2 g/L和硅藻土(200目)质量浓度0.4 g/L，并在青梅酒澄清实验中加入了此配方的澄清剂。
1.3.2.2 陶瓷膜过滤澄清
采用孔径0.2和0.5 μm的陶瓷膜(Al2O3、过滤面积0.032 m2)实验室级过滤系统对青梅酒进行微滤，工艺过程如图1所示。
图1 微滤装置示意图
Fig.1 Scheme of microfiltration set-up
过滤系统由供料箱(容量2 L)通过泵供料。进料流量为12 L/h，由流量调节阀控制。微滤温度为20 ℃，由温控系统调节控制。跨膜压差(transmembrane pressure，TMP)根据膜组件进出口压力计算得到，本实验Δp=0.06 MPa。滤液槽置于电子天平(精度0.01 g)之上，每隔1 min通过实时读取容器内的质量变化计算得出膜通量。
1.3.3 膜污染分析
采用2个经典模型对青梅酒微滤进行膜污染行为分析：Hermia膜孔堵塞模型和Resistance-in-series模型。本团队前期已经对分析方法作了详细描述[9-10]，并在本文中延用。Hermia模型基于公式(1)：
(1)
式中:t,累积时间，min;v,累积体积，L;K,常数;n,阻塞指数,其值随过滤机理变化，完全堵塞为2.0，标准堵塞为1.5，中间堵塞为1.0，滤饼过滤为0[11]。可根据不同过滤机制积分公式(1)并拟合实验数据，以拟合曲线的相关系数来判定过滤机制。
Resistance-in-series模型基于公式(2)：
Rt=Rm+Rf=Rm+Rrf+Rir
(2)
式中：Rt，过滤过程总阻力，m-1；Rm，膜阻，m-1；Rf，微滤过程中形成的膜污染阻力，m-1，为可逆阻力(Rrf)和不可逆阻力(Rir)之和[12-13]。
1.3.4 理化指标分析
酒精度(酒精计法)、总糖(斐林试剂直接滴定法)、总酸(电位滴定法)按国家标准(GB/T 15038—2006)《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。浊度：浊度计测定；pH：pH计测定；可溶性固形物：手持式折光仪测定；酵母菌数：显微镜血球计数板计数；细菌数：平板计数法测定。
1.3.5 有机酸分析
青梅酒中有机酸的分析按照本团队的优化方法进行[14]。
1.3.6 挥发性化合物分析
挥发性化合物的检测也是根据本团队的优化方法进行分析[10,15-17]。
1.3.7 数据分析
以上所述所有分析均进行了3次重复实验，数据以平均数±标准偏差(RSD)的形式表示。采用SPSS软件(17.0版)中 Duncan’s检验进行方差分析(ANOVA)，评价不同样品成分的显著性差异，P<0.05 (n=3)为显著性差异。使用Origin 9.0处理所有数据。
2 结果与分析
2.1 青梅酒微滤过程的特性评价
青梅酒不同孔径陶瓷膜的微滤过程中膜通量随时间的变化如图2-a所示，该曲线符合微滤过程的基本特征，即过滤初期快速降低，之后逐渐达到稳态。孔径大小对膜通量有一定的影响：膜孔越大，稳态通量相对越高。膜通量的变化与膜污染的机制息息相关，而Hermia膜孔堵塞模型可以很好地描述微滤过程的污染行为。图2-b展示了青梅酒的稳态微滤实验数据与滤饼堵塞模型之间的拟合关系，线性相关系数R2>0.98,可见在青梅酒微滤过程中，滤饼过滤是主要的膜孔堵塞机制，且与膜孔径关系不大。
a-青梅酒微滤过程的膜通量;b-滤饼堵塞模型与实验数据
的拟合曲线
图2 青梅酒微滤过程中膜通量变化以及滤饼堵塞模型与
实验数据的拟合曲线
Fig.2 The membrane flux of greengage wine through
0.2 μm and 0.5 μm ceramic membranes and the fitting curve
of experimental data by cake filtration model
另外，本研究利用Resistance-in-series模型分析了青梅酒微滤过程中的阻力分布。由表1可知，膜孔越小，微滤总阻力越大。青梅酒微滤阻力的主要来源是可逆膜污染阻力，占总阻力的90%以上，这与图2-b揭示的滤饼堵塞模型的行为一致，因此，膜污染阻力的增加主要是由于滤饼阻力的增大，而该滤饼的阻力在孔径较小的膜中更为显著，与文献报道一致[18]。不仅如此，孔径更小的膜中，不可逆膜污染阻力也更大，意味着其膜通量的再生难度更大。以上结果表明，0.5 μm比0.2 μm的陶瓷膜更适合于青梅酒的微滤。
表1 不同孔径的陶瓷膜的过滤阻力分布
Table 1 Resistance distribution of ceramic membranes
with different pore sizes
膜孔径/μm膜阻力分布Rm/m-1Rrf/m-1Rir/m-1Rt/m-10.25.64×10111.95×10130.94×10112.02×10130.53.06×10111.54×10130.46×10111.58×1013
2.2 微滤对青梅酒基础特性的影响过程特性评价
本部分旨在分析微滤对青梅酒基础理化特性的影响，采用了自然澄清和复合澄清剂澄清后的青梅酒作为对照，4个样品的主要理化特性见表2。由表2可知，所有样品的pH和酒精度几乎无差异，而青梅酒的总糖、总酸和可溶性固形物含量在微滤处理后有不同程度的降低，其中，以0.2 μm微滤澄清后下降更为明显，0.5 μm微滤澄清则可以较好地保留青梅酒的基础特征。另外，果酒的酒体透明度和色度也是其品质的重要指标，这2个指标决定于微生物、蛋白质、矿物离子(如铁离子)、多酚和多糖等组分的共同作用[19]。本研究发现，与自然澄清和澄清剂澄清相比，微滤处理可以更好地去除酒体中的悬浮微粒，极大降低浊度，同时，酒体色度也有所降低，产出的酒体晶莹剔透、品质典雅。微滤处理除了澄清，通常还能达到较好的除菌效果，对4个样品的细菌/真菌检测实验结果也证明，微滤处理后的青梅酒除菌效果大大优于自然澄清和澄清剂澄清的样品。
表2 不同青梅酒样品的理化性质
Table 2 Physicochemical properties of different greengage wine samples
理化指标自然澄清复合澄清剂微滤0.2 μm微滤0.5 μmpH2.582.612.572.58酒精度/%vol12.411.812.312.3总糖/[g·(100 mL)-1]6.49±0.05b6.63±0.04a6.18±0.07d6.34±0.03c总酸/[g·L-1(以酒石酸计)]24.14±0.08a23.62±0.23b22.20±0.16c23.54±0.13b可溶性固形物/(°Brix)16.77±0.06b16.90±0.00a15.30±0.00d16.20±0.00c浊度25.10±0.36a1.02±0.01b0.06±0.01c0.01±0.00c色度1.15±0.01a0.96±0.03b0.47±0.01c0.49±0.00c大肠杆菌群/[MPN·(100 mL)-1]180±43314±52<1<1霉菌酵母菌群/(CFU·mL-1)1.2×103±2240.9×103±123<1<1菌落总数/(CFU·mL-1)3.8×103±4755.6×103±348<1<1
注：不同的上标小写字母代表样本具有显著差异(P<0.05)(下同)
2.3 微滤对青梅酒中有机酸的影响
根据5种不同浓度梯度的有机酸标准溶液建立了HPLC峰面积-浓度的标准曲线，所有曲线的线性相关系数R2>0.99，验证了有机酸分析的可靠性[9]。图3展示了4种经过不同工艺澄清的青梅酒样品有机酸含量。
图3 不同青梅酒样品中的有机酸含量
Fig.3 The organic acid content of different greengage
wine samples
如图3所示，青梅酒样品中含有丰富的有机酸，其含量远超于一般的果酒，其中柠檬酸的含量最高，达到39 g/kg。无论微滤还是澄清剂澄清，与自然澄清样品相比，有机酸含量均没有明显的降低，可见本文研究的澄清工艺均对青梅酒中的有机酸含量没有显著影响。
2.4 微滤对青梅酒挥发性组分的影响
本文采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱(headspace-solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)对青梅酒中的挥发性成分进行了检测分析，共鉴定出了57种组分。根据不同的化学结构，可将其分为4类，包括10种醇类、9种酸类、32种酯类和6种醛酮类，见表3。
如图4所示，酯类、醇类和酸类化合物是青梅酒的主要挥发性组分，经过澄清剂和微滤澄清处理后，挥发性组分的总量均有所降低，而经过0.2 μm微滤处理后含量降低趋势更明显。
表3 不同青梅酒样品中挥发性组分的含量 单位：μg/L
Table 3 Volatile components in different samples of greengage wine
组分名称自然澄清澄清剂微滤0.2 μm微滤0.5 μm醇类(10种)1010109 异丁醇3.35±1.80b*6.53±1.26a5.24±1.08ab5.28±0.66ab 异戊醇187.24±36.73a200.97±19.24a244.55±23.57a260.00±84.00a 正己醇12.05±1.69a10.57±1.04a11.83±0.04a11.55±1.00a 芳樟醇14.87±1.99b15.63±2.56b3.53±0.12c24.00±5.41a 1-壬醇5.40±0.78a5.02±0.61a2.74±0.26b0.00±0.00 香叶醇0.81±0.28b1.18±0.24b1.53±0.19b2.33±0.70a 苯甲醇19.56±5.08a13.76±3.44a16.84±0.72a19.49±7.03a 苯乙醇1 316.53±71.97a917.73±84.12b876.92±30.04b1 170.34±192.66a 3-乙基-1-丙醇1.63±0.09a0.78±0.14d1.06±0.08c1.36±0.11b α-萜品醇43.93±12.65a36.18±9.41a32.42±1.08a41.03±7.20a 小计1 605.37±25.39a1 208.35±122.05b1 196.66±57.18b1 535.38±298.78a酸类(9种)9987 冰醋酸32.05±10.95a19.29±5.22a20.03±1.44a22.74±6.14a 己酸185.37±95.13a94.52±15.93ab78.10±0.72b86.18±35.52ab 庚酸4.65±0.85a2.08±0.52b5.00±0.08a5.99±2.21a 辛酸448.83±60.64a225.19±16.31b267.52±4.97b304.26±60.97b 正癸酸232.57±2.94a129.05±25.39b105.57±1.71b112.79±28.13b 9-癸烯酸16.99±1.11a6.64±1.17b7.74±0.33b7.24±1.90b 月桂酸28.14±4.29a14.22±3.02b12.45±0.88b15.70±5.71b 肉豆蔻酸6.42±0.10a3.16±1.23b0.53±0.01c0.00±0.00 10-十一烯酸1.92±0.71a1.35±0.46a0.00±0.000.00±0.0 小计956.94±176.72a495.50±69.25c496.94±10.14bc554.90±141.58b醛酮类(6种)6546 3,4-二甲基苯甲醛93.16±33.34a41.05±5.48b61.55±2.87ab103.15±34.02a 3-糠醛17.82±4.18a16.52±3.61b0.00±0.000.78±0.09c 苯甲醛62.62±14.14b89.11±5.74a9.19±0.83d26.04±6.51c 植酮0.90±0.27a0.00±0.000.00±0.000.75±0.65b 1-羟基环己基苯基甲酮3.15±1.20a0.50±0.27b0.41±0.08b2.44±0.30a 5-十一碳烯-4-酮 3.33±1.06a1.37±0.41b0.48±0.04c1.20±0.41b 小计180.98±54.19a148.55±15.51b71.63±3.82d134.36±41.98c酯类(32种)32313132 乙酸异戊酯4.34±0.18a6.29±0.71a3.82±0.63a4.45±2.40a 正己酸乙酯43.96±8.05a30.40±3.62b14.19±1.68c13.59±3.21c 3-己烯酸乙酯1.42±0.34a1.34±0.11a0.61±0.08b0.67±0.15b 乳酸乙酯0.88±0.07c1.37±0.29ab1.65±0.02a1.28±0.14ab 辛酸乙酯114.03±21.61a78.72±5.13b25.62±0.88c28.97±6.57c DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯10.82±2.61a10.53±2.09a6.32±0.11b7.42±2.22ab 己酸己酯1.36±0.01b0.00±0.000.71±0.24c3.15±0.13a 苯甲酸甲酯3.10±0.92a3.12±0.52a2.09±0.36b2.20±0.65b 4-羟基丁酸乙酰酯13.71±1.07a8.06±0.94c8.98±0.99bc10.90±1.87b 癸酸乙酯37.92±10.95a11.98±2.97b6.13±0.30b6.42±1.19b 苯甲酸乙酯89.68±15.33a87.21±11.59a25.17±1.63b27.91±4.34b 丁二酸二乙酯1 189.66±199.91a718.61±93.80b215.55±5.94c286.16±47.65c 反式-4-癸烯酸乙酯11.26±1.16a4.80±0.48c2.66±0.51d6.66±0.62b 水杨酸甲酯34.04±8.59a27.47±2.45a15.55±1.31b16.86±4.49b 戊二酸二乙酯16.08±3.90a9.89±3.87b2.92±0.20c3.41±1.38c 乙酸苯乙酯48.32±3.43a27.58±5.84b28.06±1.50b33.11±11.66b 月桂酸乙酯9.09±1.88a2.48±0.24bc2.12±0.24c4.27±0.95b 3-苯丙酸乙酯8.00±2.55a4.51±0.85b2.22±0.41b2.60±0.81b 肉豆蔻酸异丙酯5.01±0.29a3.26±0.05b0.00±0.002.31±0.56c 马来酸二乙酯42.49±3.80a13.56±3.52b5.87±0.32c8.18±2.30c
续表3
组分名称自然澄清澄清剂微滤0.2 μm微滤0.5 μm 己二酸二异丁酯4.16±0.03b3.42±0.37b2.01±0.96b9.21±2.18a 肉桂酸乙酯224.11±55.34a132.20±32.97b58.41±7.12c63.37±12.91c 丙位癸内酯95.10±27.66a53.87±15.83b51.02±2.04b54.46±20.61b 丁位癸内酯39.59±3.02a7.19±1.22c13.02±2.53bc16.71±5.17b 棕榈酸甲酯8.92±0.89a3.49±1.46bc1.80±0.07d5.09±1.71b 棕榈酸乙酯51.37±6.26a20.29±5.26b11.65±2.32c20.68±2.76b 丙位十二内酯14.29±2.93a10.50±2.97ab7.08±0.67b7.68±2.85b 琥珀酸单乙酯14.25±2.95a5.56±0.10b2.32±0.31c2.37±0.39c 十八酸乙酯4.64±1.29a2.84±1.35ab1.18±0.29b3.16±1.17ab 反油酸乙酯43.67±12.80a25.07±11.26b1.70±0.63c2.32±0.58c 亚油酸乙酯16.49±0.34a12.47±0.17b0.27±0.06c0.56±0.20c 2-甲基丙酸3-羟基-2,4,4-三甲基苯酯2.45±0.90b2.38±1.18b6.18±0.89a9.05±3.36a 小计2 204.21±401.06a1 330.46±213.21b526.88±36.24c665.18±147.18c总计4 947.50±657.36a3 182.86±420.02b2 292.11±107.38c2 888.21±629.52bc
注：数据表示为平均值±标准偏差(n=3)
图4 不同青梅酒样品中挥发性组分的浓度占比图
Fig.4 Concentration/proportion of volatile compounds in
greengage wine samples
注：不同字母代表样本具有显著差异(P<0.05)
醇类物质是果酒中主要的香气组分，由原料中的蛋白质、氨基酸和糖类在发酵过程中产生，香气主要表现为甜香、花果香[20]。本研究检出的醇类中，含量较高的有异戊醇、苯乙醇和萜品醇。苯乙醇是青梅酒香气的主要贡献组分之一，具有诱人的茉莉花香和玫瑰香[21]，占醇类物质总量的80%以上。澄清处理后醇类含量的减少主要是由于苯乙醇的损失，以0.2 μm微滤处理后的损失最为严重。相反，0.5 μm微滤处理则展现出较好的苯乙醇保留率，其对醇类的总保留率也较高。
青梅酒中自然存在的酸类组分丰富，同时也可由发酵初期酵母细胞繁殖代谢以及中后期醇类物质氧化产生[22]。酸类物质可参与形成酯的过程，对果酒的香气有调节和平衡作用[23]。其中己酸、辛酸、正癸酸为主要的挥发性酸。澄清处理后酒中酸类含量均有显著降低，降幅达40%以上，相对而言，0.5 μm微滤处理后的酸类降幅最小，而澄清剂和0.2 μm微滤处理后的酸类降幅均已接近50%。
酯类物质是酵母代谢产生的醇与积累的酸发生酯化反应而生成[24]，是青梅酒香气组分中最为重要的种类之一，大多数酯类具有特别的花果香气，对成品青梅酒的风味贡献大[25]。本研究检出的酯类中，含量较高的有辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、肉桂酸乙酯等，其中丁二酸二乙酯占到酯类总含量的54%，为青梅酒中的主要酯类化合物。另外，相对于澄清剂处理，微滤澄清处理对酯类含量的影响较大，损失率达70%，可能会导致成品果酒花果风味一定程度的减弱。这一现象我们在前期研究中亦有发现并报道[9-10]，包括利用不同材料不同孔径的膜对桑葚酒和生酱油的微滤处理，都发现了微滤过程对挥发性组分中的酯类和醇类含量造成较显著的降低。该现象可能与膜的选择性吸附有关，需要进一步的研究来揭示其机理。
3 结论
本研究采用2种不同孔径的陶瓷膜对青梅酒进行微滤澄清，并评估了该工艺对青梅酒品质的影响。研究发现，青梅酒的微滤过程是滤饼过滤主导的，过滤阻力主要为可逆阻力，微滤处理可以除去青梅酒中的残余微生物，并使成品酒获得较高的透明度，同时不会显著影响青梅酒中的有机酸含量。然而，由微滤处理导致青梅酒中挥发性组分的损失不可忽略，尤其是酯类组分的损失，可能会减弱成品酒的花果香风味。最后，0.5 μm陶瓷膜可以较大程度地保留青梅酒的特性，比0.2 μm陶瓷膜更适合于青梅酒的澄清。
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